CN117603848A - 一种产糖原的嗜甲烷菌株及利用该菌株生产糖原的方法 - Google Patents

一种产糖原的嗜甲烷菌株及利用该菌株生产糖原的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产糖原的嗜甲烷菌株及利用该菌株生产糖原的方法，属于工业生物技术领域。产糖原嗜甲烷菌株分类命名为碱球菌(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802，于2023年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28614。将‑4℃保藏的菌株转接到含有1％‑10％甲醇的固体培养基活化，将菌株转接制备种子液，以体积分数为5％‑15％接种量接种于NMS培养液中，于装液量50％‑70％的生物反应器中使用甲烷气体发酵，对发酵菌液处理，最终得到产量达到5g/L以上的白色糖原产品。使用来源广泛的一碳原料(甲烷、甲醇)作为碳源发酵生产具有广泛应用前景的糖原，在实现碳减排的同时，能够避免传统使用糖基原料生产存在的问题，实现糖原的高效生物合成。

Description

一种产糖原的嗜甲烷菌株及利用该菌株生产糖原的方法
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种产糖原的嗜甲烷菌株及利用该菌株生产糖原的方法。
背景技术
甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)等温室气体的大量排放是造成全球温室效应的重要因素，对人类的生存和持续发展构成巨大威胁。在导致全球变暖的温室气体中，CH4排放占比达20％，虽仅次于CO2，但其变暖潜能值远大于CO2，巨大的变暖潜能值使得甲烷减排刻不容缓。
糖原是微生物胞内独特的支链多糖，由α-1,4-糖苷键(直链)和α-1,6-糖苷键(支链)连接而成，在受到外界环境胁迫时会逐渐在胞内积累。其结构与支链淀粉相似，但糖原分支密度接近支链淀粉的2倍，因此结构更加紧密。因其无毒、具有良好的生物降解性和生物相容性，且可以在糖原粒子的表面或内部进行修饰和改造，使得其具有广泛的开发和应用前景。例如可将糖原作为交联剂，制备可用于医药治疗的薄膜、作为靶向药物递送的水凝胶、制备吸附剂材料治理水环境污染、基因治疗中用作纳米载体等(Besford,Q.A.,Cavalieri,F.,Caruso,F.,Glycogen as a Building Block for Advanced BiologicalMaterials.Adv.Mater.2020,32,1904625.)。
嗜甲烷菌是以CH4作为唯一碳源和能源的细菌，被用作将CH4转化为生物基产品的生产平台。利用嗜甲烷菌将非粮原料CH4转化为糖原，不仅可以实现CH4的高效减排，生产的糖原凭借其独特的结构和功能特性也具有广泛市场前景。但目前还未有利用嗜甲烷菌生产糖原的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种产糖原的嗜甲烷菌株及利用该菌株生产糖原的方法，高效转化甲烷生产糖原。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种产糖原的嗜甲烷菌株，分类命名为碱球菌(Alkalicoccusglycogenes)WONF2802，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CGMCC No.28614。
本发明还公开了上述一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，包括以下步骤：
1)将产糖原嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802转接到含有1％-10％甲醇的固体培养基中，28±3℃培养4-6天，得到菌块；
2)将步骤1)得到的菌块接种于含有1％-10％甲醇的种子培养液，于28±3℃震荡培养36-60h，制得种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以体积分数为5-15％接种量接种于NMS培养液中，发酵36-72h，同时在培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷和空气，得到发酵液；
4)将步骤3)得到的发酵液稀释后经离心收集、细胞破壁、蛋白沉淀、离心除杂、乙醇沉淀、乙醇洗涤、离心分离，得固形物，干燥、粉碎，得到白色的糖原。
优选地，步骤1)中，每升固体培养基包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025gCaCl2·6H2O、0.8-2.5g KNO3、1％-10％甲醇、25-55mL碳酸盐溶液、10-25mL磷酸盐溶液、0.5-2mL微量元素溶液和15-20g琼脂粉，余量为水。
优选地，步骤2)中，每升种子培养液包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025gCaCl2·6H2O、2-4g KNO3、1％-10％甲醇、25-55mL碳酸盐溶液、10-25mL磷酸盐溶液和0.5-2mL微量元素溶液，余量为水。
优选地，步骤3)中，每升NMS培养液包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025gCaCl2·6H2O、6-8g KNO3、25-55mL碳酸盐溶液、30-40mL磷酸盐溶液和5-8mL微量元素溶液，余量为水。
优选地，步骤3)中，在装液量为50％-70％的生物反应器中发酵。
优选地，步骤3)中，发酵温度为28±3℃。
优选地，步骤3)中，甲烷的添加量为培养体系中气相体积的15％-25％。
进一步优选地，步骤3)中，甲烷和空气的通气量为0.5-1.5VVM。
优选地，每升碳酸盐溶液包括：50-65g NaHCO3和25-35g NaCO3；每升磷酸盐溶液包括：4-6g KH2PO4和9-12g Na2HPO4；每升微量元素溶液包括：0.5-1g Na2-EDTA·2H2O、1-2gFeSO4·7H2O、0.5-1g ZnSO4·7H2O、0.01-0.05gMnCl2·4H2O、0.01-0.05g H3BO3、0.1-0.4gCoCl2·6H2O、0.5-1g CuCl2·2H2O、0.01-0.04g NiCl2·6H2O和0.01-0.05g Na2MoO4·2H2O。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种产糖原的嗜甲烷菌株，产糖原嗜甲烷菌株(Alkalicoccusglycogenes)WONF2802，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28614，该菌株可高效利用甲烷生长并生产糖原。
本发明提供的一种利用产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，使用来源广泛的非粮一碳原料(CH4、甲醇)作为碳源，通过生物法发酵实现一碳原料的高效利用的同时，生产具有广泛应用前景的高价值糖原。NMS培养液中发酵36-72h，能够保证该方法的糖原产量最高。所用发酵培养基成分明确，组分简单，不含有有机氮源，发酵生产后糖原提取工艺简单，能够大量获得糖原，产量达到5g/L以上，实现糖原的高效生物合成，为糖原生产提供新的路径，适于工业化生产。
保藏说明
本发明对所述的产糖原嗜甲烷菌株进行了下述保藏：
保藏日期：2023年10月18日；
保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏编号：CGMCC No.28614。
附图说明
图1为实施例一产糖原嗜甲烷菌株液体培养液状态图；
图2为实施例二产糖原嗜甲烷菌株生长曲线图；
图3为实施例三制备所得糖原红外图。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下仅就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本文中，若无特别说明，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”或类似用语涵盖了“由……组成”和“主要由……组成”的意思，例如“A包含a”涵盖了“A包含a和其他”和“A仅包含a”的意思。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
本发明提供了一种产糖原的嗜甲烷菌株，分类命名为碱球菌(Alkalicoccusglycogenes)WONF2802，从我国陕西省西安市长安区刘秀村水稻田土壤中筛分获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CGMCC No.28614。
本发明提供了利用上述产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，步骤如下：
1.培养基的配制
每升碳酸盐溶液包括：50-65g NaHCO3和25-35g NaCO3。
每升磷酸盐溶液包括：4-6g KH2PO4和9-12g Na2HPO4。
每升微量元素溶液包括：0.5-1g Na2-EDTA·2H2O、1-2g FeSO4·7H2O、0.5-1gZnSO4·7H2O、0.01-0.05g MnCl2·4H2O、0.01-0.05g H3BO3、0.1-0.4gCoCl2·6H2O、0.5-1gCuCl2·2H2O、0.01-0.04g NiCl2·6H2O和0.01-0.05gNa2MoO4·2H2O。
固体培养基的配方如下：每升固体培养基包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025g CaCl2·6H2O、0.8-2.5g KNO3、1％-10％甲醇、25-55mL碳酸盐溶液、10-25mL磷酸盐溶液、0.5-2mL微量元素溶液和15-20g琼脂粉，余量为水。将各成分混合后在121℃灭菌20min，得到固体培养基。
种子培养液的配方如下：每升培养基包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025gCaCl2·6H2O、2-4g KNO3、1％-10％甲醇、25-55mL碳酸盐溶液、10-25mL磷酸盐溶液和0.5-2mL微量元素溶液，余量为水。将各成分混合后在121℃灭菌20min，得到种子培养液。
NMS培养液的配方如下：每升培养基包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025gCaCl2·6H2O、6-8g KNO3、25-55mL碳酸盐溶液、30-40mL磷酸盐溶液和5-8mL微量元素溶液，余量为水。将各成分混合后在121℃灭菌20min，得到NMS培养液。
2.菌种活化
将-4℃保藏的产糖原嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802转接到含有1％-10％甲醇的固体培养基，28±3℃培养4-6天，得到菌块。
3.种子培养
选取纯培养的平板，使用无菌接种环，将菌块接种于含有1％-10％甲醇的种子培养液中，于28±3℃，转速200±30rpm条件下培养36-60h，制得种子液。
4.发酵培养
将步骤3制得的种子液以体积分数为5-15％接种量接种于NMS培养液，于装液量50％-70％的生物反应器中发酵，培养初始及过程中向培养体系内以0.5-1.5VVM的通气量补充甲烷和空气，甲烷的添加量为培养体系气相体积的15％-25％，发酵温度28±3℃，发酵72-120h，得到发酵液。
5.发酵液后处理
发酵液稀释后经离心收集、细胞破壁、蛋白沉淀、离心除杂、乙醇沉淀、乙醇洗涤、离心脱除有机溶剂得固形物，固形物经干燥和粉碎后，即可得到白色的糖原产品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中使用本领域常规的仪器设备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中使用各种原料，除非另作说明，都使用常规市售产品，其规格为本领域常规规格。在本发明的说明书以及下述实施例中，如没有特别说明，“％”都表示重量百分比，“份”都表示重量份，比例都表示重量比。
实施例一：
产糖原嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802的获得：
(1)样品采集：土样采集于陕西省西安市长安区刘秀村水稻田土壤，将土样装于无菌塑料袋中，置于冰盒中低温运输至实验室，在4℃冰箱中低温保存备用；
(2)菌株筛分：称取土样10g，加入到带玻璃珠的装有100mL无菌超纯水的锥形烧瓶中，30℃摇床震荡30min，静置10min，得到土样浸出液；取1mL土样浸出液上清加入到装有50mL无机盐培养液的250mL注射瓶中，橡胶塞封口。其中，每升无机盐培养液中含有：MgSO4·7H2O 0.5g、0.005g CaCl2·6H2O、0.8g KNO3，0.7g NaCl，余量为水，使用前于121℃灭菌20min。使用50mL注射器向注射瓶中注入50mL CH4。随后将注射瓶置于恒温摇床中在200r/min，30℃条件下富集培养，直至注射瓶中培养液出现粉红色浑浊。选取出现粉红色浑浊较快且浑浊度较高的样品组用于目的菌株的筛选；
(3)纯化培养：以重复富集3次后获得的粉红色富集培养液为材料，采用平板划线的方法将富集培养液接种于含1％甲醇的无机盐固体培养基上培养5-10天，其中无机盐固体培养基为步骤(2)中所述的液体培养基中加入1.5％的琼脂制备获得，挑取平板上的粉红色的单菌落接种于新的无机盐固体培养基中培养，重复3次，获得的纯化的菌株即为嗜甲烷菌，采用NMS培养基初步发酵糖原产量为2.7g/L。
(4)菌株鉴定：该菌株在平板上生长时，菌落初期为白色光滑圆点状，后期颜色逐渐转为淡乳白色，无褶皱，菌落湿润，显微镜观察菌体呈圆球状。液体培养时前期培养液呈乳白色，96h后培养液变粉色，如图1所示。通过形态学染色、运动性、生理生化鉴定等实验与16s rDNA鉴定实验，确定该菌属于Alkalicoccus属细菌，命名为WONF2802，拉丁名称为碱球菌(Alkalicoccus glycogenes)，于2023年10月18日保藏于中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.28614。
实施例二：
(1)将55g NaHCO3和30g NaCO3混合，补充水至1升，混匀，得到碳酸盐溶液。将4gKH2PO4和9g Na2HPO4混合，补充水至1升，混匀，得到磷酸盐溶液。将0.5g Na2-EDTA·2H2O、1gFeSO4·7H2O、0.5g ZnSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g H3BO3、0.1g CoCl2·6H2O、0.5gCuCl2·2H2O、0.01gNiCl2·6H2O和0.01g Na2MoO4·2H2O混合，补充水至1升，混匀，得到微量元素溶液。
(2)将0.9g MgSO4·7H2O、0.008g CaCl2·6H2O、1.2g KNO3、2％甲醇、40mL碳酸盐溶液、15mL磷酸盐溶液、2mL微量元素溶液和15g琼脂粉混合，补充水至1升，混匀，121℃灭菌20min，得到含有2％甲醇的固体培养基。
(3)将-4℃保藏的产糖原的嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802转接到步骤(2)得到的固体培养基中，30℃静置培养4天，得到菌块。
(4)将0.9g MgSO4·7H2O、0.008g CaCl2·6H2O、2.2g KNO3、2％甲醇、40mL碳酸盐溶液、15mL磷酸盐溶液和2mL微量元素溶液混合，补充水至1升，混匀，121℃灭菌20min，得到种子培养液。
(5)选取纯培养的平板，使用无菌接种环，将步骤(3)得到的菌块接种于步骤(4)得到的种子培养液中，在温度30℃，转速200rpm的条件下培养48h，制得种子液。
(6)将0.9g MgSO4·7H2O、0.008g CaCl2·6H2O、6g KNO3、40mL碳酸盐溶液、30mL磷酸盐溶液、5mL微量元素溶液混合，补充水至1升，混匀，121℃灭菌20min，得到NMS培养液。
(7)将步骤(5)制得的种子液以10％(V/V)接种量接种于步骤(6)制得的NMS培养液中，于2L装液量的3L生物反应器中进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中通入CH4和空气，通气量为1.2VVM，CH4的流量为480sccm，空气的流量为1920sccm。
使用可见光分光光度计，在波长600nm处测定菌液的吸光度，绘制产糖原嗜甲烷菌株的生长曲线，结果如图2所示，可看出该产糖原的嗜甲烷菌株在第54小时OD600达到56.1。
实施例三：
(1)将65g NaHCO3和35g NaCO3混合，补充水至1升，混匀，得到碳酸盐溶液。将6gKH2PO4和12g Na2HPO4混合，补充水至1升，混匀，得到磷酸盐溶液。将1g Na2-EDTA·2H2O、2gFeSO4·7H2O、1g ZnSO4·7H2O、0.05gMnCl2·4H2O、0.05g H3BO3、0.4g CoCl2·6H2O、1gCuCl2·2H2O、0.04gNiCl2·6H2O和0.05g Na2MoO4·2H2O混合，补充水至1升，混匀，得到微量元素溶液。
(2)将0.9g MgSO4·7H2O、0.008g CaCl2·6H2O、1.2g KNO3、2％甲醇、40mL碳酸盐溶液、15mL磷酸盐溶液、2mL微量元素溶液和15g琼脂粉混合，补充水至1升，混匀，121℃灭菌20min，得到含有2％甲醇的固体培养基。
(3)将-4℃保藏的产糖的原嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802转接到步骤(2)得到的固体培养基中，30℃静置培养4天，得到菌块。
(4)将0.9g MgSO4·7H2O、0.008g CaCl2·6H2O、2.2g KNO3、2％甲醇、40mL碳酸盐溶液、15mL磷酸盐溶液和2mL微量元素溶液混合，补充水至1升，混匀，121℃灭菌20min，得到种子培养液。
(5)选取纯培养的平板，使用无菌接种环，将步骤(3)得到的菌块接种于步骤(4)得到的种子培养液中，在温度30℃，转速200rpm条件下培养48h，制得种子液。
(6)将0.9g MgSO4·7H2O、0.008g CaCl2·6H2O、8g KNO3、55mL碳酸盐溶液、40mL磷酸盐溶液和8mL微量元素溶液混合，补充水至1升，混匀，121℃灭菌20min，得到NMS培养液。
(7)将步骤(5)制得的种子液以10％(V/V)接种量接种于步骤(6)制得的NMS培养液中，于2L装液量的3L生物反应器中发酵96h，发酵温度30℃，发酵过程中通入CH4和空气，通气量为1.2VVM，CH4的流量为480sccm，空气的流量为1920sccm。
(8)发酵结束后收集菌液。8000rpm，室温离心10分钟，收集沉淀，按照1:(20-30)的比例加入30％ KOH溶液，95°水浴3小时，加入等体积10％ TCA溶液，静置5小时。离心收集上清液后加入1.5倍体积的95％无水乙醇，沉淀5小时，离心分离后洗涤沉淀，离心脱除溶剂得固形物，固形物经干燥和粉碎后，即可得到白色的糖原产品。
(9)对糖原进行红外光谱检测，结果如图3所示，结果显示产糖原嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802发酵生产糖原产量能够达到5g/L以上，说明该方法能够获得大量糖原。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种产糖原的嗜甲烷菌株，其特征在于，分类命名为碱球菌(Alkalicoccusglycogenes)WONF2802，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CGMCC No.28614。
2.利用权利要求1所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将产糖原嗜甲烷菌株(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802转接到含有1％-10％甲醇的固体培养基中，28±3℃培养4-6天，得到菌块；
2)将步骤1)得到的菌块接种于含有1％-10％甲醇的种子培养液，于28±3℃震荡培养36-60h，制得种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以体积分数为5-15％接种量接种于NMS培养液中，发酵36-72h，同时在培养初始及过程中向培养体系内补充甲烷和空气，得到发酵液；
4)将步骤3)得到的发酵液稀释后经离心收集、细胞破壁、蛋白沉淀、离心除杂、乙醇沉淀、乙醇洗涤、离心分离，得固形物，干燥、粉碎，得到白色的糖原。
3.根据权利要求2所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤1)中，每升固体培养基包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025g CaCl2·6H2O、0.8-2.5gKNO3、1％-10％甲醇、25-55mL碳酸盐溶液、10-25mL磷酸盐溶液、0.5-2mL微量元素溶液和15-20g琼脂粉，余量为水。
4.根据权利要求2所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤2)中，每升种子培养液包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025g CaCl2·6H2O、2-4gKNO3、1％-10％甲醇、25-55mL碳酸盐溶液、10-25mL磷酸盐溶液和0.5-2mL微量元素溶液，余量为水。
5.根据权利要求2所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤3)中，每升NMS培养液包括：0.9-1.2g MgSO4·7H2O、0.005-0.025g CaCl2·6H2O、6-8g KNO3、25-55mL碳酸盐溶液、30-40mL磷酸盐溶液和5-8mL微量元素溶液，余量为水。
6.根据权利要求2所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤3)中，在装液量为50％-70％的生物反应器中发酵。
7.根据权利要求2所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤3)中，发酵温度为28±3℃。
8.根据权利要求2所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤3)中，甲烷的添加量为培养体系中气相体积的15％-25％。
9.根据权利要求8所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，步骤3)中，甲烷和空气的通气量为0.5-1.5VVM。
10.根据权利要求3～5任意一项所述的一种产糖原的嗜甲烷菌株生产糖原的方法，其特征在于，每升碳酸盐溶液包括：50-65g NaHCO3和25-35g NaCO3；每升磷酸盐溶液包括：4-6g KH2PO4和9-12g Na2HPO4；每升微量元素溶液包括：0.5-1g Na2-EDTA·2H2O、1-2gFeSO4·7H2O、0.5-1g ZnSO4·7H2O、0.01-0.05g MnCl2·4H2O、0.01-0.05g H3BO3、0.1-0.4gCoCl2·6H2O、0.5-1g CuCl2·2H2O、0.01-0.04g NiCl2·6H2O和0.01-0.05g Na2MoO4·2H2O。
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