CN111484966A - 一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，该方法包括将活性污泥打碎，接入富集培养基中，在pH值为6.8～7.2条件下，当检测培养体系有气体产生时，通过控温系统采用阶梯循环锯齿式变温驯化培养产甲烷菌，当检测不到气泡时停止变温并进行补料，以至产气量稳定，完成耐低温产甲烷菌的富集培养。通过采用本发明的富集培养方法驯化的耐低温产甲烷菌，不仅耐冲击性强、生物强化作用稳定性高，而且更符合实际环境条件下应用，适于市面推广。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，更具体的说是涉及一种耐低温产甲烷菌的富集培养方法。
背景技术
污水的生物处理主要包含好氧生物处理、厌氧生物处理和生物膜法三大方法。其中，厌氧污水处理因其低能耗、低污泥产量以及较高的可生化性受到了人们的关注。厌氧生物处理技术具有较低的建设和运行成本，同时，在处理过程中可回收清洁能源——沼气，是一种可持续的生物处理技术。现有的厌氧生物处理工艺大多要求中温或高温的范围内进行，通常要对废水和废物进行加热，这种做法消耗能源、削弱了厌氧生物处理的优越性。因此，开展低温下高效厌氧生物处理技术的研究，对于拓展厌氧污水处理技术的应用范围，降低废水、废物的处理成本具有十分重要的意义。
很多研究结果表明，温度的降低会导致厌氧工艺启动时间显著延长，处理负荷和处理效率大幅降低，造成这种不良后果的重要原因之一是现有低温厌氧处理工艺没有找到合适的微生物接种物。嗜温厌氧生物，尤其是嗜温厌氧产甲烷菌在低温条件下活性显著降低，会导致整个厌氧微生物种群之间的平衡关系遭到不可逆转的破坏。因此，获得耐低温产甲烷菌是从根本上解决低温厌氧工艺问题的关键步骤。
获得耐低温产甲烷菌剂的方法主要有人为组合几种微生物制成复合微生物制剂、纯培养的单一生物制剂以及驯化富集培养生物强化菌剂。人为制成的生物制剂作为外源投加的菌种很难适应厌氧发酵系统中的复杂环境条件，而单一类型的生物制剂很难抵抗内源微生物的竞争并长期地保持生物持有量以及发挥强化作用。因此，为获得生物活性稳定且耐低温的生物强化菌剂，有必要找到一种有效富集驯化菌剂的方法。
申请号为CN201610195294.7的专利文献公开了一种耐低温产甲烷菌富集培养方式。该方式虽然解决了现有低温产甲烷菌剂制备步骤繁琐、低温驯化时间长的问题，但使用的逐渐降低温度的方法极易使产甲烷菌产生冷休克反应。且实际厌氧污水处理是一个持续变温过程，这就导致该富集方法培养的耐低温产甲烷菌群在实际应用中不能维持最高活性，甚至会有失活现象的出现。
针对此问题，申请号为CN201410812503.9的专利文献提供了一种采用锯齿式升降变化控温和恒温补料的方法，克服了嗜冷产甲烷菌在温度变化中出现冷休克反应的问题。但该驯化培养方式是直接采用低温进行产甲烷菌驯化，并不断进行继代培养，导致接种活性污泥取材温度范围窄，必须选择在8℃下有产甲烷能力的污泥才可用于该驯化方法，且继代培养操作繁琐。
特别的，现有耐低温甲烷菌的驯化富集方法都采用的是单程变温设计，获得的产甲烷菌存在耐冲击性差、生物强化作用稳定性较低、对厌氧生物处理系统中的复杂温度变化适应性差的问题。
因此，如何提供一种耐冲击性强、生物强化作用稳定性高且更符合实际环境条件应用的耐低温甲烷菌群是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，关键在于通过阶梯循环锯齿式变温方法控温驯化耐低温产甲烷菌，通过本发明得到的耐低温产甲烷菌耐冲击性强、生物强化作用稳定性高，而且更符合实际环境条件下应用，适于市面推广。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，包括将活性污泥打碎，接入富集培养基中，在pH值为6.8～7.2条件下，当检测培养体系有气体产生时，通过控温系统进行变温培养，当检测不到气泡时停止变温并进行补料，至产气量稳定，完成耐低温产甲烷菌的富集培养，其特征是，所述变温过程采用阶梯循环锯齿式变温方法。
优选的，在上述一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法中，所述活性污泥为自然湿地污泥、污水处理厂活性污泥或沼气发酵池沼液沼渣混合物。
优选的，在上述一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法中，所述培养基为乙酸类衍生物、K2HPO4、KH2PO4与Fe、Co、Ni、Mo组成的混合物；其中所述乙酸类衍生物包括乙酸或乙酸盐，且所述乙酸类衍生物的物质的量浓度为100～150mol/mL，所述K2HPO4的质量浓度为0.5g/L，所述KH2PO4的质量浓度为0.4g/L，所述金属Fe的物质的量浓度为20～100μmol/L，所述金属Mo的物质的量浓度为2μmol/L。
优选的，在上述一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法中，所述阶梯循环锯齿式变温方法包括至少一个循环周期，且所述循环周期内的最大温差≤10℃。
最优选的，所述的阶梯循环锯齿式变温方法的温度设定，具体包括如下：
将一至四个循环周期的温度设定为：
第一循环周期培养温度从25℃下降至15℃，再升温至20℃；
第二循环周期培养温度从20℃下降至12℃，再升温至15℃；
第三循环周期培养温度从15℃下降至10℃，再升温至12℃；
第四循环周期培养温度从12℃下降至8℃，恒温培养。
优选的，上述任一阶梯循环锯齿式变温方法的控温方式为：在一个小时内缓慢变温0.2℃，到达变温数据后迅速反向变温0.1℃并恒温1小时，如此反复循环，直至达到设定温度。
优选的，在上述一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法中，所述补料包括甘氨酸、脯氨酸、精氨酸各0.1～0.5g/L，葡萄糖0.1～0.5g/L，蛋白胨1.5～2.0g/L中的一种或多种组成的混合物。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种采用变温驯化培养耐低温产甲烷菌的方式，主要采取了阶梯循环锯齿式变温方式富集培养耐低温产甲烷菌，其具有如下所述优异特性：。
首先，由于耐低温产甲烷菌主要是乙酸营养型，其与中温或者高温产甲烷菌是甲基营养型、H2/CO2营养型不同，因而本发明选用乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质。同时，为了避免乙酸或乙酸盐导致的体系pH值变化，本发明选择磷酸盐作为基底缓冲液，并为产甲烷菌提供P、K元素；
其次，由于耐低温产甲烷菌是通过产生冷活性酶来调节它们的代谢活动，并以此来适应低温环境，因此本发明通过采用锯齿式变温方式，既保证冷活性酶的活性又可以持续性的提高稳定性，以避免冷休克反应的出现；同时甘氨酸、脯氨酸和精氨酸可以协同作用可以提高冷活性酶的活性，为耐低温产甲烷菌提供代谢用的营养物质；而阶梯式循环变温则提高了甲烷菌群的耐冲击性和生物强化作用的稳定性，更符合实际厌氧污水处理时持续变温的环境条件；
最后，本发明采用阶梯循环锯齿式变温方式富集培养耐低温甲烷菌，操作开放，条件易控，菌剂为菌群环境无需无菌环境。且接种产甲烷活性污泥取材方便，温度范围广，只要具有一定产甲烷能力的污泥便可用于本发明耐低温产甲烷菌的富集培养。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种耐冲击性强、生物强化作用稳定性高且符合实际环境条件下应用的耐低温产甲烷菌富集培养的方法。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，包括将活性污泥打碎，接入富集培养基中，在pH值为6.8～7.2条件下，当检测培养体系有气体产生时，通过控温系统进行变温培养，当检测不到气泡时停止变温并进行补料，至产气量稳定，以完成耐低温产甲烷菌的富集培养；其中所述变温过程采用阶梯循环锯齿式变温方法。
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1：
本实施方法的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，它是按照以下步骤进行的：
S1：配制驯化培养基：富集培养基包括120mol/mL的乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质、0.5g/L的K2HPO4和0.4g/L的KH2PO4和60μmol/L的Fe和2μmol/L的Co、Ni、Mo作为基底缓冲液，并用酸碱调节溶液调节培养基pH至7.1；
S2：取活性污泥并打碎，采用50目的筛网进行筛分，采集筛下物为种泥，将种泥置于厌氧瓶内，充氮去氧后25℃恒温震荡培养2h；
S3：将活性污泥接入富集培养基中，并在25℃条件下进行培养；
S4：阶梯循环锯齿式变温驯化产甲烷菌群：
(1)当检测培养体系有气体产生时，通过控温系统改变温度，进行变温驯化培养，随着温度变化，气体体积不断增加，具体方式为：
①锯齿式变温：在一个小时内缓慢变温0.2℃，到达变温数据后迅速反向变温0.1℃并恒温1小时，如此反复循环，直至达到设定温度；
②阶梯式循环温度条件的设定：第一循环周期培养温度从25℃下降至15℃，再升温至20℃；第二循环周期培养温度从20℃下降至12℃，再升温至15℃；第三循环周期培养温度从15℃下降至10℃，再升温至12℃；第四循环周期培养温度从12℃下降至8℃，恒温10天。
(2)当检测到气体不再产生时，停止变温并进行补料，补料包括甘氨酸、脯氨酸、精氨酸各0.1g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨2.0g/L的，补料后气体继续产生，至气体产量平稳；
S5：菌落富集：在气体产量平稳后，继续集气15天，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为50％。
实施例2：
本实施方式与实施例1不同的是：所述富集培养基包括110mol/mL的乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质、0.5g/L的K2HPO4和0.4g/L的KH2PO4和40μmol/L的Fe和2μmol/L的Co、Ni、Mo作为基底缓冲液，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为52％。
实施例3：
本实施方式与实施例1不同的是：所述富集培养基包括130mol/mL的乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质、0.5g/L的K2HPO4和0.4g/L的KH2PO4和60μmol/L的Fe和2μmol/L的Co、Ni、Mo作为基底缓冲液，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为52％。
实施例4：
本实施方式与实施例1不同的是：所述富集培养基包括140mol/mL的乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质、0.5g/L的K2HPO4和0.4g/L的KH2PO4和100μmol/L的Fe和2μmol/L的Co、Ni、Mo作为基底缓冲液，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为52％。
实施例5
本实施方式与实施例1不同的是：所述富集培养基包括150mol/mL的乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质、0.5g/L的K2HPO4和0.4g/L的KH2PO4和100μmol/L的Fe和2μmol/L的Co、Ni、Mo作为基底缓冲液，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为52％。
实施例6：
本实施方式与实施例1不同的是：用酸碱调节溶液调节培养基pH至6.9，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为53％。
实施例7：
本实施方式与实施例1不同的是：用酸碱调节溶液调节培养基pH至7.0其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为52.8％。
实施例8：
本实施方式与实施例1不同的是：用酸碱调节溶液调节培养基pH至7.1，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为53.5％。
实施例9：
本实施方式与实施例1不同的是：用酸碱调节溶液调节培养基pH至7.2，其与参数不变，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为55％。
为了进一步优化上述技术方案，活性污泥包括自然湿地污泥、污水处理厂活性污泥或沼气发酵池沼液沼渣混合物。
为了进一步优化上述技术方案，所述阶梯循环锯齿式变温方法包括至少一个循环周期，且所述循环周期内的最大温差≤10℃。
为了进一步优化上述技术方案，所述补料包括甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、葡萄糖、蛋白胨中的一种或多种组成的混合物。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，其中一个或几个实施例的组合同样也可以实现本发明目的。
通过以下实验验证本发明的有益效果：
实验1：
S1：配制驯化培养基：富集培养基包括120mol/mL的乙酸或乙酸盐作为产甲烷基质、0.5g/L的K2HPO4和0.4g/L的KH2PO4和80μmol/L的Fe和2μmol/L的Co、Ni、Mo作为基底缓冲液，并用酸碱调节溶液调节培养基pH至6.8；
S2：取活性污泥并打碎，采用50目的筛网进行筛分，采集筛下物为种泥，将种泥置于厌氧瓶内，充氮去氧后25℃恒温震荡培养2h；
S3：将活性污泥接入富集培养基中，并在25℃条件下进行培养；
S4：阶梯循环锯齿式变温驯化产甲烷菌群：
(1)当检测培养体系有气体产生时，通过控温系统改变温度，进行变温驯化培养，随着温度变化，气体体积不断增加，具体方式为：
①锯齿式变温：在一个小时内缓慢变温0.2℃，到达变温数据后迅速反向变温0.1℃并恒温1小时，如此反复循环，直至达到设定温度；
②阶梯式循环温度条件的设定：第一循环周期培养温度从25℃下降至15℃，再升温至20℃；第二循环周期培养温度从20℃下降至12℃，再升温至15℃；第三循环周期培养温度从15℃下降至10℃，再升温至12℃；第四循环周期培养温度从12℃下降至8℃，恒温10天。
(2)当检测到气体不再产生时，停止变温并进行补料，补料包括甘氨酸、脯氨酸、精氨酸各0.1g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨2.0g/L的，补料后气体继续产生，至气体产量平稳；
S5：菌落富集：在气体产量平稳后，继续集气15天，获得富集的耐低温产甲烷菌群，收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为48％。
对比实验1：
本对比实验与实验1不同的是S4采用单程锯齿式缓慢降温法驯化产甲烷菌，具体方式为：培养基25℃恒温，当检测培养体系有气体产生时，在一个小时内缓慢降温0.2℃，到达变温数据后迅速升温0.1℃并恒温1小时，如此反复循环，直至达到12℃，检测到气体产生量不再增加。补料，至气体产量平稳后继续集气15天，获得富集的耐低温产甲烷菌群。收集气体并进行气相色谱检测，甲烷含量为33％。
实验2：
将实验1和对比实验1获得的耐低温产甲烷菌群接入模拟污水厌氧处理器中，分别作为实验组和对照组以模拟污水处理实际过程。在持续8～15℃循环变温的条件下，将上述富集物加入等量的污水处理厂污泥，发酵料液TS为8％，接种量为10％，厌氧消化反应15天，收集气体并进行气相色谱检测，实验组的甲烷含量为45％，对照组的甲烷含量为27％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，包括将活性污泥打碎，接入富集培养基中，在pH值为6.8～7.2条件下，当检测培养体系有气体产生时，通过控温系统进行变温培养，当检测不到气泡时停止变温并进行补料，至产气量稳定，以完成耐低温产甲烷菌的富集培养；其中所述变温过程采用阶梯循环锯齿式变温方法。
2.根据权利要求1所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述活性污泥包括自然湿地污泥、污水处理厂活性污泥或沼气发酵池沼液沼渣混合物。
3.根据权利要求1所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述培养基为乙酸类衍生物、K2HPO4、KH2PO4与Fe、Co、Ni、Mo组成的混合物；其中所述乙酸类衍生物包括乙酸或乙酸盐，且所述乙酸类衍生物的物质的量浓度为100～150mol/mL，所述K2HPO4的质量浓度为0.5g/L，所述KH2PO4的质量浓度为0.4g/L，所述金属Fe的物质的量浓度为20～100μmol/L，所述金属Mo的物质的量浓度为2μmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述阶梯循环锯齿式变温方法包括至少一个循环周期，且所述循环周期内的最大温差≤10℃。
5.根据权利要求4所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述阶梯循环锯齿式变温方法的温度设定，具体包括如下：
将一至四个循环周期的温度设定为：
第一循环周期培养温度从25℃下降至15℃，再升温至20℃；
第二循环周期培养温度从20℃下降至12℃，再升温至15℃；
第三循环周期培养温度从15℃下降至10℃，再升温至12℃；
第四循环周期培养温度从12℃下降至8℃，恒温培养。
6.根据权利要求4～5任一所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述控温方式为：在一个小时内缓慢变温0.2℃，到达变温数据后迅速反向变温0.1℃并恒温1小时，如此反复循环，直至达到设定温度。
7.根据权利要求1～3任一所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述补料包括甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、葡萄糖、蛋白胨中的一种或多种组成的混合物。
8.根据权利要求7所述的一种耐低温产甲烷菌富集培养的方法，其特征在于，所述甘氨酸、所述脯氨酸与所述精氨酸的浓度为0.1～0.5g/L，所述葡萄糖的浓度为0.1～0.5g/L，所述蛋白胨的浓度为1.5～2.0g/L。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114045235A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-15 | 西安交通大学 | 一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法 |
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