CN101508960A - 一株根霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株根霉菌株Rhizopus sp.B1219，其保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NO：M 209007；本发明还涉及根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。本发明的根霉Rhizopus sp.B1219来源于生产黄酒的酒药，对温度、pH等自然环境的适应范围较广，容易培养和保存，抑制食品腐败菌的能力强，保证了使用的安全性。

Description

一株根霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一株根霉Rhizopus sp.B1219菌株及其发酵生产苯基乳酸中的应用。
背景技术
β-苯基乳酸，又称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸(Phenyllactic acid，简称PLA)，相对分子质量为166，熔点121～125℃，无气味，对酸、热稳定，在121℃加热也不被破坏，天然存在于蜂蜜中，对人或动物细胞无毒。PLA的第二个碳原子为手性碳原子，因此有两种对映异构体R-(+)-3-苯基乳酸(D-(+)-3-苯基乳酸)，和S-(-)-3-苯基乳酸(L-(-)-3-苯基乳酸)。PLA是一种新型的抑菌物质，有较广的抑菌谱，其抑菌特性已受到研究者的广泛关注。特别是它能抑制真菌的污染可延长食品的货架期，而且它又一种可生物合成的天然化合物，有望作为新型天然防腐剂应用于食品工业或其他领域中。R-3-苯基乳酸和S-3-苯基乳酸均有抑菌效果，在较低浓度下就可有效抑制大部分食品腐败菌，其抑菌效果要显著优于一些常用食品防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾等合成防腐剂。
现有技术中生产PLA的方法主要有化学法和生物合成法。化学方法存在的问题是产物的光学纯度不够高，操作复杂、污染环境严重、产品成本高以及产品质量难以控制等。由于PLA主要应用于食品和医药领域，在消费者崇尚天然、营养食品的今天，世界各国的研究者把研究的重点转移到了生物合成法方面。
生物合成法即通过完整的微生物细胞的立体选择性生物催化来实现PLA的生产，因此筛选高立体选择性的优良工业微生物菌株是此方法的关键点。早在1986年，Kamata等就用乳糖发酵短杆菌Brevibacterium Lactofermentum发酵生产了R-3-苯基乳酸，产量为1.94g/L，并且申请了专利；1998年，Dieuleveux等从白地霉Geotrichum Candidum的培养液中也分离到了R-3-苯基乳酸，该菌株在TSBYE培养基中发酵产生R-3-苯基乳酸的量为0.6g/L～1g/L；2000年，Lavermicocca等发现从发酵面团中分离到的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 21B能分泌R-3-苯基乳酸，他们将植物乳杆菌接种在小麦粉水解液中，30℃培养发酵24h，产生的R-3-苯基乳酸量为0.009mol/L；2002年，Katrin等从青贮草中也分离到了一株L.plantarum MiLAB 393，它产生的S型和R型3-苯基乳酸的比例为9:1；1996年，Hashimoto等从土壤中筛选到了一株假单胞菌Pseudomonas sp.BC218，该菌株能将苯乙醛-氰醇转化为S-3-苯基乳酸，这一转化有较高的对映选择性，生成的S-3-苯基乳酸的e.e.值为75％，再经过优先结晶操作，其e.e.值更可达到99％，经该菌株经诱变后，S-3-苯基乳酸的产量是出发菌株的12倍；Diversa公司用腈酶(EC3.5.5.1)(Nitrilases)可以制备e.e.值为99％的S-3-苯基乳酸；近来，Thierry等发现费氏杆菌Propionibacteriun freudenreichii在奶酪发酵过程中产生了3-苯基乳酸，这些3-苯基乳酸是由苯基丙酮酸在羟基还原酶作用下得到的。目前3-苯基乳酸已在Diversa公司进行了工业化生产。
发明内容
本发明的技术目的是提供一支具有高产苯基乳酸能力的微生物菌株，使得该菌株相对于现有技术的产苯基乳酸微生物而言具有培养容易、产率高的优势。
为实现上述技术目的，本发明通过以下技术方案实现：
一、本发明从生产黄酒的酒药中分离筛选、纯化得到一株根霉菌株，其分类命名为根霉Rhizopus sp.B1219，保藏登记号为CCTCC NO：M209007。
(一)根霉Rhizopus sp.B1219的筛选纯化方法：
1、出发菌株的选育：
准确称取生产黄酒的酒药制备成酒药稀释液后，置于无菌PDA固体平板培养基上28℃保温培养3～5天，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入PDA固体平板培养基上，恒温培养、纯化直至得到单菌落，转移至斜面试管保藏，用作出发菌株备用；
2、高产苯基乳酸能力菌株的筛选：
用接种环分别取少量各株出发菌株的真菌孢子接种在PDA液体培养基中，摇床培养72～120小时后离心获得真菌菌丝体，并将菌丝体加入到苯基丙酮酸底物转化液中，35℃下转化反应12～48h，得到转化后的样品液；
在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基，将用出发菌株制得的孢子悬液接种于PDA平板培养基上，均匀涂布后在平板上4只牛津小杯，使各杯之间间距相等，用无菌洁净移液管滴加上述转化后的样品液后28℃培养3～5天，室温下观察结果发现，在牛津杯的周围有一株真菌产生明显的抑菌圈，因此将这一株真菌命名为根霉Rhizopussp.B1219。
(二)根霉Rhizopus sp.B1219的形态特征：
将根霉Rhizopus sp.B1219菌株接种在马铃薯固体琼脂平板上，28℃培养3天，菌落直径达9cm，菌落初期为白色，菌丝絮状，无色，向四周蔓延，并逐渐成淡黄色。菌落背面无色，不分泌色素。普通显微镜下孢子囊呈球形或近球形，直径34.5～57μm，初为黄白色，然后逐渐变成褐色；孢子囊孢子卵圆形或球形，无色，直径5.0～12.5μm；孢子囊梗壁光滑，无色，宽8.5～12μm；有假根和匍匐枝。
二、本发明所述的根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。
具体的应用方法为：
(一)根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体的制备
将根霉Rhizopus sp.B1219接种至PDA液体培养基进行发酵，培养条件为28℃，培养72～120小时后离心获得根霉菌丝体；
(二)根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体发酵生产苯基乳酸
将所获得的根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体转接到含有苯基丙酮酸的底物转化液中，35℃下转化反应12～48h得到苯基乳酸粗品。
本发明的有益效果在于：
本发明的根霉Rhizopus sp.B1219菌株来源于生产黄酒的酒药，因此其对温度、pH等自然环境的适应范围较广；根霉Rhizopus sp.B1219在PDA培养基和查氏培养基上生长良好，容易培养和保存，通过发酵所得的苯基乳酸含量为0.55g/L；根霉Rhizopussp.B1219抑制污染食品的能力强；根霉Rhizopus sp.B1219达到食品级的要求，保证了使用的安全性。
附图说明
图1根霉Rhizopus sp.B1219的菌丝照片。
本发明的微生物根霉Rhizopus sp.B1219的保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NO：M209007。
具体实施方式：
实施例1
本实施例说明根霉Rhizopus sp.B1219的筛选纯化方法：
PDA固体平板培养基配方：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，pH自然。
PDA液体培养基配方：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，蒸馏水1L，pH自然。
1、出发菌株的选育：
准确称取生产黄酒的酒药(取自常熟王四酒家黄酒厂)25g，在无菌条件下，将酒药加入盛有225mL无菌水的三角瓶中，震荡30min，吸取1mL酒药稀释液进一步梯度稀释，吸取不同梯度的酒药稀释液1mL置于已凝固的无菌PDA平板培养基上，用无菌涂布棒把各梯度浓度的稀释液分别均匀地涂布在整个平板表面，28℃保温培养3～5天，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入PDA固体平板培养基上，恒温培养、纯化直至得到单菌落后，转移至斜面试管作为出发菌株保藏。
2、高产苯基乳酸能力菌株的筛选：
用接种环分别取出发菌株的少量真菌孢子接在PDA液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养3～5天，离心获得真菌菌丝体。将所获得的菌丝体加入到含有苯基丙酮酸(纯度37％)1.5g，葡萄糖3.42g，蒸馏水300mL，pH7.9的转化液中，35℃下转化反应12～48h，得到转化后的样品液。
在无菌培养皿中倒入PDA固体平板培养基，将从豆奶和面包上分离到的霉菌制成孢子悬液，取0.1mL接种于PDA固体平板培养基上，用涂布棒均匀地涂布。然后在固体平板上轻轻的放置4至牛津小杯，其间距相等，用无菌洁净移液管滴加上述样品液，加液量与杯口水平为准，28℃培养3～5天，室温下观察结果，在牛津杯的周围有一株真菌产生明显的抑菌圈，因此将这一株真菌命名为根霉Rhizopus sp.B1219。
3、根霉Rhizopus sp.B1219的形态特征：
将根霉Rhizopus sp.B1219菌株接种在PDA固体平板培养基上，28℃培养3天，菌落直径达9cm，菌落初期为白色，菌丝絮状，无色，向四周蔓延，并逐渐成淡黄色。菌落背面无色，不分泌色素。普通显微镜下孢子囊呈球形或近球形，直径34.5～57μm，初为黄白色，然后逐渐变成褐色；孢子囊孢子卵圆形或球形，无色，直径5.0～12.5μm；孢子囊梗壁光滑，无色，宽8.5～12μm；有假根和匍匐枝。
实施例2
本实施例说明根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。
1、根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体的制备
将上述的根霉孢子接种在300mLPDA液体培养基中，28℃，200r/min摇瓶培养72小时，3000r/min离心，进行菌液分离得到菌丝体。
其中PDA液体培养基配方为：马铃薯汁1.0L，葡萄糖20g，pH自然。
2、根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体发酵生产苯基乳酸
将菌丝体按接种量20g接入到100mL(含有39％苯基丙酮酸)底物转化液中，35℃下反应12h，然后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，测定转化液中苯基乳酸的含量为0.40g/L。
其中，
苯基丙酮酸的底物转化液配方为：苯基丙酮酸(纯度37％，)1.5g，葡萄糖3.42g，蒸馏水300mL，pH7.9。
苯基乳酸含量的测定方法采用高效液相色谱法：
岛津Prominence LC-20A高效液相色谱仪；色谱柱；VP-ODSC18；流动相：0.05％三氟乙酸-甲醇(v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL(产物进样前用0.22μm的微孔滤膜过滤)；检测器：UV-245紫外检测器。
实施例3
本实施例说明根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用，且操作方法同实施例2的小试操作，本实施例即实施例2的中试放大。
按实施例2的方法，利用5L发酵罐(用无菌生理盐水将斜面孢子洗下，调节孢子浓度至107个/mL，接种到3L培养液中，接种量10％，28℃下振荡培养120h)培养菌丝体，5L的反应罐(将菌丝体600g接入到3L底物转化液中)进行转化反应，pH值用无机酸、碱类自动调节，按实施例2的方法进行产物的分离和提取。结果为：35℃，转化反应时间14小时，苯基乳酸产量为0.55g/L。
实施例4
本实施例说明根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用，且操作方法同实施例2的小试操作，本实施例即实施例2的中试放大。
按实施例2的方法，利用10L发酵罐(用无菌生理盐水将斜面孢子洗下，调节孢子浓度至1010个/mL，接种到8L培养液中，接种量10％，28℃下振荡培养96h)培养菌丝体，10L的反应罐(将菌丝体1100g接入到8L底物转化液中)进行转化反应，pH值用无机酸、碱类自动调节，按实施例2的方法进行产物的分离和提取。结果为：35℃，转化反应时间48小时，苯基乳酸产量为0.67g/L。

Claims (3)

1、一株根霉，其分类命名为根霉Rhizopus sp.B1219，保藏登记号为CCTCC NO：M209007。
2、根据权利要求1所述的根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。
3、根据权利要求2所述的根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用，其特征在于所述的具体应用方法包括：
(1)根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体的制备
将根霉Rhizopus sp.B1219接种至PDA液体培养基进行发酵，培养条件为28℃，培养72～120小时后离心获得根霉菌丝体；
(2)根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体发酵生产苯基乳酸
将所获得的根霉Rhizopus sp.B1219菌丝体转接到含有苯基丙酮酸的底物转化液中，35℃下转化反应12～48h得到苯基乳酸粗品。
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