CN109363058A - 一种对玉米浆中呕吐毒素的生物降解方法 - Google Patents

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Abstract

制作嗜酸乳杆菌种曲，枯草芽孢杆菌种曲，酿酒酵母种曲、黑曲霉种曲、米曲霉种曲粉碎至60目备用。按嗜酸乳杆菌种曲和酿酒酵母种曲粉的两种或一种15％‑25％、黑曲霉种曲和米曲霉种曲粉两种或一种65％‑45％，枯草芽孢杆菌种曲粉20％‑30％混合成复合种曲粉备用。玉米深加工生产工段出来的玉米浆温度较高，pH值很低，进入发酵罐后，马上开启搅拌机，以180r/min搅拌(大体积发酵罐需配换热盘管)降温，并在搅拌过程中，缓缓加入CaO中和玉米浆pH至5.5‑6.0。当玉米浆温度降至35℃，pH升至5.5‑6.0时，按3％‑5％的接种量接入复合种曲粉。继续搅拌5min‑10min后停机，静止培养0.5h‑1.5h。观察玉米浆有气泡冒出时，间歇以120r/min‑160r/min搅拌并通入无菌空气，间歇持续搅拌通气36h‑48h；静止培养48h‑72h。发酵降解终结。

Description

一种对玉米浆中呕吐毒素的生物降解方法
技术领域
本发明涉及于生物降解农副产品所污染霉菌毒素之技术领域，特别涉及一种玉米深加工副产品-玉米浆所污染呕吐毒素的生物降解技术。
技术背景
据联合国粮农组织估算，全世界由于霉菌毒素污染造成的损失，每年达数千亿美元，而对人畜造成的危害更是难以统计。近年来，霉菌毒素污染对畜牧生产的负面影响逐渐被人们所认识，国外科研机构已经开始针对霉菌毒素的生物降解开展一系列研究。在国内关于呕吐毒素降解菌以及解毒酶相关的研究报道较少，筛选出能够产高效降解呕吐毒素酶的菌株以及通过酶工程、基因工程等手段获得高效表达的解毒酶是当前研究的方向。2015年《饲料工业》编辑部特邀中国农业大学计成教授就国内外呕吐毒素生物降解的研究做一综述。计教授等在《饲料工业》2015年第36卷第10期总第487期《呕吐毒素生物降解研究进展》一文中讲到：
镰刀菌产生大量呕吐毒素(DON)，污染谷物和粮食。DON能引起人和动物中毒，症状表现为呕吐、消化道出血、炎症，甚至死亡。目前没有有效的去毒方法，吸附剂几乎没有作用；物理和化学方法效果不稳定、破坏营养成分和味觉。生物降解DON特异性强、效率高、对食物营养成分无影响、能将毒素转化为无毒代谢产物。已有的文章报道降解饲料DON的单一菌株非常少，更没有关于动物有效性的应用研究。中国配合饲料样品中呕吐毒素阳性检出率高达100％，平均含量为0.6mg/kg。饲料或粮食中DON含量超过1mg/kg时会对人和动物健康产生危害，因此，美国食品药物管理局规定食品中DON限量标准为1mg/kg，我国农业部也对动物饲料中DON的限量标准做了规定，其值也不应超过1mg/kg。但是到目前为止，没有关于呕吐毒素降解酶的研究报道，也没有利用微生物或其产生的酶研发饲料添加剂的相关报道。因此，寻找新的高效降解饲料DON的菌株......是开发DON降解菌饲料添加剂的研究基础。
呕吐毒素(DON)易溶解于水，所以在玉米深加工生产过程中，玉米所污染的呕吐毒素(DON)基本都留在了玉米浆中，导致玉米浆中呕吐毒素(DON)含量较高。用它作营养原料，必须采取强有力的脱毒手段。本发明有效地解决了玉米浆中呕吐毒素的降解难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：在于针对玉米浆中呕吐毒素的有效生物降解，达到对玉米浆的脱毒目的。特别是针对呕吐毒素分子结构中的“C12，C13-环氧结构(具有毒性的主要结构基础)”作为生物降解之靶位，从农业部公告的《饲料添加剂品种目录》中，筛选相关真菌和细菌品种，经科学配比，通过混合发酵工艺，达到把C12和C13环氧结构降解为C9和C12形成双键基团(毒性被有效钝化)之目的。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一.利用本人专利号为ZL 201010148491.6的《微生物发酵无抗生素饲料及其制作方法》里所公开的嗜酸乳杆菌发酵料制作方法、枯草芽孢杆菌发酵料制作方法、酿酒酵母发酵料制作方法、黑曲霉发酵料制作方法、米曲霉发酵料制作方法，及本人专利号为ZL201220624896.7所公开的“自承重发键盘”，制作嗜酸乳杆菌种曲，枯草芽孢杆菌种曲，酿酒酵母种曲、黑曲霉种曲、米曲霉种曲粉碎至60目备用。
二.按嗜酸乳杆菌种曲和酿酒酵母种曲粉的两种或一种15％-25％、黑曲霉种曲和米曲霉种曲粉两种或一种65％-45％，枯草芽孢杆菌种曲粉20％-30％混合成复合种曲粉备用。
三.玉米深加工生产工段出来的玉米浆温度较高，pH值很低，进入发酵罐后，马上开启搅拌机，以180r/min搅拌降(大体积发酵罐需配换热盘管)降温，并在搅拌过程中，缓缓加入CaO中和玉米浆pH至5.5-6.0。
四.当玉米浆温度降至35℃，pH升至5.5-6.0时，按3％-5％的接种量接入复合种曲粉。继续搅拌5min-10min后停机，静止培养0.5h-1.5h。
五.观察玉米浆有气泡冒出时，间歇以120r/min-160r/min搅拌并通入无菌空气，间歇持续搅拌通气36h-48h；静止培养48h-72h。发酵降解终结。
具体实施方式
利用本人专利号为ZL 201010148491.6的《微生物发酵无抗生素饲料及其制作方法》里所公开的嗜酸乳杆菌发酵料制作方法、枯草芽孢杆菌发酵料制作方法、酿酒酵母发酵料制作方法、黑曲霉发酵料制作方法、米曲霉发酵料制作方法，及本人专利号为ZL201220624896.7所公开的“自承重发键盘”，制作嗜酸乳杆菌种曲，枯草芽孢杆菌种曲，酿酒酵母种曲、黑曲霉种曲、米曲霉种曲备用。
所述ZL201010148491.6的制作发酵料包括如下步骤：
(1)制作嗜酸乳杆菌发酵料：
A、制作嗜酸乳杆菌发酵培养基
取如下重量份配比的原料：玉米粉15份～25份、麦麸40份～50份、豆粕粉8份～20份、棉籽粕粉3份～8份、玉米胚芽粕8份～20份、酵母提取物粉1份～3份、含有70％～90％水份的玉米浆5份～15份、含有40％～60％水份的糖蜜5份～15份、石粉1份～2份、磷酸氢钙1份～2份；将取得的原料加水、搅拌均匀，原料与加入的水的重量之比为70～60∶30～40，得到复合料；将复合料放入高压蒸汽灭菌销中，在0.1Mpa～0.12Mpa气压下灭菌30分钟～50分钟；然后将复合料出锅，在无菌环境下待复合料温度降至25℃～40℃，得到嗜酸乳杆菌培养基；
B、培养嗜酸乳杆菌
将上述的嗜酸乳杆菌种液加入到嗜酸乳杆菌培养基中进行接种，其中加入的嗜酸乳杆菌种液与嗜酸乳杆菌培养基的重量之比为1.5～2.5∶98.5～97.5，在温度为35℃～42℃的厌氧环境下培养6天～8天，待活菌数大于1X108个/克时，再在45℃～50℃低温环境下干燥至含水量≤12％，然后密封包装、避光保存，得到嗜酸乳杆菌发酵料；
(2)制作枯草芽孢杆菌发酵料：
A、制作枯草芽孢杆菌发酵培养基
取如下重量份配比的原料：玉米粉15份～25份、麦麸30份～50份、豆粕粉5份～15份、棉籽粕粉5份～15份、玉米胚芽粕10份～20份、含有70％～90％水份的玉米浆2份～5份、含有40％～60％水份的桩蜜2份～8份；将取得的原料加水、搅拌均匀，原料与加入的水的重量之比为70～60∶3040，得到复合料；将复合料放入高压蒸汽灭菌锅中，在0.1Mpa～0.12Mpa气压下灭菌30分钟～50分钟；然后将复合料出锅，在无菌环境下待复合料温度降至25℃～40℃，制得枯草芽孢杆菌培养基；
B、培养枯草芽孢杆菌
将上述的枯草芽胞杆菌种液加入到枯草芽孢杆菌培养基中进行接种，其中加入的枯草芽孢杆菌种液与枯草芽孢杆菌培养基的重量之比为1.5～2.5∶98.5～97.5，在温度为35℃～42℃的供氧环境下培养2天～3天，待枯草芽孢杆菌活菌数大于1X109个/克、木聚糖酶活性大1.2X104u/g时，再在45℃～50℃低温环境下干燥至含水量≤12％，然后密封包装、避光保存，得到枯草芽孢杆菌发酵料；
(3)制作酿酒酵母发酵料：
A、制作酿酒酵母发酵培养基
取如下重量份配比的原料：玉米粉10份～20份、麦麸20份～40份、豆粕粉3份～8份、棉籽粕粉8份～16份、玉米胚芽粕15份～25份、次粉5份～15份、含有70％～90％水份的玉米浆2份～5份、含有40％～60％水份的糖蜜2份～8份；将取得的原料加水、搅拌均匀，原料与加入的水的重量之比为70～60∶30～40，得到复合料；将复合料放入高压蒸汽灭菌锅中，在0.1Mpa～0.12Mpa气压下灭菌30分钟～50分钟，得到酿酒酵母发酵培养基；
B、培养酿酒酵母
将上述酿酒酵母种液加入到酿酒酵母培养基中进行接种，其中加入的酿酒酵母种液与酿酒酵母培养基的重量之比为1.5～2.5∶98.5～97.5，在温度为35℃～42℃的供氧环境下培养2天～3天，待酿酒酵母活菌数大于1X109个/克时，再在45℃～50℃低温环境下干燥至含水量小于≤12％，然后密封包装、避光保存，得到酿酒酵母发酵料；
(4)制作长柄木霉发酵料：
A、取如下重量份配比的原料：玉米粉5份～15份、麦麸30份～50份、豆粕粉3份～8份、棉籽粕粉10份～20份、玉米胚芽粕17份～27份、含有70％～90％水份的玉米浆2份～5份、含有40％～60％水份的糖蜜2份～8份；将取得的原料加水、搅拌均匀，原料与加入的水的重量之比为65～55∶35～45，得到复合料；将复合料放入高压蒸汽灭菌锅中，在0.1Mpa～0.12Mpa气压下灭菌30分钟～50分钟；然后将复合料出锅，在无菌环境下待复合料温度降至25℃～40℃，制得长柄木霉发酵培养基；
B、培养长柄木霉
将上述的长柄木霉种液加入到长柄木霉培养基中进行接种，其中加入的长柄木霉种液与长柄木霉培养基的重量之比为1.5～2.5∶98.5～97.5，在温度为35℃～42℃的供氧环境下培养2天～3天，待纤维素酶活性大于1200u/g时，再在45℃～50℃低温环境下干燥至含水量≤12％，然后密封包装、避光保存，得到长柄木霉发酵料；
(5)制作黑曲霉发酵料：
A、取如下重量份配比的原料：玉米粉10份～20份、麦麸30份～50份、豆粕粉5份～15份、棉籽粕粉5份～15份、玉米胚芽粕12份～22份、含有70％～90％水份的玉米浆2份～5份、含有40％～60％水份的糖蜜2份～8份；将取得的原料加水、搅拌均匀，使原料与加入的水的重量之比为65～55∶35～45，得到复合料；将复合料放入高压蒸汽灭菌锅中，在0.1Mpa～0.12Mpa气压下灭菌30分钟～50分钟；然后将复合料出锅，在无菌环境下待复合料温度降至25℃～40℃，制得黑曲霉发酵培养基；
B、培养黑曲霉
将上述的黑曲霉种液加入到黑曲霉培养基中进行按种，其中加入的黑曲霉种液与黑曲霉培养基的重量之比为1.5～2.5∶98.5～97.5，在温度为35℃～42℃的供氧环境下培养2天～3天，待β-葡聚糖酶活性大于10000u/g时，再在45℃～50℃低温环境下干燥至含水量≤12％，然后密封包装、避光保存，得到黑曲霉发酵料；
(6)制作米曲霉发酵料：
A、取如下重量份配比的原料：玉米粉10份～20份、麦麸30份～50份、豆粕粉5份～15份、棉籽粕粉5份～15份、玉米胚芽粕12份～22份、含有70％～90％水份的玉米浆2份～5份、含有40％～60％水份的糖蜜2份～8份；将取得的原料加水、搅拌均匀，使原料与加入的水的重量之比为65～55∶35～45，得到复合料；将复合料放入高压蒸汽灭菌锅中，在0.1Mpa～0.12Mpa气压下灭菌30分钟～50分钟；然后将复合料出锅，在无菌环境下待复合料温度降至25℃～40℃，制得米曲霉发酵培养基；
B、培养米曲霉
将上述的米曲霉种液加入到米曲霉培养基中进行接种，其中加入的米曲霉种液与米曲霉培养基的重量之比为1.5～2.5∶98.5～97.5，在温度为35℃～42℃的供氧环境下培养2天～3天，待蛋白酶活性大于1500u/g时，再在45℃～50℃低温环境下干燥至含水量≤12％，然后密封包装、避光保存，得到米曲霉发酵料。
一.利用本人专利号为ZL 2010 0148491.6的《微生物发酵无抗生素饲料及其制作方法》里所公开的嗜酸乳杆菌发酵料制作方法、枯草芽孢杆菌发酵料制作方法、酿酒酵母发酵料制作方法、黑曲霉发酵料制作方法、米曲霉发酵料制作方法，及本人专利号为ZL201220624896.7所公开的“自承重发键盘”，制作嗜酸乳杆菌种曲，枯草芽孢杆菌种曲，酿酒酵母种曲、黑曲霉种曲、米曲霉种曲粉碎至60目备用。
二.按嗜酸乳杆菌种曲和酿酒酵母种曲粉的两种或一种15％-25％、黑曲霉种曲和米曲霉种曲粉两种或一种65％-45％，枯草芽孢杆菌种曲粉20％-30％混合成复合种曲粉备用。
三.取降解前玉米浆样品适量，以备对比检测。
四.玉米深加工生产工段出来的玉米浆温度较高，pH值很低，进入发酵罐后，马上开启搅拌机，以180r/min搅拌(大体积发酵罐需配换热盘管)降温，并在搅拌过程中，缓缓加入CaO中和玉米浆pH至5.5-6.0。
五.当玉米浆温度降至35℃，pH升至5.5-6.0时，按3％-5％的接种量接入复合种曲粉。继续搅拌5min-10min后停机，静止培养0.5h-1.5h。
六.观察玉米浆有气泡冒出时，间歇以120r/min-160r/min搅拌并通入无菌空气，间歇持续搅拌通气36h-48h；静止培养48h-72h，发酵降解终结。
七.取降解后玉米浆样品适量，以备对比检测。
九.将降解前、后玉米浆样品对比检测、记录数据。
试验检测数据：
名称 干基呕吐毒素(ppb)
玉米浆 4760
发酵后玉米浆 1990
结论：玉米浆毒素下降58.2％，脱毒效果明显。

Claims (5)

1.利用本人专利号为ZL 201010148491.6的《微生物发酵无抗生素饲料及其制作方法》里所公开的嗜酸乳杆菌发酵料制作方法、枯草芽孢杆菌发酵料制作方法、酿酒酵母发酵料制作方法、黑曲霉发酵料制作方法、米曲霉发酵料制作方法，及本人专利号为ZL201220624896.7所公开的“自承重发键盘”，制作嗜酸乳杆菌种曲，枯草芽孢杆菌种曲，酿酒酵母种曲、黑曲霉种曲、米曲霉种曲粉碎至60目备用。
2.按嗜酸乳杆菌种曲和酿酒酵母种曲粉的两种或一种15％-25％、黑曲霉种曲和米曲霉种曲粉两种或一种65％-45％，枯草芽孢杆菌种曲粉20％-30％混合成复合种曲粉备用。
3.玉米深加工生产工段出来的玉米浆温度较高，pH值很低，进入发酵罐后，马上开启搅拌机，以180r/min搅拌降(大体积发酵罐需配换热盘管)降温，并在搅拌过程中，缓缓加入CaO中和玉米浆pH至5.5-6.0。
4.当玉米浆温度降至35℃，pH升至5.5-6.0时，按3％-5％的接种量接入复合种曲粉。继续搅拌5min-10min后停机，静止培养0.5h-1.5h。
5.观察玉米浆有气泡冒出时，间歇以120r/min-160r/min搅拌并通入无菌空气，间歇持续搅拌通气36h-48h；静止培养48h-72h。发酵降解终结。
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