CN103966179B - 葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用 - Google Patents

葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶制剂的制备及应用，特别是指葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用。将特异青霉ACCC30443接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离制成葡萄糖氧化酶制剂。本发明解决了现有技术存在易存在新的污染和化学残留的问题，具有制备工艺简便，菌种及原料安全，所制备的葡萄糖氧化酶制剂使用方便，降解黄曲霉毒素B1速度快，降解率高等优点。

Description

葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用
技术领域
本发明属于酶制剂的制备及应用，特别是指葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用。
背景技术
黄曲霉毒素B1是诸多霉菌毒素中的一种，也是目前被发现的霉菌毒素中毒性最强的一种。它主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍，具有很强耐高温特性(268℃开始分解)。它广泛存在于饲料中，每年霉雨季节有90％以上的饲料被霉菌毒素污染，其黄曲霉毒素B1检出率高达80％以上。黄曲霉毒素B1被家禽家畜饲用后，大量聚集于肝脏，使肝脏肿大病变，导致肝功能下降，阻碍其正常功能进行，免疫力降低，重者直至死亡。此外，长期饲用低浓度黄曲霉毒素B1饲料，也可导致生育能力降低、胚胎内中毒死亡，如饲喂奶牛，其鲜牛奶中有黄曲霉毒素M1被检出，黄霉毒素M1检出值约为摄入量的1％左右，黄曲霉毒素B1在家畜体内有部分被转型为黄曲霉毒素M1结构形式排出体外。黄曲霉毒素B1在体内可积蓄较长时间，因此，黄曲霉毒素B1可通过动物体内蓄积和食物链的途径进入人体，主要损害肝脏，发生肝炎、肝硬化、肝癌坏死等。临床表现胃部不适、食欲减退、恶心、呕吐、腹胀及肝区触痛等。严重者出现水肿、昏迷、以至抽搐而死。黄曲霉毒素B1是目前发现的最强的致癌物，长期或大剂量随食物摄入，对人体造成严重的伤亡，尤其对婴幼儿危害甚大。因此，黄曲霉毒素的危害已引起世界各国的高度重视，力争在食物链的早期解除。目前，解除黄曲霉毒素B1的方法可分为物理法、化学产品降解法和微生物及其制剂(酶法)降解法三种方面。
物理法主要矿物质吸附、辐射处理、热处理、水洗法、液相抽提法等；物理方法存在许多不足，处理条件剧烈易于破营养成分，有些机械化程度不高，劳动强度大，难以规模化生产。每一种矿物质均有吸附量限制，饱和后不再有吸附作用，在饲料中黄曲霉毒素B1含量高时，出现部分毒素存在。同时它还有吸附微量元素、维生素、有效的矿物质等不足，造成有效成分损失。化学法降解法主要采用强酸、强碱、强氧化剂等，解毒率高，比较彻底，但易形成新的污染物和化学残留等危害，对家禽家畜及人类造成二次伤害，此方法不能大规模推广，为此，人们把注意力集中于生物学法。生物学法有效克服了物理和化学法的不足，条件温和，安全性高，越来越受到人们的关注。生物学法实质是酶的作用，酶的特点是天然、绿色、环保和反应速度快、专一性强，没有污染等特点，但目前还没有找到一种理想的可有效降解黄曲霉毒素B1的酶制剂制品，主要问题在于解除毒素能力低及饲用许可尚未认证等不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用，利用该方法制备的葡萄糖氧化酶制剂能够有效降解黄曲霉毒素B1。
本发明的整体技术构思是：
葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，将特异青霉PenicilliumnotatumACCC30443接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离制成葡萄糖氧化酶制剂；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖6％-8％，硝酸钠0.5％-0.7％，磷酸氢二钾0.01％-0.03％，硫酸镁0.04％-0.06％，氯化钾0.04％-0.06％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.7-0.9∶100温度27℃-29℃,通气量1∶0.7-0.9vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养周期为不低于60小时。
可以显而易见的是发酵终点的控制除时间因素外，应结合以721分光光度计监测产酶高峰确定发酵终点。
利用葡萄糖氧化酶制剂的制备方法获得的葡萄糖氧化酶制剂在降解黄曲霉毒素B1应用。本发明中的菌种特异青霉(又名点青霉)PenicilliumnotatumACCC30443由申请人自中国农业科学院菌种保藏管理中心购买。
本发明中的具体技术内容还有：
为缩短工业化发酵的周期，降低发酵的成本，优选且较为常见的技术方案是，所述的特异青霉ACCC30443在接入发酵培养基前经过扩大培养。
扩大培养的技术主要依据工业化发酵的规模确定，可以灵活的选择，并不脱离本发明的实质，其中较为优选的是，所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级液体种子的制备以及二级液体种子的制备。
更为优选的技术方案是，所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为26℃-29℃，培养周期4—5天。
所述的一级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
将斜面菌种按每只斜面接三瓶的接种量接种到一级种子培养基中，在27℃-29℃条件下振荡培养不低于28小时制成一级种子，装量为1000mL的三角瓶装入200mL一级种子培养基，以镜检孢子萌发、菌丝开始生长为培养终点。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.3-1.6∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝60-70:100，在温度为27℃-29℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子，以镜检菌丝断裂、生长均匀一致为发酵终点。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖5％-7％，硝酸钠0.4％-0.6％，磷酸氢二钾0.01％-0.03％，硫酸镁0.04％-0.06％，氯化钾0.04％-0.06％，余量为水,自然pH值。
所述的发酵液的固液分离采用板框进行。
本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、采用本发明的方法制备工艺简便、成熟，只需深层发酵设备，固液分离后液体即可用于解毒，制备过程无三废污染。
2、本发明的方法中所使用的制备该葡萄糖氧化酶制剂的菌株，已得到农业部有关部门批准，可用于制备饲料添加剂，安全可靠。
3、生产该葡萄糖氧化酶制剂主要原料为蔗糖，具有安全、无毒、绿色的特点，对畜禽不会造成危害。
4、该酶制剂用于降解黄曲霉毒素B1，降解速度快，降解率高，选择性好，性能稳定。用自然条件下污染黄曲霉毒素B1(含量≤100μg/kg)的饲料饲喂奶牛，同时在饮用水中加入葡萄糖氧化酶制剂，其鲜牛奶中黄曲霉毒素M1检测值均低于0.5μg/kg(符合GB19301-2003鲜乳卫生标准)；采用黄曲霉毒素B1含量≤500μg/kg的饲料饲喂小鸡，同时在饮用水中加入葡萄糖氧化酶制剂，鸡的存活率与对照组相比提高19％。
5、采用本发明制备的产品使用方法简单，随畜禽饮用水一起饮用即可。具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步及描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，将特异青霉PenicilliumnotatumACCC30443接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离，取液体为葡萄糖氧化酶制剂，储藏在2---10℃环境中备用。发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖8％，硝酸钠0.7％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸镁0.06％，氯化钾0.06％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.9∶100温度29℃,通气量1∶0.9vvm，压力为0.05Mpa，培养周期为不低于60小时，以721分光光度计监测产酶高峰为发酵终点。
本实施例中的菌种特异青霉(又名点青霉)PenicilliumnotatumACCC30443由申请人自中国农业科学院菌种保藏管理中心购买。
所述的特异青霉ACCC30443在接入发酵培养基前经过扩大培养。
所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级液体种子的制备以及二级液体种子的制备。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为29℃，培养周期4天。
所述的一级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
将斜面菌种按每只斜面接三瓶的接种量接种到一级种子培养基中，在29℃条件下振荡培养不低于28小时制成一级种子，装量为1000mL的三角瓶装入200mL一级种子培养基，以镜检孢子萌发、菌丝开始生长为培养终点。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.6∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝70:100，在温度为29℃，通气量为1∶0.7vvm，压力为0.05Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子，以镜检菌丝断裂、生长均匀一致为发酵终点。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖7％，硝酸钠0.6％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸镁0.06％，氯化钾0.06％，余量为水,自然pH值。
所述的发酵液的固液分离采用板框进行。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖6％，硝酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.04％，氯化钾0.04％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.7∶100温度27℃,通气量1∶0.7vvm，压力为0.03Mpa，培养周期为不低于60小时。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为26℃，培养周期5天。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.3∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝60:100，在温度为27℃，通气量为1∶0.5vvm，压力为0.03Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖5％，硝酸钠0.4％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.04％，氯化钾0.04％，余量为水,自然pH值。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖7％，硝酸钠0.6％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.8∶100温度28℃,通气量1∶0.8vvm，压力为0.04Mpa，培养周期为不低于60小时。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为28℃，培养周期4.5天。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.5∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝65:100，在温度为28℃，通气量为1∶0.6vvm，压力为0.04Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖6％，硝酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，余量为水,自然pH值。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖6％，硝酸钠0.7％，磷酸氢二钾0.023％，硫酸镁0.06％，氯化钾0.04％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.9∶100温度27℃,通气量1∶0.8vvm，压力为0.05Mpa，培养周期为不低于60小时。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为29℃，培养周期4天。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.4∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝70:100，在温度为27℃，通气量为1∶0.7vvm，压力为0.05Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖7％，硝酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸镁0.06％，氯化钾0.04％，余量为水,自然pH值。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖8％，硝酸钠0.6％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.04％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.9∶100温度27℃-29℃,通气量1∶0.9vvm，压力为0.04Mpa，培养周期为不低于60小时。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为26℃-29℃，培养周期4—5天。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.4∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝60:100，在温度为27℃-29℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖6％，硝酸钠0.45％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸镁0.06％，氯化钾0.06％，余量为水,自然pH值。
申请人对实施例1-5中制备的葡萄糖氧化酶制剂的酶活和降解黄曲霉毒素B1的能力进行如下试验，将利用本发明的方法获得的葡萄糖氧化酶制剂按1—3‰比例加入到畜禽饮用水，用于预防黄曲霉毒素B1中毒，也可按4—7‰比例饮用，用于直接降解畜禽饲料中黄曲霉毒素B1毒性，通过喂养试验1(葡萄糖氧化酶制剂降解鸡饲料黄曲霉毒素B1试验)证实，饲料中含黄曲霉毒素B1≤500μg/kg时，在鸡饮用水中添加葡萄糖氧化酶制剂并将鸡存活率与对照组进行比较，试验结果如表1。
表1葡萄糖氧化酶解除鸡饲料黄曲霉毒素B1效果比较
通过喂养试验2(葡萄糖氧化酶制剂降解牛饲料黄曲霉毒素B1试验)证实，饲料中含黄曲霉毒素B1≤100μg/kg时，在牛饮用水中添加葡萄糖氧化酶制剂并测定鲜牛奶中黄曲霉毒素M1与对照组比较，测定结果如表2。
表2葡萄糖氧化酶制剂降解牛饲料黄曲霉毒素B1测定结果
注：1预防试验饲料中含黄曲霉毒素B116.3μg/kg,直接降解试验饲料中含黄曲霉毒素B197.5μg/kg；
2测定方法：GB/17480—2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定方法-酶联免疫吸附法，GB/2010-食品安全国家标准-乳和乳品中黄曲霉毒素M1的测定(第二法)。
结果表明：采用液体葡萄糖氧化酶制剂，以1-3‰(V/V)比例添加到畜禽饮用水中连续饮用，可有效用于预防畜禽黄曲霉毒素B1中毒；添加4-7‰(V/V)比例到畜禽饮用水中，可有效的解除黄曲霉毒素B1毒性(自然条件下污染≤100μg/kg)，降解率高达85.96％，使黄曲霉毒素B1对畜禽的危害降低到≤20μｇ/kg(GB13078-2001饲料卫生标准)的数量级，对畜禽的生命活动不会造成有效的伤害；食物链对人的危害降到≤0.5μg/kg(符合GB19301-2003鲜乳卫生标准)。用于解毒剂的葡萄糖氧化酶含量奶牛为≥15U/mL、鸡为≥25U/mL(动态速率法)。

Claims (9)

1.葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于将特异青霉ACCC30443接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离制成葡萄糖氧化酶制剂；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
蔗糖6％-8％，硝酸钠0.5％-0.7％，磷酸氢二钾0.01％-0.03％，硫酸镁0.04％-0.06％，氯化钾0.04％-0.06％，余量为水，自然pH值；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为种子体积∶发酵培养基体积＝0.7-0.9∶100温度27℃-29℃,通气量1∶0.7-0.9vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养周期为不低于60小时。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的特异青霉ACCC30443在接入发酵培养基前经过扩大培养。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级液体种子的制备以及二级液体种子的制备。
4.根据权利要求3所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种的制备中培养基采用察氏培养基，温度为26℃-29℃，培养周期4-5天。
5.根据权利要求3所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的一级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
将斜面菌种按每只斜面接三瓶的接种量接种到一级种子培养基中，在27℃-29℃条件下振荡培养不低于28小时制成一级种子，装量为1000mL的三角瓶装入200mL一级种子培养基，以镜检孢子萌发、菌丝开始生长为培养终点。
6.根据权利要求5所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝1.3-1.6∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝60-70:100，在温度为27℃-29℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于28小时的通气发酵制成二级种子，以镜检菌丝断裂、生长均匀一致为发酵终点。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
蔗糖5％-7％，硝酸钠0.4％-0.6％，磷酸氢二钾0.01％-0.03％，硫酸镁0.04％-0.06％，氯化钾0.04％-0.06％，余量为水,自然pH值。
8.根据权利要求5或6中任一项所述的葡萄糖氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的发酵液的固液分离采用板框进行。
9.利用权利要求1-6中任一项所述的制备方法获得的葡萄糖氧化酶制剂在降解黄曲霉毒素B1应用。
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