CN112825980A - 基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法 - Google Patents

基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶活性肽粉的方法。以豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉为发酵原料，以特异青霉为出发菌株，通过试管种子、扁平固体种子扩繁、一吨种子罐生产液体种子；以枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌分别为出发菌株，通过试管种子、摇瓶液体种子扩繁；再将产生葡萄糖氧化酶的特异青霉种子液和产生活性肽的枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌种子液，与按顺序已混合好的发酵原料，按比例再均匀混合，放置到塑料吨袋中，插入通气管，联接无菌无油通气泵，经过好氧‑厌氧‑好氧‑厌氧的交替发酵，再经烘干、粉碎、过筛、检测等步骤，得到利用微生物发酵方法生产畜牧水产用含葡萄氧化酶功能型活性肽粉。

Description

基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性 肽粉的方法
技术领域
本发明涉及微生物液体发酵、微生物固体发酵和生物饲料添加剂技术领域。特别涉及到基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法。
背景技术
生物活性肽是指能够调节生物机体生命活动或者某些生理活性作用的一类肽的总称。生物活性肽大多是非活性状态，存在于蛋白质中，当被酶解成适当的长度时，它们的生物活性才会表现出来。现在主要通过蛋白酶水解和微生物发酵的生产工艺生产生物活性肽。活性肽的氨基酸含量丰富、比例均衡，具有很好的营养价值，活性肽中多肽主要集中在5000道尔顿以下，其中3000个道尔顿以下的多肽含量占46％。活性肽没有任何毒付作用，可以增强动物机体免疫功能、缓解疲劳并具有抑菌作用，是新一代功能性的生物肽制剂产品，可以替代单一酶解产品和发酵产品。
葡萄糖氧化酶是从特异青霉菌和蜂蜜中发现的酶，它是一种典型的氧化还原酶，分子量约160000道尔顿的蛋白质，有二个多肽链构成，酶反应的最适pH 5-7,最适温度是30-40℃,反应时葡萄糖脱氢成葡萄糖酸内酯，进一步水解为葡萄糖酸，能定量地生成H2O2。葡萄糖氧化酶在动物养殖中的主要作用:1)增加食欲，增加采食量，调解胃肠菌群平衡，清除体内及肠道内致病因子，优化肠道环境，促进饲料的消化吸收。2)增强免疫系统和肝脏功能，降低动物体内药物残留，快速消除霉菌毒素中毒，减少疾病发生。3)可以替代抗生素,与抗生素无配伍禁忌，协同抗生素可增加疗效，加快痊愈。4)可耐高温、耐酸碱、耐挤压，适合于颗粒饲料加工生产。用于预防和治疗沙门氏菌引起的疾病，效果突出，功效优于抗生素，且无抗生素耐药性及残留危害。5)可以显著提高动物产品的产量和品质，且有产品中有防腐保质作用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大，椭圆形或柱状。菌落形态呈白色近似圆形，不透明，表面干燥没有光泽，中间褶皱边缘不整齐呈锯齿状，在显微镜下观察菌体呈杆状，两端钝圆，单个或成对排列，染色均匀位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。能够很好的利用淀粉、柠檬酸盐、丙酸盐。在厌氧条件下、氯化钠含量在10％以下均能生长。生长温度范围在30～55℃，最适温度33℃。pH值范围在5.6～8.8。最适pH值范围在7.6～8.8。主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中。枯草芽孢杆菌具有很好的降解蛋白质的能力，生物好氧型、调整菌群、抑制病菌、生物拮抗等功能，所以在提高动物机体免疫力、增强消化系统酶活性、防病治病和促进生长中起着重要作用。贝莱斯芽孢杆菌菌体繁殖速度快、容易培养，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸，其芽孢抗逆性强、耐高温、耐酸碱、耐挤压，产品适用范围广泛等特点，并且它能作为模式菌株在生物芯片上进行有效的DNA扩增和蛋白质、氨基酸分离。国内外许多学者研究表明，枯草芽孢杆菌在医药保健、水产养殖、禽畜养殖和生态环保等方面有较高的研究价值和应用价值。
丁酸梭菌:也称谓酪酸菌，是厌氧微生物，芽孢杆菌科，梭菌属，革兰氏阳性，有芽孢，可抵抗不良环境。从人的粪便、土壤和沼气池中能分离出丁酸梭菌，其主要代谢产物为丁酸、乙酸和少量的乙醇，是人和动物肠道中的共生菌，对腹泻、肠炎、结肠炎都有防治作用。在其厌氧培养中含有脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌主要功效及作用；调整肠道菌群平衡，促进肠道有益菌群增殖，促进有益的双歧杆菌、乳酸菌的增殖。其磷壁酸可以有效控制大肠杆菌、沙门氏菌等的活性，并竞争性阻碍细菌和肠道绒毛结合，同时具有止泻、消炎、修复的作用，能迅速控制细菌性肠道炎症引起的腹泻、拉水、料便等临床症状。丁酸梭菌能增加动物体内血清中免疫球蛋白的含量，增强免疫功能。丁酸梭菌在肠道内能产生淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶、纤维素酶。这些酶系有重要的生理功能。丁酸梭菌稳定性好，产生内生芽孢，因而，通过消化道不失活，在体外室温下可保存三年以上不失效。并且对青霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、氯霉素等有一定的抗性，因此这种制剂可和抗生素合用，提高疗效，无任何毒副作用。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，圆端直杆菌，通常为0.9～1.2vtm×3.0～8.0μm，单个、成对或短链状，不生芽孢。兼性厌氧，表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白。属化能异养菌，生长需要营养丰富的培养基，能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85％以上是乳酸。通常最适生长温度为30～35℃。厌氧或兼性厌氧,菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。此菌与其他乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，使水中的PH值稳定不升高，而且其产出的酸性物质能降解重金属；由于此菌是厌氧细菌(兼性好氧)，在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。其味道具有酸甜芳香味，能分泌乳酸、乙酸可以使PH值下降，调整肠道菌群平衡，产生肽类抗菌素，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病微生物有拮抗作用。还可以改善适口性，促进生长，提高饲料转化率，降低抗生素和酸化剂的使用量，降低成本。特别是对胃肠功能失调和服用抗菌素而引起胃肠功能失调等症状有特效，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，具有很好的营养保健作用，有一定的免疫调节作用，对致病菌有抑制作用。
在以往研究中，科技工作者对特异青霉、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌的分类学地位、生理生化特征、发酵条件及其调控，对青霉菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌的应用研究和应用报道等均较多，对青霉菌、丁酸梭菌三者之间的交互作用的研究和应用报道等均未见报道。对青霉菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌与豆粕、麦麸、玉米蛋白粉作为一个共同体的研究均未见报道。青霉菌、丁酸梭菌均具有各自特点：微生物生长繁殖速度快、容易培养、菌体及代谢产物营养丰富等。氨基酸可以维持生命体的生理、生化、免疫机能，以及生长发育、新陈代谢等生命活动的正常运转和抑制病菌作用。
基于上述，本发明具有下列优点：1)特异青霉菌发酵可以产生葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和蔗糖酶等酶系，可以快速消除霉菌毒素中毒，可以增加药物疗效等特点；2)枯草芽孢杆菌可以分泌各种大量的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，能够将蛋白质分解成多肽、小肽和氨基酸，将纤维素降解成多糖和单糖，从而提高饲料利用率，减少蛋白质的使用量，减少二氧化碳排放量；3)丁酸梭菌可以调整肠道菌群平衡，促进肠道有益菌群增殖，促进有益的双歧杆菌、乳酸菌的增殖。其磷壁酸可以有效控制大肠杆菌、沙门氏菌等的活性等；4)嗜酸乳杆菌可以产生乳酸、丁酸等有机酸和多肽、抗菌肽，调整肠道菌落平衡，促进肠道有益菌群增殖，促进有益的双歧杆菌、乳酸菌的增殖和有效的抑制病菌的作用。5)能够显著的提高动物生产量和改善产品的质量，6)最重要的一条，在饲料中3％添加量，可以有效的预防各种疾病的发生，在饲料中5％添加量，可以有效的治疗肠胃道等各种疾病，为此，可以减少抗生素的使用量或完全替代抗生素；7)本产品可以明显的改善养殖环境；8)为了增加酶活、提高降解蛋白质的能力、提高丁酸、乳酸等有机酸的能力和提高生产性能，采用以四种菌为出发菌株，以豆粕、玉米蛋白粉和麦麸皮为发酵底物，固体发酵方法，可使酶活提高2％-5％，可使小肽达到20％-25％，可使丁酸等有机酸提高10％-20％，可使乳酸等有机酸提高10％-20％，产量提高10％-20％，品质提高3％-5％，起到了1+1大于2的作用，起到了1+1+1大于3的作用，起到了复合效应；9)为了便于微生物发酵，选择微生物发酵菌群具有优势互补性，特异青霉、枯草芽孢杆菌为好氧菌，丁酸梭菌为厌氧菌，嗜酸乳杆菌为兼性厌氧菌，经过好氧-厌氧-好氧-厌氧的交替发酵，好氧菌和厌氧菌各取所需自身的发酵条件，发酵时间较长，可以代谢出新的大量的葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、肽类物质、丁酸、乳酸等有机酸类等产物和未知的抑病促生长因子。为此，本项目研究具有显著的创造性和科技进步。本发明生产工艺简单，产品应用效果好，可广泛应用于畜禽、水产等养殖行业中。是一种绿色、环保、安全和健康的功能性的畜牧饲料添加剂和水产饵料添加剂，具有广阔的市场前景。目前，中国科学院沈阳应用生态研究所和河北微生物研究所，从陆地到海洋中已经分离、纯化、鉴定出多株特异青霉菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌，经过驯化、培育、提高得到多株产物含量高、活性好、生长速度快。经过我们生产应用，其应用效果非常好，已在辽宁的沈阳、大连地区，河北的石家庄、保定，河南的新乡、驻马店等地区广泛应用，取得了很好的经济效益，我们已将产品实现了商品化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用微生物发酵方法生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉。
本发明涉及微生物发酵技术，具体的说是基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法。以豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉为发酵原料，以特异青霉为出发菌株，通过试管种子、扁平固体种子扩繁、一吨种子罐生产液体种子；以枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌分别为出发菌株，通过试管种子、摇瓶液体种子扩繁，一吨种子罐生产液体种子；再将产生葡萄糖氧化酶的特异青霉种子液和产生活性肽的枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌种子液，与按顺序已混合好的发酵原料，按比例再均匀混合，放置到塑料吨袋中，插入通气管，联接无菌无油通气泵，经过好氧-厌氧-好氧-厌氧的交替发酵，再经烘干、粉碎、过筛、检测等步骤，得到利用微生物发酵方法生产畜牧水产用含葡萄氧化酶功能型活性肽粉。
本发明分别采用液体种子培养和固体发酵培养的发酵方法，发酵原料来源广泛，有益微生物菌群特定，发酵过程中代谢产物多，含营养成分均衡、产品质量好、应用方便、使用效果好。本产品中蛋白含量48％；功能型活性肽占蛋白总量≥22％。葡萄糖氧化酶量36IU/g；含有枯草芽孢杆菌≥80×108cfu/g、含有丁酸梭菌≥20×108cfu/g、含有嗜酸乳杆菌≥8×108cfu/g，本产品为生物活性饲料，在畜牧和水产养殖中的饲料按照1％～3％添加,可以有效的平衡动物肠道内的微生物菌群，预防肠胃道疾病发生，提高动物机体免疫力，可以提高生长性能，改善产品质量；饲料中按照3％～5％添加,可以有效地减少抗生素使用量或替代抗生素使用量：还可以改善养殖环境。本产品是一种绿色、环保、安全、健康的功能性的畜牧饲料添加剂和水产饵料添加剂。
具体步骤如下
(1)发酵原料制备：按照所需比例将豆粕50～70份、玉米蛋白粉10～30份、麦麸皮10～30份称重、备用。
(2)发酵菌液制备：特异青霉种子液20～25份、枯草芽孢杆菌种子液10～15份、丁酸梭菌种子液5～10份、嗜酸乳杆菌种子液5～10份；称重、备用。
(3)发酵料制备:
单混合顺序为：A发酵原料混合、B种子液混合；
复混合顺序为：B混合种子液—A混合发酵原料，按照此顺序，将混合后的种子液慢慢倒入混合后发酵原料中，在卫生级混料机中混合均匀。
(4)固体发酵:经过好氧-厌氧-好氧-厌氧的交替发酵过程
将按比例已经混合好的固体发酵料放置到塑料吨袋中，插入通气管，联接无菌无油通气泵，封闭吨袋口。首先，静止发酵24小时，再用无菌无油通气泵通风供氧，通气量为0.1～0.2V/V.min,通风供氧时间为12小时，停止通风12小时，再通风供氧时间为12小时，再停止通风12小时，好氧-厌氧交替发酵48小时，再厌氧发酵48小时，发酵时间为96小时～108小时；起始温度为35℃～40℃，发酵温度控制为为50℃～60℃，发酵结束时有醇香脂香和乳酸味道产生。
(5)烘干与粉碎：
将固体发酵结束的发酵料散开，均匀的传送到负压低温流化床上烘干，进风温度50～70℃，出风温度35～45℃,流化时间9分钟～11分钟，含水量13.0％～16.0％，粉碎、过筛目数100目～200目；得到基于微生物液体种子培养和固体发酵生产的畜牧水产用含葡萄糖氧化酶活性肽粉产品。
(6)特异青霉种子液制备
1、特异青霉种子液的制备：
1)单菌落菌种酶活测定与一级固体种子培养：将经活化的特异青霉菌种一支，挑出1/3部分，接种到盛有新配置的查氏培养基的200ml三角瓶中，在恒温摇床中震荡培养(条件为28℃、80转/分、震荡72小时)，测定此菌株的酶活；挑出2/3部分，分别接种到2支盛有新配置的特异青霉专用培养基的200ml茄形扁瓶中(每瓶培养基为小黄米8克、麦麸皮2克、20ml纯净水，灭菌)，在恒温培养箱中28℃培养100小时，得到特异青霉一级固体种子；
2)固体二级扩繁种子培养：特异青霉一级固体种子1瓶，分别接种到5个盛有新配置的特异青霉专用培养基的800ml王八扁瓶中(每瓶培养基为小黄米32克、麦麸皮8克、80ml纯净水，灭菌)，在恒温培养箱中28℃培养，100小时，得到特异青霉固体二级扩繁种子；
3)液体种子培养：将特异青霉固体二级扩繁种子10瓶接种到1吨种子罐培养基中，经培养，得到特异青霉种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：蔗糖1.0％～3.0％、硝酸钠0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.2％、氯化钾0.1％～0.3％、玉米蛋白粉1.0％～3.0％、余量为水、pH值为3-5；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.03～0.07MPa、风量100:50～100:90vvm、转速50～90rpm、温度25℃～29℃；时间60～84h；菌液葡萄糖氧化酶活性130IU/ml～190IU/ml；
(7)枯草芽孢杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2)固体种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨贝莱斯芽孢杆菌培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到枯草芽孢杆菌固体种子；
3)液体种子培养：将枯草芽孢杆菌固体种子按质量分数为10％～20％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.2％～0.8％、蛋白胨0.5％～1.5％、硫酸铵0.2％～0.8％、硫酸镁0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.3％，余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度30℃～34℃；时间24～36h；菌数测定结果180×108cfu/ml～200×108cfu/ml；
(8)丁酸梭菌种子液的制备：
1)单菌落分离；2)固体种子培养：3)液体种子培养；制备过程同上述(5)。
区别在于培养及组成不一样，其培养条件为厌氧培养。
所述丁酸梭菌种子罐培养基：按质量分数为：葡萄糖1.0％～2.0％、蛋白胨2.0％～3.0％、酵母膏0.6％～1.0％、碳酸钙0.3％～0.7％、硫酸镁0.1％～0.3％、硫酸锰0.001％～0.003％、磷酸氢二钾0.3％～0.7％、余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10Mpa、转速30～70rpm、温度33℃～37℃；时间24～36h；菌数测定结果100×108cfu/ml～120×108cfu/ml；
(9)嗜酸乳杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的嗜酸乳杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到植物乳杆菌单菌落种子；
2)固体种子培养：嗜酸乳杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到植物乳杆菌固体种子；
3)液体种子培养：将嗜酸乳杆菌一级固体种子按质量分数为10％～20％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到嗜酸乳杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0～3.0％、蛋白胨0.8％～1.2％、酵母粉0.6％～1.0％、丙酸钠0.1％～0.5％、硫酸镁0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.3％，余量为水,pH6.4～6.6；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、转速10～30rpm、温度33℃～37℃；时间24～48h(12小时后为停止搅拌，静置培养),菌数测定结果80×108cfu/ml～100×108cfu/ml。
优选的步骤(1)中，
发酵原料制备：按照所需比例将豆粕60份、玉米蛋白粉20份、麦麸皮20份称重、备用。
发酵菌液制备：特异青霉种子液25份、枯草芽孢杆菌种子液15份、丁酸梭菌种子液10份、嗜酸乳杆菌种子液10份称重、备用。
发酵料制备:单混合顺序为：A发酵原料混合、B种子液混合；
复混合顺序为：B混合种子液—A混合发酵原料，按照此顺序，将混合后的种子液慢慢倒入混合后发酵原料中，在卫生级混料机中混合均匀。
固体发酵:经过好氧-厌氧-好氧-厌氧的交替发酵过程
将按比例已经混合好的固体发酵料放置到塑料吨袋中，插入通气管，联接无菌无油通气泵，封闭吨袋口。首先，静止发酵24小时，再用无菌无油通气泵通风供氧，通气量为0.2V/V.min,通风供氧时间为12小时，停止通风12小时，再通风供氧时间为12小时，再停止通风12小时，好氧-厌氧交替发酵48小时，再厌氧发酵48小时，发酵时间为108小时；起始温度为40℃，发酵温度控制为50℃，发酵结束时有醇香脂香和乳酸味道产生。
优选的步骤(5)中，烘干与粉碎：
将固体发酵结束的发酵料散开，均匀的传送到负压低温流化床上烘干，进风温度50℃，出风温度45℃,流化时间9分钟分钟，含水量13.0％，粉碎、过筛目数100目；得到基于微生物液体种子培养和固体发酵生产的畜牧水产用含葡萄糖氧化酶活性肽粉产品。
优选的步骤(6)中，特异青霉种子液制备
1)单菌落菌种酶活测定与一级固体种子培养：将经活化的特异青霉菌种一支，挑出1/3部分，接种到盛有新配置的查氏培养基的200ml三角瓶中，在恒温摇床中震荡培养(条件为28℃、80转/分、震荡72小时)，测定此菌株的酶活；挑出2/3部分，分别接种到2支盛有新配置的特异青霉专用培养基的200ml茄形扁瓶中(每瓶培养基为小黄米8克、麦麸皮2克、20ml纯净水，灭菌)，在恒温培养箱中28℃培养100小时，得到特异青霉一级固体种子；
2)固体二级扩繁种子培养：特异青霉一级固体种子1瓶，分别接种到5个盛有新配置的特异青霉专用培养基的800ml王八扁瓶中(每瓶培养基为小黄米32克、麦麸皮8克、80ml纯净水，灭菌)，在恒温培养箱中28℃培养，100小时，得到特异青霉固体二级扩繁种子；
3)液体种子培养：将特异青霉固体二级扩繁种子10瓶接种到1吨种子罐培养基中，经培养，得到特异青霉种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：蔗糖2.0％、硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.15％、氯化钾0.2％、玉米蛋白粉2.0％、余量为水、pH值4；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量20％；罐压0.05MPa、风量100:70vvm、转速70rpm、温度27℃；时间72h；菌液葡萄糖氧化酶活性160IU/ml。
优选的步骤(7)中，枯草芽孢杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2)固体种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到枯草芽孢杆菌固体种子；
3)液体种子培养：将枯草芽孢杆菌固体种子按质量分数为10％～20％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:150vvm、转速150rpm、温度32℃；时间30h,菌数测定结果200×108cfu/ml；
优选的步骤(8)中，丁酸梭菌种子液的制备：
1)单菌落分离；2)固体种子培养：3)液体种子培养；制备过程同上述(5)。
区别在于培养及组成不一样。
所述丁酸梭菌种子罐培养基：以重量百分比计为：葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母膏0.8％，碳酸钙0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸锰0.002％、磷酸氢二钾0.5％、余量为水,pH6.8；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、转速50rpm、温度35℃；时间30h；丁酸梭菌菌液菌数测定结果100×108cfu亿个/ml；
优选的步骤(9)中，嗜酸乳杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的嗜酸乳杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到植物乳杆菌单菌落种子；
2)固体种子培养：嗜酸乳杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到植物乳杆菌固体种子；
3)液体种子培养：将嗜酸乳杆菌一级固体种子按质量分数为10％～20％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到嗜酸乳杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.8％、丙酸钠0.3％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、转速20rpm、温度35℃；时间36h(12小时后为停止搅拌,静置培养),菌数测定结果80×108cfu/ml。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：(重点看写清楚了吗)
(1)本发明的采用的发酵原料是：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉。豆粕占60％，占据发酵原料一半以上，豆粕是最好的发酵蛋白源，酶解并发酵后可产生大量的小肽和氨基酸。麦麸皮占20％，主要考虑麦麸皮利于葡萄糖氧化酶的发酵及酶活，麦麸皮营养全，是发酵最好助力剂。玉米蛋白粉也是最好的发酵原料，蛋白质高达70％，是优质蛋白源。
(2)本发明采用的液体发酵菌种为：特异青霉种子液25份、枯草芽孢杆菌种子液15份、丁酸梭菌种子液10份、嗜酸乳杆菌种子液10份。其中，产生葡萄糖氧化酶的特异青霉种子液占25份，占种子液总量45％，突出的代谢葡萄糖氧化酶。特异青霉菌种的特点是酶活性高，种子培养特点，采用小黄米制种，形成的孢子多，进入液体培养，生产势好。枯草芽孢杆菌种子液15份、丁酸梭菌种子液10份和在一起占种子液总量45％，突出的是将蛋白质转化成氨基酸和小肽。嗜酸乳杆菌种子液10份，占种子液总量10％，主要是降低PH产生乳酸和形成诱食肽。
(3)本发明采用的发酵原料和参加的发酵菌种及发酵代谢产生的酶类各自有各自的用途和特点，并且具有良好的互补性。特异青霉生成葡萄糖氧化酶等各种酶，豆粕与枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌生成小肽氨基酸促长因子，丁酸与嗜酸乳杆菌生成诱食肽、丁酸、乳酸和各种有机酸，均有促长和防病治病作用。
(4)本发明采用的发酵菌种特异青霉、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌菌种，互补性很强，在液体发酵制种的过程中，采用全自动发酵罐，可以补碳、补氮、调酸、调碱、去除泡沫等功能，发酵的周期短，菌数高，活性好，且单独发酵，无污染，无杂菌。青霉菌8312孢子数200IU/ml、枯草芽孢杆菌200×108cfu/ml、丁酸梭菌100×108cfu/ml、嗜酸乳杆菌菌种80×108cfu/ml。
(5)本发明在固体发酵过程中采用塑料吨袋承载，采用好氧-厌氧-好氧-厌氧的交替发酵过程，好氧发酵时通入足够的无菌空气，发酵彻底、没有杂菌、发酵时间100小时，发酵过程中代谢的产物多，即：小肽多,可提高动物免疫力、提高生产性能，氨基酸多，种类全、且均衡，葡萄糖氧化酶多，具有抗菌作用，可以部分替代抗生素。
(6)本发明在固体发酵结束以后，可将固体发酵结束的发酵料散开，均匀的传送到负压低温流化床上烘干.其主要特点是：进风温度70℃，出风温度45℃,流化时间9分钟分钟，含水量13.0％。既：低温、大风、尽量快速，最大限度的保留发酵料里面的活菌数目，产品中的活菌数达到33亿/ml，粉碎、过筛目数100目；得到畜牧水产用含葡萄糖氧化酶活性肽粉产品。主要是具有活性，抗菌性。
(7)本发明产品的主要特点是：在微生物发酵过程中，能够代谢多种生物活性物质如，多种氨基酸，小肽，复合酶类等物质，将原料中的大分子蛋白逐步分解为简单物质，再经过复杂的物理化学和生物化学的反应，形成具有独特的发酵料风味。可以大大提高饲料中蛋白质的利用率，产生的益生菌在繁殖过程中产生各种代谢产物，所以，可以处理养殖动物的肠胃，调整菌群平衡，杀灭有害菌，可以半替代或全替代抗生素，减少氮和碳的排放量，有利于环境的改善，保护环境，保护生态。本产品在畜牧水产养殖中应用，具有广阔的市场前景。
本发明分别采用液体种子培养和固体发酵培养的发酵方法，发酵原料来源广泛，有益微生物菌群特定，发酵过程中代谢产物多，含营养成分均衡、产品质量好、应用方便、使用效果好。本产品中蛋白含量48％；功能型活性肽占蛋白总量≥22％。葡萄糖氧化酶量36IU/g；含有枯草芽孢杆菌≥80×108cfu/g、含有丁酸梭菌≥20×108cfu/g、含有嗜酸乳杆菌≥8×108cfu/g，本产品为生物活性饲料，在畜牧和水产养殖中的饲料按照1％～3％添加,可以有效的平衡动物肠道内的微生物菌群，预防肠胃道疾病发生，提高动物机体免疫力，可以提高生长性能，改善产品质量；饲料中按照3％～5％添加,可以有效地减少抗生素使用量或替代抗生素使用量：还可以改善养殖环境。本产品是一种绿色、环保、安全、健康的功能性的畜牧饲料添加剂和水产饵料添加剂。
具体实施方式
以下实施例特异青霉：购买厂家为上海研生实业有限公司，该菌种具有产葡萄糖氧化酶稳定、液体固体发酵适应性广泛、制备成饲料添加剂在水产畜牧养殖中添加效果好)；枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌：中科院沈阳应用生态研究所农业微生物中心赠予；豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉均由市场购进。
实施例1
1、特异青霉种子液的制备：
1)单菌落菌种酶活测定与一级固体种子培养：将经活化的特异青霉菌种一支，挑出1/3部分，接种到盛有新配置的查氏培养基的200ml三角瓶中，在恒温摇床中震荡培养(条件为28℃、80转/分、震荡72小时)，测定此菌株的酶活；挑出2/3部分，分别接种到2支盛有新配置的特异青霉专用培养基的200ml茄形扁瓶中(每瓶培养基为小黄米8克、麦麸皮2克、20ml纯净水，灭菌)，在恒温培养箱中28℃培养100小时，得到特异青霉一级固体种子；
2)固体二级扩繁种子培养：特异青霉一级固体种子1瓶，分别接种到5个盛有新配置的特异青霉专用培养基的800ml王八扁瓶中(每瓶培养基为小黄米32克、麦麸皮8克、80ml纯净水，灭菌)，在恒温培养箱中28℃培养，100小时，得到特异青霉固体二级扩繁种子；
3)液体种子培养：将特异青霉固体二级扩繁种子10瓶接种到1吨种子罐培养基中，经培养，得到特异青霉种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：蔗糖2.0％、硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.2％、氯化钾0.2％、玉米蛋白粉2.0％、余量为水、pH值自然；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量20％；罐压0.05MPa、风量100:70vvm、转速70rpm、温度27℃；时间60h；菌液葡萄糖氧化酶活性160IU/ml(测定方法依据企业标准执行)。
2、枯草芽孢杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2)固体种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到枯草芽孢杆菌固体种子；
3)液体种子培养：将枯草芽孢杆菌固体种子按质量分数为10％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：
葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:150vvm、转速150rpm、温度32℃；时间24h；菌数测定结果20×109cfu/ml
4)菌数的检测及其发酵结束的评价：采用平板计数法测定枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数≥200×108cfu/ml。显微镜下检查枯草芽孢杆菌种子液，菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，发酵结束，可与其他种子液按照比例混合使用。
3、丁酸梭菌产生菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的丁酸梭菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖、蛋白胨丁酸梭菌培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到丁酸梭菌单菌落种子；
2)固体种子培养：丁酸梭菌单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨木瓜粉丁酸梭菌培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到丁酸梭菌固体种子；
3)液体种子培养：将丁酸梭菌固体种子按质量分数为10％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到丁酸梭菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：
葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母膏0.8％、碳酸钙0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸锰0.002％、磷酸氢二钾0.3％、余量为水,pH6.8；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、转速50rpm、温度35℃；时间24h；丁酸梭菌菌液菌数测定结果100×108cfu/ml。
4)菌数的检测及其发酵结束的评价：采用平板计数法测定丁酸梭菌种子液中含丁酸梭菌活菌数≥100×108cfu/ml。显微镜下检查丁酸梭菌种子液，菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，发酵结束，可与其他种子液按照比例混合使用。
4、嗜酸乳杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的嗜酸乳杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖蛋白胨酵母粉培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃培养，得到嗜酸乳杆菌单菌落种子；
2)固体种子培养：嗜酸乳杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨酵母粉培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃培养，得到嗜酸乳杆菌固体种子；
3)液体种子培养：将嗜酸乳杆菌一级固体种子按质量分数为10％的接种量接种到种子罐培养基中，经培养，得到嗜酸乳杆菌种子液；所述种子罐培养基以重量百分比计为：
葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.8％、丙酸钠0.3％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.015MPa、转速20rpm、温度35℃；时间36h(12小时后为停止搅拌,静置培养)；菌数测定结果80×108cfu/ml
4)菌数的检测及其发酵结束的评价：细胞形态为在PH值5.0以下条件下，菌体呈现短杆状，菌体粗壮、两端钝圆，在PH值6.2条件下，菌体变细，杆状较长。培养皿检查：平板培养基上的植物乳杆菌菌落呈无色透明，采用平板计数法测定嗜酸乳杆菌种子液中含嗜酸乳杆菌活菌数≥80×108cfu/ml。培养成熟时，PH＝5以下，具有酸甜芳香味，菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，发酵结束，可与其他种子液按照比例混合使用。
发酵原料中豆粕、麦麸皮、米糠、玉米蛋白粉含水量均为10％，发酵原料中总含水量10-12.0％。所述的吨袋材料为聚乙烯塑料，体积为1m3，重量为1000kg。
5、发酵料制备:
发酵原料制备：按照所需比例将豆粕60份、玉米蛋白粉20份、麦麸皮20份称重、备用。
发酵菌液制备：特异青霉种子液25份、枯草芽孢杆菌种子液15份、丁酸梭菌种子液10份、嗜酸乳杆菌种子液10份称重、备用。
发酵料制备:单混合顺序为：A发酵原料混合、B种子液混合；
复混合顺序为：B混合种子液—A混合发酵原料，按照此顺序，将混合后的种子液慢慢倒入混合后发酵原料中，在卫生级混料机中混合均匀，此料称之为固体发酵料。
6、固体发酵:经过好氧-厌氧-好氧-厌氧的交替发酵过程
将按比例已经混合好的固体发酵料放置到塑料吨袋中，插入通气管，联接无菌无油通气泵，封闭吨袋口。首先，静止发酵24小时，再用无菌无油通气泵通风供氧，通气量为0.2V/V.min,通风供氧时间为12小时，停止通风12小时，再通风供氧时间为12小时，再停止通风12小时，好氧-厌氧交替发酵48小时，再厌氧发酵48小时，发酵时间为108小时；起始温度为40℃，发酵温度控制为为50℃，发酵结束时有醇香脂香和乳酸味道产生。
7、烘干与粉碎：
将固体发酵结束的发酵料散开，均匀的传送到负压低温流化床上烘干，进风温度50℃，出风温度45℃,流化时间9分钟分钟，含水量13.0％，在无菌洁净条件下进行粉碎、过筛目数100目；得到基于微生物液体种子培养和固体发酵生产的畜牧水产用含葡萄糖氧化酶活性肽粉产品。
实施例2
特异青霉发酵罐种子培养基和培养条件试验
1、特异青霉发酵罐种子培养基配方试验，
试验设计为6因素3水平，试验设计与试验结果如下表1：
表1.特异青霉种子罐发酵培养基配方试验
Figure BDA0002878262450000161
Figure BDA0002878262450000171
2、特异青霉种子罐培养条件试验
试验设计为5因素3水平，试验设计与试验结果如下表2：
表2.特异青霉种子罐发酵培养条件试验
Figure BDA0002878262450000172
通过表1、表2的试验结果确定的特异青霉发酵罐种子培养基以重量百分比计为：蔗糖2.0％、硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.15％、氯化钾0.2％、玉米蛋白粉2.0％、余量为水、pH值自然；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量20％；罐压0.05MPa、风量100:70vvm、转数70rpm、温度27℃；时间72h；菌液葡萄糖氧化酶活性160IU/ml。
枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基和培养条件试验
1、枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基配方试验，
试验设计为5因素3水平，试验设计与试验结果如下表3
表3.枯草芽孢杆菌种子罐发酵培养基配方试验
Figure BDA0002878262450000173
2、枯草芽孢杆菌种子罐培养条件试验
试验设计为5因素3水平，试验设计与试验结果如下表4：
表4.枯草芽孢杆菌种子罐发酵培养条件试验
Figure BDA0002878262450000181
通过表3、表4的试验结果确定的枯草芽孢菌种子罐培养基：以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:150vvm、转速150rpm、温度32℃；时间30h；菌数测定结果200×108cfu/ml；
丁酸梭菌发酵罐种子培养基和培养条件试验
1、丁酸梭菌发酵罐种子培养基配方试验，
试验设计为7因素3水平，试验设计与试验结果如下表5：
表5.丁酸梭菌种子罐发酵培养基配方试验
Figure BDA0002878262450000182
2、丁酸梭菌种子罐培养条件试验
试验设计为4因素3水平，试验设计与试验结果如下表6：
表6.丁酸梭菌种子罐发酵培养条件试验风量权利要求只给出一个范围
Figure BDA0002878262450000183
Figure BDA0002878262450000191
通过表5、表6的试验结果确定的丁酸梭菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母膏0.8％、碳酸钙0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸锰0.002％、磷酸氢二钾0.5％、余量为水,pH6.8；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:50vvm、转速50rpm、温度35℃；时间30h；丁酸梭菌菌液菌数测定结果110×108cfu亿个/ml。
嗜酸乳杆菌发酵罐种子培养基和培养条件试验
1、嗜酸乳杆菌发酵罐种子培养基配方试验，
试验设计为6因素3水平，试验设计与试验结果如下表7：
表7.嗜酸乳杆菌种子罐发酵培养基配方试验
Figure BDA0002878262450000192
2、嗜酸乳杆菌种子罐培养条件
试验设计为5因素3水平，试验设计与试验结果如下表8：
表8.嗜酸乳杆菌种子罐发酵培养条件试验
Figure BDA0002878262450000193
通过表7、表8的试验结果确定的嗜酸乳杆菌种子罐的培养基：以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.8％、丙酸钠0.3％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.015MPa、转速20rpm、温度35℃；时间36h(12小时后为停止搅拌,静置培养)；菌数测定结果80×108cfu/m.
实施例3
固体发酵中不同相对含水量对发酵温度的影响
1、不同原料配比不同含水量对发酵温度的影响试验设计
试验设计为3因素9水平，试验设计和试验结果如下表9：
发酵底物100～120份:特异青霉种子液20～25份、枯草芽孢杆菌种子液15～20份、丁酸梭菌种子液5～10份、嗜酸乳杆菌种子液5～10份
表9.固体发酵中不同相对含水量对发酵温度的影响试验设计
Figure BDA0002878262450000201
2、不同原料配比不同相对含水量对发酵温度的影响试验结果不同原料配比与不同相对含水量对发酵温度影响试验结果见表6：
表10.固体发酵中不同相对含水量对发酵温度的影响(℃)
Figure BDA0002878262450000202
3、固体发酵同原料配比产品保证值的测定
固体发酵中不同原料配比产品保证值的测定结果见表7：
表11.固体发酵中不同原料配比产品保证值的测定结果
Figure BDA0002878262450000211
实施例4
将实施例1的制备方法获得的畜牧水产用含葡萄氧化酶的活性肽粉在对南美白对虾工厂化育苗中的成活率和虾苗长度影响(仔虾阶段),试验结果见表12。
含葡萄氧化酶的活性肽粉试验方案设计
试验组1：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉:3％添加+97％开口饵料试验组2：含葡萄氧化酶的功能型活性肽粉5％添加+95％开口饵料试验组3：活性肽粉3％添加+97％开口饵料
试验组4：活性肽粉5％添加+95％开口饵料
对照组：100％的开口饵料
试验中应用的对照产品为100％的开口饵料，试验组3和4与本发明不相同之处在于，试验组3和4中的原料组成：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉，发酵菌种组成：枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，其它与本发明方法一致。
表12.含葡萄氧化酶的活性肽对南美白对虾工厂化育苗中的成活率和虾苗长度影响(仔虾阶段)
Figure BDA0002878262450000212
注：试验时间2020年10月7日—21日，试验期为14天；试验温度30±1℃；投饵量为0.8千克/池/天
通过表12结果可以看出，经过5天试验，结果表明：试验组成活率82.86％、85.71％、74.28％、77.14％与对照组成活率77.43％相比较，南美白对成活率提高16.0％、19.99％、4.00％、7.994％。长度提高率8.26％、9.92％、6.61％、5.79％。；观察虾苗的体色和虾苗活跃程度，试验组明显好于对照组。此试验结果表明：含葡萄氧化酶功能性活性肽粉有消炎作用和促进生长作用。
实施例5
含葡萄氧化酶的活性肽粉试验方案设计
试验组1：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉3％添加+97％饵料
试验组2：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉5％添加+95％饵料
试验组3：活性肽粉3％添加+97％饵料
试验组4：活性肽粉5％添加+95％饵料
对照组：100％饵料
试验中应用的对照产品为100％的开口饵料，试验组3和4与本发明不相同之处在于，试验组3和4中的原料组成：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉，发酵菌种组成：黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，其它与本发明方法一致。
将实施例1获得的畜牧水产用含葡萄氧化酶的活性肽粉在南美白对虾养殖中应用试验，试验方案设计见表9：
表13.含葡萄氧化酶功能型活性肽粉对南美白对虾工厂化淡水养殖中的日增重及成活率的影响
Figure BDA0002878262450000221
注：试验时间2020年11月1日—30日，试验期为30天；试验温度26±1℃。表7、表9同。
成活率＝成活数/总数
通过表13结果可以看出，经过养成期30天试验，结果表明：试验组与对照组相比，南美白对虾日增重明显提高，增重率分别提高10.93％、14,06％、8.434％、9.689％。观察虾苗的体色和虾壳质量，试验组明显好于对照。对于肠胃消炎效果好，绿色、安全、高效。
实施例6
使用实施例1中的方法，用实施例2中所有表中的第二个数值和实施例3中表9中的第九项的发酵原料和菌种比例按照实施例1的相同方法获得的含葡萄氧化酶功能型活性肽粉在畜禽养殖中的保育猪阶段进行25天的喂养试验。含葡萄氧化酶功能型活性肽粉试验方案设计如下：
试验组1：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉3％添加+饵料-3％等量饲料
试验组2：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉5％添加+饵料-5％等量饲料
试验组3：活性肽粉3％添加+饲料-3％等量饲料
试验组4：活性肽粉3％添加+饵料-3％等量饲料
对照组：饲料
试验中应用的对照产品为100％的普通市购饲料，试验组3和4与本发明不相同之处在于，试验组3的原料组成：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉，发酵菌种组成：枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，
试验组4的原料组成：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉，发酵菌种组成：特异青霉、枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，但是原料组成比例与试验组1和2不相同，试验组4的发酵底物的各种原料的重量比为；豆粕20份、玉米蛋白粉50份、麦麸皮50份；发酵底物与特异青霉、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌种子液的重量比为：发酵底物100份:特异青霉种子液30份、枯草芽孢杆菌种子液30份、丁酸梭菌种子液20份、嗜酸乳杆菌种子液20份；
其它与本发明方法一致。
含葡萄氧化酶功能型活性肽粉对保育猪阶段增重、腹泻、成活率的影响结果见表14。
表14.含葡萄氧化酶功能型活性肽粉对保育猪阶段增重、腹泻、成活率的影响
Figure BDA0002878262450000231
Figure BDA0002878262450000241
*：保育猪试验天数为25天；
含葡萄氧化酶功能型活性肽粉在保育猪阶段日粮中按照3.0％～5.0％进行添加，经过25天的喂养试验，结果表明：试验组平均日增重分别为：0.488kg、0.496kg、0.480kg、0.486kg，对照组为对照组平均日增重0.448kg，试验组与对照组平均日增重率分别为8.93％、10.71％、7.14％、8.48％，试验组料重比分别为：1.372：1、1.371：1、1.375；1、1.378：1，对照组料重比为1.406：1。试验组料重比分别下降3.40％、3.50％、3.10％、2.80％。试验过程中试验组1、2基本上没有猪腹泻发生，试验组3、4略有腹泻发生，对照组，有腹泻发生。试验组且粪便松软，颜色浅黄色，臭味减轻，养殖环境明显改善。
实施例7
将实施例1获得的含葡萄氧化酶功能型活性肽粉在肉鸡上进行30天的喂养试验。含葡萄氧化酶功能型活性肽粉试验方案设计如下：
试验组1：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉1％添加+饲料-1％等量饲料
试验组2：含葡萄氧化酶功能型活性肽粉3％添加+饲料-3％等量饲料
试验组3：活性肽粉3％添加+饲料-3％等量饲料
试验组4：活性肽粉3％添加+饲料-3％等量饲料
对照组：饲料
试验中应用的对照产品为100％的普通饲料，试验组3和4与本发明不相同之处在于，试验组3中的原料组成：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉，发酵菌种组成：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，其它与本发明方法一致，试验组4中的原料组成：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉，发酵菌种组成：青霉菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，其它与本发明方法一致。
含葡萄氧化酶功能型活性肽粉对肉鸡增重率、料肉比、腹泻、成活率的影响结果见表15。
表15.含葡萄氧化酶功能型活性肽粉对肉鸡增重率、料肉比、腹泻、成活率的影响
Figure BDA0002878262450000242
Figure BDA0002878262450000251
*：肉鸡试验天数为30天；
含葡萄氧化酶功能型活性肽粉在肉鸡日粮中按照3.0％～5.0％进行添加，经过30天的喂养试验，结果表明：试验组平均日增重分别为：71.60g、71.90g、71.33g、71.40g，对照组为对照组平均日增重70.00g，试验组与对照组平均日增重率分别为2.30％、2.70％、1.90％、2.00％，试验组料重比分别为：1.501：1、1.500：1、1.504；1、1.509：1，对照组料重比为1.552：1。
试验组料肉比分别下降5.1％、4.7％、2.6％、4.3％。试验过程中试验组1、2基本上没有猪腹泻发生，试验组3、4略有腹泻发生，对照组，有腹泻发生。试验组且粪便松软，颜色浅黄色，臭味减轻，养殖环境明显改善。试验组于对照组相比较，均差异性显著。
与实施例1－7不同之处在于，为提高产品质量，缩短生产周期，申请人还试用了中国科学院沈阳应用生态研究所分离、纯化并鉴定的高活性微生物菌株,其应用效果更佳。

Claims (7)

1.基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法，其特征在于：豆粕、麦麸皮、玉米蛋白粉为发酵底物，以特异青霉、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌为微生物发酵菌群，固体发酵过程中，发酵底物的各种原料的重量比为；豆粕50～70份、玉米蛋白粉10～30份、麦麸皮10～30份；发酵底物与特异青霉、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌种子液的重量比为：发酵底物100～120份:特异青霉种子液20～25份、枯草芽孢杆菌种子液10～15份、丁酸梭菌种子液5～10份、嗜酸乳杆菌种子液5～10份；固体发酵放置到塑料吨袋中进行，起始温度为35℃～40℃，发酵温度控制为为50℃～60℃，发酵时间为96小时～108小时；固体发酵24小时后，用无菌无油通气泵通风供氧，通气量为0.1～0.3V/V.min,通风供氧时间为12小时，停止通风12小时，再通风供氧时间为12小时，再停止通风12小时，好氧-厌氧交替发酵48小时，再厌氧发酵48小时，发酵结束时有醇香脂香和乳酸味道产生；将发酵料散开后，传送到负压低温流化床上烘干，进风温度50～70℃，出风温度35～45℃,流化时间9分钟～11分钟，含水量13.0％～16.0％，粉碎、过筛目数100目～200目；得到基于微生物液体种子培养和固体发酵生产的畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉产品。
2.按照权利要求1所述的基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶活性肽粉的方法，其特征在于：所述固体发酵过程中，发酵原料中各种原料的重量比为；豆粕60份、玉米蛋白粉20份、麦麸皮20份；发酵原料与微生物发酵菌群种子液的最佳重量比为，发酵原料100份:特异青霉种子液25份、枯草芽孢杆菌种子液15份、丁酸梭菌种子液10份、嗜酸乳杆菌种子液10份。
3.按照权利要求1所述的基于微生物发酵
生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法，其特征在于：
所述特异青霉种子罐培养基：以重量百分比计为：蔗糖1.0％～3.0％、硝酸钠0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.2％、氯化钾0.1％～0.3％、玉米蛋白粉1.0％～3.0％、余量为水、pH值为3-5；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.03～0.07MPa、风量100:50～100:90vvm、转速50～90rpm、温度25℃～29℃；时间60～84h；菌液葡萄糖氧化酶活性130IU/ml～190IU/ml；
所述枯草芽孢菌种子罐培养基：以重量百分比计为：葡萄糖0.2％～0.8％、蛋白胨0.5％～1.5％、硫酸铵0.2％～0.8％、硫酸镁0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.3％，余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度30℃～34℃；时间24～36h；菌数测定结果180×108cfu/ml～200×108cfu/ml；
所述丁酸梭菌种子罐培养基：以重量百分比计为：葡萄糖1.0％～2.0％、蛋白胨2.0％～3.0％、酵母膏0.6％～1.0％、碳酸钙0.3％～0.7％、硫酸镁0.1％～0.3％、硫酸锰0.001％～0.003％、磷酸氢二钾0.3％～0.7％、余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10Mpa、转速30～70rpm、温度33℃～37℃；时间24～36h；菌数测定结果100×108cfu/ml～120×108cfu/ml；
所述嗜酸乳杆菌种子罐的培养基：以重量百分比计为：葡萄糖1.0～3.0％、蛋白胨0.8％～1.2％、酵母粉0.6％～1.0％、丙酸钠0.1％～0.5％、硫酸镁0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.3％，余量为水,pH6.4～6.6；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、转速10～30rpm、温度33℃～37℃；时间24～48h(12小时后为停止搅拌，静置培养),菌数测定结果80×108cfu/ml～100×108cfu/ml。
4.按照权利要求1或3所述的基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法，其特征在于：
所述特异青霉种子罐培养基：以重量百分比计为：蔗糖2.0％、硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.15％、氯化钾0.2％、玉米蛋白粉2.0％、余量为水、pH值4；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量20％；罐压0.05MPa、风量100:70vvm、转速70rpm、温度27℃；时间72h；菌液葡萄糖氧化酶活性160IU/ml；
所述枯草芽孢菌种子罐培养基：以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:150vvm、转速150rpm、温度32℃；时间30h,菌数测定结果200×108cfu/ml；
所述丁酸梭菌种子罐培养基：以重量百分比计为：葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母膏0.8％，碳酸钙0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸锰0.002％、磷酸氢二钾0.5％、余量为水,pH6.8；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、转速50rpm、温度35℃；时间30h；丁酸梭菌菌液菌数测定结果100×108cfu亿个/ml；
所述嗜酸乳杆菌种子罐的培养基：以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.8％、丙酸钠0.3％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、转速20rpm、温度35℃；时间36h(12小时后为停止搅拌,静置培养),菌数测定结果80×108cfu/ml。
5.按照权利要求1所述的基于微生物发酵生产生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法，其特征在于：固体发酵放置到吨袋中进行，起始温度为35℃，发酵温度控制为为50℃，发酵时间为108小时；固体发酵24小时后，用气泵通风供氧，通气量为0.2V/V.min,通风供氧时间为12小时，停止通风12小时，再通风供氧时间为12小时，再停止通风12小时，好氧-厌氧交替发酵48小时，再厌氧发酵56小时，发酵结束时有醇香脂香和乳酸味道产生；发酵料散开后，传送到负压低温流化床上烘干，进风温度70℃，出风温度35℃,流化时间11分钟，含水量13.0％，粉碎、过筛目数200目；得到利用微生物液体-固体两相发酵法生产基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉。
6.按照权利要求1所述的基于微生物发酵生产生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法，其特征在于：发酵结束时pH值4.5～5.5；烘干粉碎后产品粗蛋白45％～50％，功能型活性肽占蛋白总量20％～30％(分子量为2000个道尔顿以下)；赖氨酸2.2％～2.8％、蛋氨酸0.5％～1.0％、苏氨酸0.3％～0.8％、色氨酸0.3％～0.6％、精氨酸1.5％～3.0％、缬氨酸1.5％～3.0％、谷氨酸3.5％～5.0％；总酸200～300°T、乳酸6.0～7.5，丁酸6.0～7.5；葡萄糖氧化酶33IU/g～39IU/g；含有枯草芽孢杆菌≥60×108cfu/g～100×108cfu/g、含有丁酸梭菌≥10×108cfu/g～20×108cfu/g、含有嗜酸乳酸菌≥6×108cfu/g～10×108cfu/g。
7.按照权利要求1或6所述的基于微生物发酵生产畜牧水产用含葡萄糖氧化酶功能型活性肽粉的方法，其特征在于：发酵结束时pH值5.0；烘干粉碎后产品中蛋白含量≥48％；功能型活性肽占蛋白总量≥22％(分子量为2000个道尔顿以下)；赖氨酸2.5％、蛋氨酸1.0％、苏氨酸0.8％、色氨酸0.6％、精氨酸1.5％、缬氨酸3.0％、谷氨酸3.5％；总酸300°T、乳酸6.0、丁酸7.5；葡萄糖氧化酶量36IU/g；含有枯草芽孢杆菌≥80×108cfu/g、含有丁酸梭菌≥20×108cfu/g、含有嗜酸乳杆菌≥8×108cfu/g；发酵原料中豆粕、麦麦麸皮、玉米蛋白粉含水量均为10％，发酵原料中总含水量10～12.0％。所述的吨袋材料为聚乙烯塑料，体积为1m3，重量为1000kg。
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