CN107574136B

CN107574136B - 一种水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法

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Publication number: CN107574136B
Application number: CN201711033775.9A
Authority: CN
Inventors: 吴伟; 潘莹; 郑尧; 陈树桥; 周国勤
Original assignee: NANJING FISHERIES RESEARCH INSTITUTE; Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: NANJING FISHERIES RESEARCH INSTITUTE; Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2037-10-30
Also published as: CN107574136A

Abstract

本发明涉及一种水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，属于水产养殖技术领域。其以工农业生产的副产物麸皮、次粉和酱油渣为发酵底物，利用纳豆芽孢杆菌CICC 10454、乳酸杆菌CICC 21007、醋化醋杆菌CICC 21684、酿酒酵母CICC 1005和产阮假丝酵母CICC 1769这5株具不同性状和生态活性的微生物菌株进行混合发酵，生成含高活菌数、较高蛋白质和氨基酸含量的发酵产物，经真空包装形成集净化水质、抑制病原、修复肠道、保肝护肝、促进消化、防病促长等多功能于一体的半固体微生物制剂。本发明有效地将微生物制剂水剂、粉剂与多菌种的特点结合在一起，保存期长、活性高、携带方便，既可直接泼洒或拌料使用，也可经扩大培养后使用。

Description

一种水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，属于水产养殖技术领域。

背景技术

自1988年以来，中国的水产养殖产量已连续28年位居世界第一，成为了世界水产养殖的第一大国。目前中国主要的水产养殖模式是高密度池塘养殖，即以高密度投放苗种、大量施肥投饵而获得高产量的养殖模式。高密度的养殖方式，虽然提高了单位水体的养殖产量，但造成了养殖水体环境的恶化，从而引发相应的一系列问题。养殖水体环境中氮、磷猛增，有机污染严重，透明度下降，水质恶化，底质污染严重。水体环境中的污染因子不但直接危害水体中养殖生物的安全，同时可引起养殖生物的应激反应。应激反应可使环境或机体中有益菌和致病菌的微生态平衡失调，促使水产动物的摄食能力下降、生理功能紊乱，生长受限，并抑制动物的免疫功能，导致水产动物始终处于一种应激状态，逐渐感染疾病。因此从生态学角度来看，尽管养殖水体环境是一个极为复杂的水生生态系统，但不论其多复杂，主要是水生生物—病原—环境三者之间的平衡关系。养殖水体生态环境的控制和养殖生物病害的防控已成为发展我国水产养殖的关键问题。

目前在水产养殖环境和机体内环境的控制上，微生物制剂受到极大的关注。其安全性高、使用方便、成本低、控制效果好。从最初使用的光合细菌PSB、EM菌至当前使用较多的芽孢杆菌来看，微生物制剂的剂型有水剂和粉剂。这2类剂型各有特点也各存弊端。水剂型使用方便、效果好，但保存期短、运输携带不便；粉剂型体积小、保存期长，但使用前需活化，效果不稳定等等。而且不管是水剂或粉剂，其应用范围有一定的局限。有些微生的制剂应用于养殖环境的改良效果较好，而有些则侧重于养殖生物机体内环境的改善。因此构建一种使用方便、安全无害、兼具微生物制剂水剂与粉剂的诸多特点、净水和机体改良功能于一体，能在短时间内快速净化水质、恢复水产动物生理机能、提高免疫的半固体微生物制剂产品显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种水产养殖用半固体微生态制剂及其制备方法，利用五种不同类型的微生物菌种经合理组配，形成混合菌种，在以麸皮、次粉和酱油渣为基础的固体培养基中发酵，生成具一定的活菌数、氨基酸和水分的发酵产物，经真空包装形成可净化水质和修复机体内环境的半固体微生物制剂。该制剂可直接或经扩大培养后使用，投入养殖水体或添加于饲料中投喂，可有效地去除或转化养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮，抑制和拮抗弧菌等病原生物，减少养殖中后期有害物质的积累，提高养殖生物机体的免疫力，达到净水防病抗应激的目的，减轻病害所造成的经济损失，保证养殖产量和质量。

本发明的技术方案，一种水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，按重量份计：该微生态制剂为含水30%~35%的半固体制剂，由按液体菌比例，纳豆芽孢杆菌CICC 1045414~16份、乳酸杆菌CICC 21007 25~32份、醋化醋杆菌CICC 21684 13~17份、酿酒酵母CICC1005 25~30份和产阮假丝酵母CICC 1769 13~15份混合得到混合菌，在30~35℃发酵温度下以麸皮、次粉和酱油渣为基础制备的固体培养基上发酵80~120h，真空包装得到水产养殖用半固体微生态制剂。

所述的固体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：麸皮，粗蛋白含量≥15%，48~60份，次粉，粗蛋白含量≥15%，18~23份，酱油渣，粗蛋白含量≥12%，盐份≤6%，18~35份，于室温下混合均匀，于烘箱中100℃灭菌15min，冷却后备用。

水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，具体步骤如下：

（1）纳豆芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环纳豆芽孢杆菌（Basillus natto），CICC 10454，接种到30~100 mL灭菌的肉汤培养基中，于30~32 ℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，然后将其接入0.8~1 L经灭菌的肉汤培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养32~40 h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1；

（2）乳酸杆菌的培养：从试管斜面上取一环乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus），CICC 21007，接种到30~100 mL灭菌的MRS液体培养基中，于33~37 ℃静置培养32~40 h，然后将其接入0.8~1L经灭菌的MRS液体培养基中，于33~37℃静置培养32~40 h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1；

（3）酿酒酵母和产朊假丝酵母的培养：分别从试管斜面上取一环酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），CICC 1005和产朊假丝酵母（Candida utilis），CICC 1769，分别接种到30~100 mL灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，然后将其分别接入0.8~1L经灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30~32 ℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1；

（4）醋化醋杆菌的培养：从试管斜面上取一环醋化醋杆菌（Acetobacter aceti），CICC 21684，接种到30~100 mL灭菌的醋酸菌培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，然后将其接入0.8~1L经灭菌的醋酸菌培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

（4）混合菌的组合：按重量比，取上述培养至活菌浓度≥10⁹CFU·mL^-1的纳豆芽孢杆菌14~16份、乳酸杆菌25~32份、酿酒酵母25~30份、产朊假丝酵母13~15份和醋化醋杆菌13~17份，放入经灭菌的25 L桶中混合，备用；

（5）半固体微生物制剂的制备：在50kg的单向透气发酵袋中加入重量为20~30 kg、经100℃灭菌15min后冷却备用的固体发酵培养基，将步骤（4）所得混合菌种4~6L及无菌纯水5~8L加入固体培养基，搅拌均匀，于30~35℃恒温培养室中培养80~120h，待发酵物菌含量≥10⁹CFU·g^-1、水分含量30~35%时取出，即得水产养殖用半固体微生态制剂。

所述纳豆芽孢杆菌（Basillus natto），CICC 10454，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供菌株；乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus），CICC 21007，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供菌株；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），CICC 1005，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供菌株；产朊假丝酵母（Candida utilis），CICC1769，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的菌株；醋化醋杆菌（Acetobacter aceti），CICC 21684，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的菌株。

步骤（1）所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨8~12 g·L^-1，牛肉膏4~6 g·L^-1，NaCl4~6 g·L^-1，调节pH 7.0~7.2，经121℃灭菌20min后冷却备用。

步骤（2）所述的MRS液体培养基为，牛肉膏8~12 g·L^-1，蛋白胨8~12 g·L^-1，酵母膏4~6 g·L^-1，葡萄糖 4~6g·L^-1，柠檬酸二胺1~3 g·L^-1，吐温80 0~1g·L^-1，乙酸钠4~6g·L^-1，磷酸氢二钾1~3 g·L^-1，硫酸镁0.1~0.3g·L^-1、硫酸锰0~0.05g·L^-1，碳酸钙18~22 g·L^-1，调节pH 6~7，经121℃灭菌15min后冷却备用。

步骤（3）所述马铃薯葡萄糖培养基的制备过程如下：去皮马铃薯180~220g，切成小块，于1~1.2L纯水中煮沸18~22min，纱布过滤，滤液中加入15~20g葡萄糖，添加纯水至1L，调节pH 6~7左右，经115℃灭菌15min后冷却备用。

所述的醋酸菌培养基为，葡萄糖95~105 g·L^-1，酵母膏8~12 g·L^-1，碳酸钙 15~20 g·L^-1，调节pH 6~7，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

所述的单向透气发酵袋为常规设备，在市场上购买，无任何特殊要求，采用通常的加工方法。

所述的真空包装机为常规设备，在市场上购买，无任何特殊要求，采用通常的加工方法。

本发明中各组分的作用原理如下：

（1）纳豆芽孢杆菌：纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，通常为

（0.7-0.8）mm×(2.0-3.0) mm，革兰氏阳性，是一类好氧型、内生抗逆胞子的杆状细菌，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源胞子。孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌，在胃酸下四小时存活率为100%，同时具有强力的病原菌抑制能力，是各种益菌当中对环境耐受力最好的且可以直达小肠的菌种之一，口服后可改变人体肠道菌丛生态，帮助消化道机能正常化，以使排便顺畅，维持体内生理环保。可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫反应。并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料种某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率。本发明利用其菌体本身及生长中释放的有效成份，竞争水体营养，抑制病原微生物，净化养殖环境，提高养殖生物免疫力。

（2）乳酸杆菌：乳酸杆菌属乳酸杆菌科，因可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）并产生大量乳酸而命名。其存在广泛，嗜酸性，是无芽孢杆菌中是耐酸力最强的，生存最适pH为5.5～6.0，在pH 3.0～4.5的环境中仍然能生存，一般在厌氧条件下繁殖。乳酸杆菌是养殖生物和人类肠道等处重要的生理性菌群之一。该类群细菌绝大多数对动物和人类无毒、无害，负担着动物体内重要的生理功能，可阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体免疫力，促进消化，合成氨基酸和维生素，降低胆固醇，抑制内毒素的生产，延缓衰老和抗辐射等。本发明利用其生长转化环境污染物，并通过其分泌的乳酸抑制环境和机体中的病原微生物，促进肠道平衡，提高摄食率。

（3）酿酒酵母：酿酒酵母菌属于酵母菌科，是一种单细胞生物，成卵圆型或球型，繁殖方式为出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三种，形态简单但生理复杂，工业上用于酿酒。酵母菌将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。其富含维生素B、蛋白质和多种酶，可作为核酸类衍生物、辅酶A、细胞色素C、谷胱甘肽和多种氨基酸的原料，并可治疗消化不良。本发明利用其来提高发酵底物的蛋白含量，转化养殖环境中的有机物，促进生物的消化。

（4）产朊假丝酵母：产朊假丝酵母又叫产朊圆酵母或食用圆酵母，细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为（3.5～4.5）μm×（7～13）μm。能以尿素和硝酸作为氮源，在培养基中不需要加入任何生长因子即可生长。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，形成原始假菌丝或不发达的假菌丝，或无假菌丝；它能利用五碳糖和六碳糖，有氧条件下不产酒精。能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖和蜜二糖。不分解脂肪，能同化硝酸盐。其蛋白质和维生素B的含量都比啤酒酵母高，可生产出人畜可食用的蛋白质。本发明利用其转化底物中的营养物质，提高蛋白质含量。

（5）醋化醋杆菌：菌体细胞呈杆状，末端方，成短或长链，革兰氏阳性，无荚膜，运动。广泛存在于醋醪、饮料、水果、蔬菜及酸败的物质上，是重要的工业用菌之一，不但可以用于制醋、醋酸，同时还可生产葡萄糖酸、维生素C等。氧气充足条件下需氧呼吸产生醋酸，与酵母菌共生在一起培养有促进生长的作用，产生的醋酸可清理肠胃，帮助消化。本发明利用其转化底物，生成醋酸抑菌和助消化，消耗培养环境中的氧气，为乳酸菌生长提供条件，同时与酵母一共促生物生长。

（6）酱油渣：酱油渣是以大豆等植物为原料加工酱油后的副产品，是相关工业的主要废弃物。酱油渣本身为发酵产物，含粗蛋白质13.4%、粗脂肪13%、油脂含量20%，同时还富含有纤维、糖、磷脂等，营养较多丰富。但含有较多的盐份，约7~8%，故不易直接用来当作饲料。本发明利用其作为发酵底物，经与其它成分复配后可降低盐份，同时可提高其营养价值，实现酱油渣这类废弃物的资源化，减少环境污染。

（7）麸皮和次粉：麸皮为小麦最外层的表皮，是小麦加工面粉后得到的副产品。麸皮粗蛋白含量17.4%，主要是用作饲料，经济价值不高。但麸皮具有润肺、滋润皮肤，防癌抗癌，健脾和胃，乌发固发，清理肠胃等作用，具有很高的保健功能。次粉又称黑面、黄粉、下面或三等粉等，是小麦加工的一种副产物，是由小麦的种皮、果皮、糊粉层、胚以及部分胚乳组成，它的胚乳含量低于标准粉而高于麸皮，主要由糊粉层、外层胚乳和部分外皮所组成，富含膳食纤维、维生素、矿物质等，含有30%左右的淀粉，12-17%的蛋白质，营养非常丰富。一般而言，次粉量为小麦籽粒总量的4%。次粉中非淀粉多糖因含量较高，不宜被消化吸收，饲养效果较差。本发明以麸皮和次粉为主要发酵底物，利用其作为微生物生长的碳源和氮源，生产高含量的微生物菌制剂，同时将其营养因子提高和转化，适宜作为饲料添加使用。

本发明的有益效果：本发明以工农业生产的副产物麸皮、次粉和酱油渣为发酵底物，利用纳豆芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋化醋杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母等5株具不同性状和生态活性的微生物菌株进行混合发酵，生成含高活菌数、较高蛋白质和氨基酸含量的发酵产物，经真空包装形成半固体微生物制剂，集净化水质、抑制病原、修复肠道、保肝护肝、促进消化、防病促长等多功能于一体，可直接泼洒或拌料使用，也可经扩大培养后使用，使用量小，每亩水面每米水深的最小用量仅为0.1公斤，保存期长、活性高、携带方便，特别是将微生物制剂的水剂、粉剂与多菌种的特点有机地结合在一起；使用后可有效地去除或转化养殖水体中的有害物质，抑制和拮抗弧菌等病原生物，减少养殖中后期有害物质的累积，提高养殖生物肠道的消化功能，促进代谢，增强养殖生物机体的免疫力，保证养殖产量和质量。

具体实施方式

实施例1：一种水产养殖用半固体微生物制剂及其制备方法，采用以下工艺步骤：

（1）纳豆芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环纳豆芽孢杆菌（Basillus natto，CICC 10454，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50mL灭菌的肉汤培养基中，于30 ℃、120 r·min^-1摇床上培养24h。然后将其接入1L经灭菌的肉汤培养基中，于30℃、120 r·min^-1摇床上培养36h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨10 g·L^-1，牛肉膏5 g·L^-1，NaCl 5 g·L^-1 ，调节pH 7.0左右，经121℃灭菌20min后冷却备用。

（2）乳酸杆菌的培养：从试管斜面上取一环乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus，CICC 21007，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50 mL灭菌的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养36 h。然后将其接入1 L经灭菌的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养36 h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1。

所述的MRS液体培养基为，牛肉膏10 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，葡萄糖 5 g·L^-1，柠檬酸二胺2 g·L^-1，吐温80 1 g·L^-1，乙酸钠5 g·L^-1，磷酸氢二钾2 g·L^-1，硫酸镁0.2 g·L^-1、硫酸锰0.05 g·L^-1，碳酸钙20 g·L^-1，调节pH 6.5左右，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

（3）酿酒酵母和产朊假丝酵母的培养：分别从试管斜面上取一环酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ，CICC 1005，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）和产朊假丝酵母（Candida utilis，CICC 1769，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）的菌苔，分别接种到50mL灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30 ℃、120 r·min^-1摇床上培养24h。然后将其分别接入1L经灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30 ℃、120 r·min^-1摇床上培养24h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的马铃薯葡萄糖培养基为，去皮马铃薯200 g，切成小块，于1L纯水中煮沸20min，纱布过滤。滤液中加入20 g葡萄糖，添加纯水至1L，调节pH 6.5左右，经115℃灭菌15min后冷却备用。

（4）醋化醋杆菌的培养：从试管斜面上取一环醋化醋杆菌（Acetobacter aceti，CICC 21684，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）的菌苔，接种到50mL灭菌的醋酸菌培养基中，于30 ℃、120 r·min^-1摇床上培养24h。然后将其接入1L经灭菌的醋酸菌培养基中，于30 ℃、120 r·min^-1摇床上培养24h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的醋酸菌培养基为，葡萄糖100 g·L^-1，酵母膏10 g·L^-1，碳酸钙 20 g·L^-1，调节pH 6.8左右，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

（4）混合菌的组合：按重量比，取上述培养至活菌浓度≥10⁹CFU·mL^-1的纳豆芽孢杆菌14份、乳酸杆菌30份、酿酒酵母30份、产朊假丝酵母13份和醋化醋杆菌13份，放入经灭菌的25 L桶中混合，备用。

（5）半固体微生物制剂的制备：在50Kg的单向透气发酵袋中加入重量为25 Kg的固体发酵培养基（经100℃灭菌15 min后冷却备用），将上述混合菌种5L及无菌纯水6L加入固体培养基，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养室中培养100 h，待发酵物菌含量≥10⁹CFU·g^-1、水分含量32%时取出，用真空包装机制成重量为1Kg、体积为15cm×15cm×5cm的半固体微生物制剂，最后装箱入库。

所述的固体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：麸皮（粗蛋白含量≥15%）60份，次粉（粗蛋白含量≥15%）20份，酱油渣（粗蛋白含量≥12%，盐份≤6%）20份，于室温下混合均匀，于烘箱中100 ℃灭菌15 min，冷却后备用。

实施例2：一种水产养殖用半固体微生物制剂及其制备方法，采用以下工艺步骤：

（1）纳豆芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环纳豆芽孢杆菌（Basillus natto，CICC 10454，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50mL灭菌的肉汤培养基中，于32℃、125r·min^-1摇床上培养22h。然后将其接入1L经灭菌的肉汤培养基中，于32℃、125r·min^-1摇床上培养36h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨12g·L^-1，牛肉膏6g·L^-1，NaCl 5g·L^-1 ，调节pH 7.0左右，经121℃灭菌20min后冷却备用。

（2）乳酸杆菌的培养：从试管斜面上取一环乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus，CICC 21007，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50 mL灭菌的MRS液体培养基中，于35℃静置培养36h。然后将其接入1 L经灭菌的MRS液体培养基中，于35℃静置培养36h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1。

所述的MRS液体培养基为，牛肉膏12g·L^-1，蛋白胨12g·L^-1，酵母膏6 g·L^-1，葡萄糖 5g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温80 1g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙18g·L^-1，调节pH 6.6左右，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

（3）酿酒酵母和产朊假丝酵母的培养：分别从试管斜面上取一环酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ，CICC 1005，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）和产朊假丝酵母（Candida utilis，CICC 1769，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）的菌苔，分别接种到50mL灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于32℃、125r·min^-1摇床上培养22h。然后将其分别接入1L经灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于32℃、125r·min^-1摇床上培养22h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的马铃薯葡萄糖培养基为，去皮马铃薯210g，切成小块，于1.1L纯水中煮沸20min，纱布过滤。滤液中加入18g葡萄糖，添加纯水至1L，调节pH 6.5左右，经115℃灭菌15min后冷却备用。

（4）醋化醋杆菌的培养：从试管斜面上取一环醋化醋杆菌（Acetobacter aceti，CICC 21684，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）的菌苔，接种到50mL灭菌的醋酸菌培养基中，于32℃、125r·min^-1摇床上培养22h。然后将其接入1L经灭菌的醋酸菌培养基中，于32℃、125r·min^-1摇床上培养22h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1。

所述的醋酸菌培养基为，葡萄糖98 g·L^-1，酵母膏9 g·L^-1，碳酸钙 20 g·L^-1，调节pH 6.8左右，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

（4）混合菌的组合：按重量比，取上述培养至活菌浓度≥10⁹CFU·mL^-1的纳豆芽孢杆菌15份、乳酸杆菌27份、酿酒酵母28份、产朊假丝酵母15份和醋化醋杆菌15份，放入经灭菌的25 L桶中混合，备用。

（5）半固体微生物制剂的制备：在50Kg的单向透气发酵袋中加入重量为26 Kg的固体发酵培养基（经100℃灭菌15 min后冷却备用），将上述混合菌种5L及无菌纯水7L加入固体培养基，搅拌均匀，于32 ℃恒温培养室中培养120 h，待发酵物菌含量≥10⁹CFU·g^-1、水分含量35%时取出，用真空包装机制成重量为1Kg、体积为15cm×15cm×5cm的半固体微生物制剂，最后装箱入库。

所述的固体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：麸皮（粗蛋白含量≥15%）50份，次粉（粗蛋白含量≥15%）20份，酱油渣（粗蛋白含量≥12%，盐份≤6%）30份，于室温下混合均匀，于烘箱中100 ℃灭菌15 min，冷却后备用。

实施例3：一种水产养殖用半固体微生物制剂及其制备方法，采用以下工艺步骤：

（1）纳豆芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环纳豆芽孢杆菌（Basillus natto，CICC 10454，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到60mL灭菌的肉汤培养基中，于30℃、122r·min^-1摇床上培养 25h。然后将其接入1L经灭菌的肉汤培养基中，于30℃、122r·min^-1摇床上培养38h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨9g·L^-1，牛肉膏6g·L^-1，NaCl 5g·L^-1 ，调节pH7.0左右，经121℃灭菌20min后冷却备用。

（2）乳酸杆菌的培养：从试管斜面上取一环乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus，CICC 21007，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到60mL灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置培养35h。然后将其接入1L经灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置培养35h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1。

所述的MRS液体培养基为，牛肉膏9g·L^-1，蛋白胨11g·L^-1，酵母膏6g·L^-1，葡萄糖4g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温80 1g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙20g·L^-1，调节pH 6.5左右，经121℃灭菌15min后冷却备用。

（3）酿酒酵母和产朊假丝酵母的培养：分别从试管斜面上取一环酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ，CICC 1005，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）和产朊假丝酵母（Candida utilis，CICC 1769，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）的菌苔，分别接种到60mL灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30℃、122r·min^-1摇床上培养25h。然后将其分别接入1L经灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30 ℃、122r·min^-1摇床上培养25h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的马铃薯葡萄糖培养基为，去皮马铃薯195g，切成小块，于1L纯水中煮沸18min，纱布过滤。滤液中加入20g葡萄糖，添加纯水至1L，调节pH 6.5左右，经115℃灭菌15min后冷却备用。

（4）醋化醋杆菌的培养：从试管斜面上取一环醋化醋杆菌（Acetobacter aceti，CICC 21684，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供）的菌苔，接种到60 mL灭菌的醋酸菌培养基中，于30℃、122r·min^-1摇床上培养25h。然后将其接入1L经灭菌的醋酸菌培养基中，于30℃、122r·min^-1摇床上培养25h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1。

所述的醋酸菌培养基为，葡萄糖102g·L^-1，酵母膏11g·L^-1，碳酸钙 19g·L^-1，调节pH 6.8左右，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

（4）混合菌的组合：按重量比，取上述培养至活菌浓度≥10⁹CFU·mL^-1的纳豆芽孢杆菌16份、乳酸杆菌28份、酿酒酵母26份、产朊假丝酵母15份和醋化醋杆菌15份，放入经灭菌的25 L桶中混合，备用。

（5）半固体微生物制剂的制备：在50Kg的单向透气发酵袋中加入重量为24 Kg的固体发酵培养基（经100℃灭菌15 min后冷却备用），将上述混合菌种6L及无菌纯水6L加入固体培养基，搅拌均匀，于32 ℃恒温培养室中培养120 h，待发酵物菌含量≥10⁹CFU·g^-1、水分含量34%时取出，用真空包装机制成重量为1Kg、体积为15cm×15cm×5cm的半固体微生物制剂，最后装箱入库。

所述的固体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：麸皮（粗蛋白含量≥15%）55份，次粉（粗蛋白含量≥15%）20份，酱油渣（粗蛋白含量≥12%，盐份≤6%）25份，于室温下混合均匀，于烘箱中100 ℃灭菌15 min，冷却后备用。

本发明的使用效果如下：

1、应用于江苏吴江地区的加州鲈鱼养殖：江苏吴江地区的加州鲈鱼养殖池塘，面积20亩，水深2.5米，因大量投饲冰鲜饵料鱼，导致高温季节池塘水质过浓，水色不好，水质中氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等分别达到2.65mg·L^-1、0.55 mg·L^-1和0.36 mg·L^-1，超标严重。底质发黑发臭，影响鱼类的生长和摄食。在一晴天上午10点左右将按实例1配方的半固体微生物制剂应用于养殖池塘中，用量为100 g/亩·米水深，连用2天。用后3天起水色好转，透明度增大至40cm，底质臭味消失，水体中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢含量降至0.95mg·L^-1、0.15mg·L^-1和0.12mg·L^-1，鱼类活动恢复正常。

2、应用于广东地区的罗非鱼养殖：广东茂名地区的罗非鱼养殖塘，面积15亩，水深2.0米，夏季高温时池塘水质过浓，水色不好，水质中氨氮、亚硝酸氮分别达到 3.72mg·L^-1、0.45mg·L^-1，超标严重，水体中无乳链球菌达7.52×10⁵个·mL^-1，影响罗非鱼的生长。在一晴天上午10点左右将按实例2配方的半固体微生物制剂应用于养殖池塘中，用量为125 g/亩·米水深，连用2天。用后3天水色好转，由浓绿色转为浅黄绿色，透明度增大；水体中氨氮、亚硝酸氮含量降至1.02 mg·L^-1和0.11 mg·L^-1；无乳链球菌数量下降为6.5×10³个·mL^-1，罗非鱼摄食正常。

3、应用于江苏吴江地区的加州鲈鱼养殖：江苏吴江地区的加州鲈鱼养殖池塘，面积18亩，水深2.5米，因大量投饲冰鲜饵料鱼，导致高温季节池塘水质恶化，水质DO较低，最低时为3.8 mg·L^-1，鱼类反应迟钝,摄食减少，生长不良。将按实例3配方的半固体微生物制剂1Kg溶于含2Kg红糖的50L纯水中，于室温下扩大培养。4小时后按5%的添加量将扩培的菌液加入饲料中投喂加州鲈鱼，每天3次，连续5天。5天后DO升高至4.6 mg·L^-1，鱼类摄食和活动正常。

Claims

1.一种水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是按重量份计：该微生态制剂为含水30%~35%的半固体制剂，由按液体菌比例，纳豆芽孢杆菌CICC 10454 14~16份、嗜酸乳杆菌CICC 21007 25~32份、醋化醋杆菌CICC 21684 13~17份、酿酒酵母CICC 1005 25~30份和产阮假丝酵母CICC 1769 13~15份混合得到混合菌，在30~35℃发酵温度下以麸皮、次粉和酱油渣为基础制备的固体培养基上发酵80~120h，真空包装得到水产养殖用半固体微生态制剂。

2.如权利要求1所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是所述的固体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：麸皮，粗蛋白含量≥15%，48~60份，次粉，粗蛋白含量≥15%，18~23份，酱油渣，粗蛋白含量≥12%，盐份≤6%，18~35份，于室温下混合均匀，于烘箱中100℃灭菌15min，冷却后备用。

3.如权利要求1所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是具体步骤如下：

（1）纳豆芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环纳豆芽孢杆菌（Basillus natto ），CICC 10454，接种到30~100 mL灭菌的肉汤培养基中，于30~32 ℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，然后将其接入0.8~1 L经灭菌的肉汤培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养32~40 h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1；

（2）乳酸杆菌的培养：从试管斜面上取一环嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），CICC 21007，接种到30~100mL灭菌的MRS液体培养基中，于33~37 ℃静置培养32~40h，然后将其接入0.8~1L经灭菌的MRS液体培养基中，于33~37℃静置培养32~40h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1；

（3）酿酒酵母和产朊假丝酵母的培养：分别从试管斜面上取一环酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），CICC 1005和产朊假丝酵母（Candida utilis），CICC 1769，分别接种到30~100 mL灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30 h，然后将其分别接入0.8~1L经灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1；

（4）醋化醋杆菌的培养：从试管斜面上取一环醋化醋杆菌（Acetobacter aceti），CICC21684，接种到30~100mL灭菌的醋酸菌培养基中，于30~32℃、100~125 r·min^-1摇床上培养22~30h，然后将其接入0.8~1L经灭菌的醋酸菌培养基中，于30~32℃、100~125r·min^-1摇床上培养22~30h，制成菌种种子液备用，此时菌液的活菌数≥10⁹CFU· mL^-1；

4.如权利要求3所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是：所述纳豆芽孢杆菌（Basillus natto），CICC 10454，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供菌株；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），CICC 21007，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供菌株；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），CICC 1005，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供菌株；产朊假丝酵母（Candida utilis），CICC 1769，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的菌株；醋化醋杆菌（Acetobacter aceti），CICC 21684，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的菌株。

5.如权利要求3所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是：步骤（1）所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨8~12 g·L^-1，牛肉膏4~6 g·L^-1，NaCl 4~6 g·L^-1，调节pH7.0~7.2，经121℃灭菌20min后冷却备用。

6.如权利要求3所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是：步骤（2）所述的MRS液体培养基为，牛肉膏8~12 g·L^-1，蛋白胨8~12 g·L^-1，酵母膏4~6 g·L^-1，葡萄糖4~6g·L^-1，柠檬酸二胺1~3 g·L^-1，吐温80 0~1g·L^-1，乙酸钠4~6g·L^-1，磷酸氢二钾1~3g·L^-1，硫酸镁0.1~0.3g·L^-1、硫酸锰0~0.05g·L^-1，碳酸钙18~22 g·L^-1，调节pH 6~7，经121℃灭菌15 min后冷却备用。

7.如权利要求3所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是步骤（3）所述马铃薯葡萄糖培养基的制备过程如下：去皮马铃薯180~220 g，切成小块，于1~1.2 L纯水中煮沸18~22 min，纱布过滤，滤液中加入15~20 g葡萄糖，添加纯水至1L，调节pH 6~7左右，经115℃灭菌15min后冷却备用。

8.如权利要求3所述水产养殖用半固体微生态制剂的制备方法，其特征是：所述的醋酸菌培养基为，葡萄糖95~105 g·L^-1，酵母膏8~12g·L^-1，碳酸钙 15~20 g·L^-1，调节pH 6~7，经121℃灭菌15min后冷却备用。