CN106459883B

CN106459883B - 新颖根特节杆菌菌株

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Publication number: CN106459883B
Application number: CN201580029945.9A
Authority: CN
Inventors: 安格·皮若尔; 米歇尔·冯斯; 卡洛琳·米兰德; 埃斯特尔·德维兰蒂; 拉姆亚·哈亚特
Original assignee: Adisseo Ireland Ltd
Current assignee: Adisseo Ireland Ltd
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2035-06-17
Also published as: IL248746A0; DK3157946T3; FR3022256B1; US10357047B2; EP3157946B1; EP3157946A1; BR112016027618A2; US20170099858A1; AR100851A1; IL248746B; HUE042553T2; FR3022256A1; ES2712871T3; SI3157946T1; CN106459883A; WO2015193618A1; PL3157946T3

Abstract

本发明涉及对产气荚膜梭菌具有活性的根特节杆菌菌株，其选自以下菌株：2014年2月19日以编号DSM 28444提交DSMZ的AP1、2014年2月19日以编号DSM 28445提交DSMZ的AP2、2014年2月19日以编号DSM 28446提交DSMZ的AP3，或者2014年2月19日以编号DSM 28447提交DSMZ的AP4。

Description

新颖根特节杆菌菌株

技术领域

本发明涉及在动物饲料中且更特别对于鸡饲料具有作为益生菌的益处的新颖细菌菌株。

背景技术

有些细菌菌株具有释放对其竞争剂有抑菌或杀菌效果的物质的能力。这些抗微生物物质能够具有有机物性质，例如有机酸或过氧化氢(Ross等，Int.J.Food Microbiol.79,3-16,2002)，或者具有肽性质。而且，属于抗生素类的酶促合成抗微生物肽(Mootz等，Curr.Opin.Chem.Biol.1,543-551,1997；Keating等，Curr.Opin.Chem.Biol.3,598-606,1999),以及由核糖体途径产生的形成细菌素类的肽(Jacob等，Ann.Inst.Pasteur(巴黎)84,222-224,1953)是显著的。

细菌素在研究领域和工业领域引起了越来越大的兴趣；特别在畜牧业中，他们可能为抗生素应用提供替代的方案(Luchansky,Antonie Van Leeuwenhoek 76,335,1999；O'Sullivan等，Biochemistry 84,593-604.2002)。

在过去的几年里研发了这些细菌素的许多异源表达系统。具体而言，Morisset等(Morisset等，Appl.Environ.Microbiol.,70,4672-4680,2004)已经在肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种DSM20484中生产了肠膜菌素Y105变体，其为由肠膜明串珠菌肠膜亚种Y105产生的IIa类细菌素。同样地，Flynn等(Microbiol.,148,973-984,2002)在植物乳杆菌、乳酸乳球菌和蜡状芽孢杆菌宿主中实施了ABP-118基因，即原先由唾液乳杆菌唾液亚种UCC118产生的IIb类细菌素的表达。

此外，实施了多种试验以在大肠杆菌细菌(McCormick等，Appl.Environ.Microbiol.,64,4757-4766,1998；Garneau等，Appl.Environ.Microbiol.,69,1352-1358,2003；Biet等，Microbiol.,144,2845-2854,1998；Miller等，Appl.Environ.Microbiol.,64,14-20,1998；Richard等，J.Bacteriol.,186,4276-4284,2004；Kloche等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:532-538,2005)、酿酒酵母(Schoeman等，Yeast,15,647-656,1999；Van Reenen等，Int.J.Food Microbiol.,81,29-40,2003)，以及在乳酸菌(Rodriguez等，Int.J.Food Microbiol.,80,101-116,2003)中表达细菌素基因。

因而开展了许多工作，以鉴定新颖细菌素以及产生细菌素的新颖细菌菌株。

消化生态系统由丰富且非常复杂的、分组为细菌、酵母和古细菌的微生物群组成。这一微生物群本质上是厌氧的，并且主要发现的是类杆菌属、真细菌属、梭菌属、瘤胃球菌属、双歧杆菌属和梭形杆菌属细菌(Suau等，Appl.Environ.Microbiol.65,4799-4807,1999)。该微生物群对于宿主的健康具有重要影响。其具体参与源自食物的代谢化合物的毒化和解毒作用(Hughes and Rowland,Microbial Ecology Health Disease 2,179-185,2000)。其也能够调节肠细胞的功能表达(Bry等，Science 273,1380-1383.1996；Hooper等，Science 291,881-884.2001)。最后，其在保护宿主免受潜在外源致病菌侵染方面起到至关重要的作用(Ducluzeau等，Microbial Ecology and Intestinal Infections,1988.Fons等，Microbial Ecology in Health and Disease 2,240-246,2000)。

产气荚膜梭菌属于已知的肠病原菌，其为革兰氏阳性的严格厌氧菌，能够产生孢子并在环境中广泛分布。这一病原菌能够源自食物，但也能够在肠中以低浓度存在，并且响应应激效应开始增殖并分泌毒素。产气荚膜梭菌菌株根据其产生的毒素被归为5种毒素型(Petit等，Trends Microbiol.7,104-110,1999)。A型产气荚膜梭菌菌株是造成人类胃肠疾病的原因。1997年，美国报道了超过245,000例的产气荚膜梭菌感染病例。这导致41人住院治疗，其中7人死亡(Mead等，Emerg.Infect.Dis.5,607-625,1999)。A型和C型产气荚膜梭菌菌株分别是家禽和猪中引起坏死性肠炎的原因。在家禽中，坏死性肠炎是一种迅速发展的急性病理，其死亡率能够达到每天1至2％。除了其对于动物健康的影响以外，这种病理因此能够产生显著的经济影响。直至1999年，通过使用抗生素作为生长因子而使这种疾病得到很好的控制。但是，为避免选择抗性细菌以及因此避免降低抗生素在人类中的功效，欧盟在1999年部分禁止，然后在2006年完全禁止抗生素在动物饲料中的应用。由于该禁令，由产气荚膜梭菌在家禽和猪中引起的坏死性肠炎在欧洲不再受到控制。1999年和2000年报告给家禽饲养流行病学观察国家网络(RNOEA)(AFSSA Ploufragan)的病例数量显著增加(Valancony,Bulletin of GTV 12,9-12,2001)。

Dabard等(Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001)显示，分离自人的显性菌群的活泼瘤胃球菌El菌株能够产生被称为瘤胃球菌素A或RumaA的抗微生物物质，其积聚在培养上清液中。其涉及属于硫醚抗生素家族的细菌素，对梭菌的各种致病性菌株均有活性。活泼瘤胃球菌是一种严格厌氧菌,其属于在梭菌目中的毛螺菌科。

专利申请WO 2008/152252涉及活泼瘤胃球菌细菌菌株(以编号I-3705提交CNCM)，以及对产气荚膜梭菌具有抗菌活性的肽RumC1、RumC2和RumC3，以及编码这些肽的基因。

截至目前，以控制和治疗与产气荚膜梭菌增殖相关疾病为目的的对于替代解决方案的研究因而具有至关重要性。

本发明令人惊奇地允许鉴定对产气荚膜梭菌具有抗菌活性(作为细菌素)的新颖根特节杆菌菌株合成肽。

发明内容

本发明涉及对产气荚膜梭菌具有活性的根特节杆菌菌株，其选自：2014年2月19日以编号DSM 28444提交DSMZ的根特节杆菌AP1、2014年2月19日以编号DSM 28445提交DSMZ的根特节杆菌AP2、2014年2月19日以编号DSM 28446提交DSMZ的根特节杆菌AP3，或者2014年2月19日以编号DSM 28447提交DSMZ的根特节杆菌AP4。

在本发明的全文中，对产气荚膜梭菌的活性能够被定义为抑制靶细菌生长或发育的能力或者杀死靶细菌的能力。抗微生物活性的测量技术是本领域技术人员已知的。对产气荚膜梭菌的活性能够通过如下文实施例4中第4.3点或专利申请WO2008/152252中(且更具体在23和24页“2.对于液体样品的抗微生物活性测试”或第24页“3.对于在琼脂培养基中生长的菌落的抗微生物活性测试”)所描述的活性测试来定义：在本发明中，通过在琼脂培养基上培养的产气荚膜梭菌CpA菌株的抑制试验显示本例的抗微生物活性。将含有本发明的肽之一的样品放置于在琼脂培养基中形成的孔中。当在孔周围形成抑制孔环时，显示出抗微生物活性。

本发明也涉及对产气荚膜梭菌具有活性的化合物，所述化合物从选自2014年2月19日以编号DSM 28444提交DSMZ的根特节杆菌AP1、2014年2月19日以编号DSM 28445提交DSMZ的根特节杆菌AP2、2014年2月19日以编号DSM 28446提交DSMZ的根特节杆菌AP3，2014年2月19日以编号DSM 28447提交DSMZ的根特节杆菌AP4的细菌菌株分离。

在本发明的一个特定的实施方案中，所述肽具有选自SEQ ID No.1至SEQ IDNo.16的序列。

本发明也涉及这些具有抗微生物活性的肽的生物活性片段。术语肽的“生物活性片段”指包括其从中衍生的肽的部分但非全部以及保持了其从中衍生的多肽的抗微生物活性的肽。

具有序列SEQ ID No.1至SEQ ID No.16的肽的制备方法是本领域技术人员已知的。

这些肽的序列与以编号I-3705提交CNCM的活泼瘤胃球菌菌株的RumC肽具有高度同一性。用于测量和鉴定多肽之间的同一性程度和相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，通过Vector NTi 9.1.0比对程序AlignX(Clustal W算法)(InvitrogenINFORMAX,http://www.1nvitrogen.com)或利用CLUSTAW工具(http://www.eb1.ac.uk/clustalw/)进行序列比对。

本发明的肽通过细菌分泌(或释放)到胞外环境中。可能的是，任一种具有序列SEQID No.1至SEQ ID No.16的肽包含具有确定数目氨基酸的信号肽。在这种情况中，本发明也涉及信号肽切割之后得到的成熟肽。

在另一实施方案中，能够用异源信号肽置换SEQ ID No.1至SEQ ID No.16肽的潜在信号肽，以通过异源宿主生物进行该肽的表达和分泌。

根据本发明的肽可以从它们的自然环境分离或纯化。具体而言，可以从动物的盲肠和回肠微生物群以及特别是寄生根特节杆菌菌株的猪中分离他们。所述肽能够通过不同方法制备。具体而言，这些方法是从自然来源诸如自然表达这些肽的细菌纯化、通过合适的宿主细胞生产重组肽以及随后对其纯化、通过化学合成生产，或者最后将这些不同的方法组合。因此，本发明序列SEQ ID No.1至16的肽可以分离自下列菌株之一：以编号DSM 28444提交DSMZ的根特节杆菌AP1、以编号DSM 28445提交DSMZ的根特节杆菌AP2、以编号DSM28446提交DSMZ的根特节杆菌AP3，或者以编号DSM 28447提交DSMZ的根特节杆菌AP4。

在另一个实施方案中，本发明的肽分离自重组宿主生物，其表达根据本发明的化合物或者具有抗微生物活性的化合物的片段。

本发明也涉及包括根据本发明的肽的融合蛋白、重组蛋白或嵌合蛋白。

根据本发明的一个实施方案，所述肽适合用于营养或用于药剂，例如用于动物营养。

术语“适合用于营养或药剂的肽”是指其特征使得其适合于营养或药剂的肽。具体而言，用于营养或药剂的所述基本特征是所述肽能够抵抗的pH、对于胃部的酶的抵抗力，以及在生理温度下其活性的保持。实际上，动物和人类消化系统的一部分是酸性的，因此基本的是所述肽能够抵抗这种pH。用于营养的应用的另一个基本特征是温度，在该温度下抗微生物物质是有活性的。实际上，在药物、营养添加剂或动物饲料中形成抗微生物物质涉及例如处理和高于室温的温度。所使用的抗微生物的活性因此在工艺条件下特别是温度条件下必须是稳定的。所使用的抗微生物在生理温度下(37-41℃)也必须是有活性的。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的肽或肽混合物在中性pH下呈现抗微生物活性，并且在酸性PH下，例如低于7、优选低于4.4和具体在pH2时保留其抗微生物活性。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的肽或肽混合物在37℃呈现抗微生物活性，并且在低于和高于室温的温度下，例如在50℃以上保留这种活性。

本发明也涉及编码对产气荚膜梭菌具有活性的多核苷酸，其选自其序列由SEQ IDNo.17至SEQ ID No.32定义的多核苷酸、与根据序列SEQ ID No.17至SEQ ID No.32中任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸，或者编码如上文所定义的肽的多核苷酸。

根据本发明，术语“多核苷酸”是指可以为DNA或RNA形式的单链核苷酸链或其互补链，或者是可以为互补或基因组DNA形式的双链核苷酸链。优选地，本发明的多核苷酸具有DNA，特别是双链DNA形式。术语“多核苷酸”还表示修饰的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以从它们的自然环境分离或纯化。本发明的多核苷酸也可以通过化学合成制备，或通过由萨姆布鲁克、弗里奇和曼尼阿蒂斯在其名称为“分子克隆实验手册”(版本：冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)的书中描述的常规分子生物学技术制备。

本发明也涉及能够与根据序列SEQ ID No.17至SEQ ID No.32中的任一种的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。

在本发明的全文中，选择性杂交在适度严格条件下进行并且优选在高度严格条件下进行。根据本发明，术语“能够选择性杂交的序列”是指与参考序列杂交的水平显著高于背景噪声的序列。能够选择性杂交的序列与参考序列之间相互作用产生的信号水平通常比产生背景噪声的其它DNA序列的相互作用产生的信号强10倍，优选强100倍。允许选择性杂交的严格杂交条件是本领域技术人员已知的。一般而言，在特定的pH以及特定的离子强度下，杂交和洗涤温度比参考序列的Tm低至少5℃。通常，对于15至50个核苷酸的多核苷酸，杂交温度是至少30℃，并且对于大于50个核苷酸的多核苷酸，杂交的温度是至少60℃。例如，在下述缓冲液中进行杂交：6X SSC、50mM Tris-HCI(pH 7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％聚蔗糖、0.02％BSA，500μg/ml变性鲑精DNA。洗涤例如在2X SSC，0.1％SDS缓冲液中在低严格性下，在0.5X SSC，0.1％SDS缓冲液中在中等严格性下，以及在0.1X SSC、0.1％SDS缓冲液中在高严格性下连续进行。当然，杂交可以按照本领域技术人员已知的其它普通方法进行(特别参见萨姆布鲁克、弗里奇和曼尼阿蒂斯名称为“分子克隆实验手册”(版本：冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)的书)。优选地，与参考多核苷酸选择性杂交的多核苷酸保留参考序列的功能。在本情况中，选择性地与根据序列SEQ ID No.17至SEQ ID No.32中任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸编码抗微生物活性。

本发明一般涉及编码本发明的肽的多核苷酸。由于遗传密码的简并性,不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。

本发明还涉及表达盒，其特征在于其在转录方向上包括在宿主生物中起作用的启动子、如上文所定义的多核苷酸和在所述宿主生物中起作用的终止序列。

本发明进一步涉及载体，其包含如上文所定义的多核苷酸和/或如上文所定义的表达盒。

本发明还涉及用于宿主生物转化的克隆或表达载体，其包含根据本发明的至少一种多核苷酸或表达盒。这种载体特别是可以对应于质粒、粘粒、噬菌体或病毒，根据本发明的多核苷酸或表达盒被插入其中。用于构建这些载体以及将本发明的多核苷酸插入这些载体中的技术是本领域技术人员已知的。一般而言，能够在宿主细胞中维持、自主复制或传播以便特别是诱导多核苷酸或肽的表达的任何载体都能够被使用。本领域技术人员将根据待被转化的宿主生物并且依据所应用的转化技术，选择合适的载体。

本发明的载体被特别用于转化宿主生物，目的在于在该宿主生物中复制载体和/或表达根据本发明的肽。

本发明还涉及用于制备根据本发明的肽的方法，其包括下述步骤：

-用包括根据本发明的表达盒的表达载体和/或用根据本发明的多核苷酸转化宿主生物，

-分离由宿主生物产生的肽。

本发明还涉及用如上文所定义的多核苷酸转化的宿主生物、如上文所定义的表达盒，和/或如上文所定义的载体。

本发明还涉及一种通过将根据本发明的至少一种多核苷酸、至少一种表达盒或至少一种载体整合到所述宿主生物中而转化宿主生物的方法。多核苷酸可以被整合到宿主生物的基因组中，或者以稳定形式在宿主生物中复制。转化宿主生物的方法是本领域技术人员已知的并且在文献中广泛描述。

根据本发明，“宿主生物”具体而言是指任何低等或高等的单细胞或多细胞生物体，特别地选自细菌、酵母和真菌。具体而言，“宿主生物”是指非人生物体。有利地，酵母选自例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、耶罗维亚酵母和许旺酵母。真菌例如选自曲霉属、木霉属和青霉菌,优选选自绳状青霉菌、里氏木酶、黑曲霉素、泡盛曲霉、白曲霉和康宁木霉。在本发明的一个实施方案中,宿主生物是绳状青霉菌的菌株,其中根据本发明的肽被表达或过量表达。在另一实施方案中，宿主生物是卡氏德巴利酵母的菌株，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。在又一实施方案中，宿主生物是肠杆菌科或棒状杆菌类的菌株，并且更具体的是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。

用于构建载体、转化宿主生物以及在这些生物体中表达异源蛋白质的技术被广泛描述于文献中，特别是在萨姆布鲁克、弗里奇和曼尼阿蒂斯的名称为“分子克隆实验手册”(版本：冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)的书中，或者在奥苏伯尔(Ausubel)等的名称为“最新分子生物学方法”(版本：格林出版联合公司(Greene PublishingAssociates，Inc)和约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，纽约，1992)的书中。

本发明也涉及根据本发明的具有抗微生物活性的肽的制备方法，所述方法包括下述步骤:

-在诱导肽表达的条件下，培养根特节杆菌菌株或根据本发明的转化宿主生物，和

-回收包括所述肽的培养上清液(或发酵液)。

肽从培养上清液分离可以通过电荷、大小和/或疏水性进行。本领域技术人员知晓依照培养基不同组成的电荷、大小和/或疏水性而分离的不同技术。

这种培养上清液或发酵液然后可以被浓缩或冻干以配制食品添加剂或动物饲料。该过程可以包括从培养上清液中提纯抗微生物物质的额外步骤。

如果宿主生物不在培养基质中分泌抗微生物物质，则可能必需破碎细胞和纯化细胞提取物的额外步骤。

本发明还涉及一种组合物，其包括如上文所定义的肽、如上文所定义的宿主生物、如上文所定义的菌株、如上文所定义的宿主生物的发酵液，或者如上文所定义的菌株的发酵液。根据本发明的一个实施方案，所述组合物以液体形式存在或者以粉末形式存在。

这些组合物包括不同成分。以液体液体形似存在时，他们可以包括例如另一种抗微生物剂，例如山梨酸或山梨酸盐、苯甲酸或苯甲酸盐，富马酸或富马酸盐。本发明的组合物也可以进一步包括山梨糖醇。山梨糖醇是稳定剂和配制剂。本发明的组合物还可以包括防冻剂，例如乙二醇、甘油、丙二醇和1,2_丙二醇。

本发明的组合物包含至少一种根据本发明的肽，但还可以包含其它物质，诸如维生素、其它活性成分、氨基酸或矿物盐。

以粉末形式存在的组合物包括支持物。这种支持物能够选自小麦面粉、淀粉、糊精、石膏和玉米芯。

根据本发明的组合物具有抗微生物活性。它们对抗生素应用提供可选方案。它们能够用于例如动物饲养或用作人类药物。

本发明还涉及营养添加剂，其包括如上文所定义的肽、如上文所定义的宿主生物、如上文所定义的菌株、如上文所定义的宿主生物的发酵液，或者如上文所定义的发酵液。根据本发明的一个实施方案，所述添加剂以液体形式存在或者以粉末形式存在。

本发明还涉及动物饲料，其特征在于其包括用于动物的营养基和如上文所定义的营养添加剂。

这种食物通常以粉或颗粒的形式存在，其中掺入具有抗微生物活性的组合物。

在本发明的全文中，术语“饲料”是指能够用作动物食物的一切物质。“营养基”是指组成动物食物配给量的主要部分的一切物质,以举例的方式,其由谷类、蛋白质和动物和/或植物来源的脂肪的混合物组成。通常，这些营养基包括例如玉米、小麦和大豆。这些营养基适应其预期应用的不同动物种类的需求。其例如可以包括家禽(蛋鸡、肉鸡、火鸡和鸭子)或猪(生长肥育猪、小猪、母猪)。

本发明涉及如上文所定义的至少一种肽、如上文所定义的菌株的至少一种发酵液和/或宿主生物的至少一种发酵液，和/或如上文所描述的至少一种菌株或宿主生物的用途，其用于制备营养添加剂、食物或药物。

根据本发明的肽、如上文所定义的菌株或宿主生物的发酵液、如上文所定义的菌株或宿主生物能够被用作药物。

根据本发明的肽、如上文所定义的菌株或宿主生物的发酵液、如上文所定义的菌株或宿主生物能够被用于预防或治疗人类的胃肠疾病。

具体而言，根据本发明的肽、如上文所定义的菌株或宿主生物的发酵液、如上文所定义的菌株或宿主生物能够被用于预防和/或治疗肠道菌群失调，特别是单胃动物(特别是家禽或猪)中的坏死性肠炎。

本发明还涉及如上文所定义的至少一种肽、如上文所定义的菌株或宿主生物的至少一种发酵液，和/或至少一种菌株或宿主生物，根据本发明的营养添加剂或如上文所描述的食物的用途，其用于改善动物(特别是小鸡)的生长性能。

本发明还涉及如上文所定义的至少一种肽、根据本发明的菌株的至少一种发酵液和/或如上文所定义的宿主生物的发酵液，和/或根据本发明的至少一种菌株和/或宿主生物，和/或根据本发明的营养添加剂,和/或如上文所描述的食物的用途，其用于改善养殖动物的畜产性能。

在本发明的全文中，改善养殖动物的畜产性能包括但不限于动物增重、耗量系数降低、发病率和死亡率降低、动物同质性、屠宰率/产肉量改善、营养物质的消化率改善、动物免疫状态改善、病原体(产气荚膜梭菌、艰难梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌)感染的消极影响减少，甚或营养物质的利用改善，并从而减少废物排泄。

附图说明

图1：通过PCR检测rumC1基因。

图2：通过AP1、AP2、AP3和AP4菌株的脉冲场凝胶电泳获得的的染色体图谱。

图3：AP1、AP2、AP3和AP4菌株在食物中的存活百分比。

图4：在存在或不存在IL1下与细菌接触后，在Caco-2细胞培养上清液中通过ELISA检测白介素IL8。

图5：细菌培养上清液对产气荚膜梭菌菌株的活性测试。

图6：进行如下第一预纯化步骤之后的抗产气荚膜梭菌活性：在Sep-Pak柱上使用40％乙腈(ACN，参见WO2008/152252)洗脱纯化上清液。

具体实施方案

将通过下述实施例阐述本发明。

实施例1：分离rumC+细菌菌株

从猪的盲肠和回肠微生物群中搜索携带rumC-样基因的可培养菌株。

在第一阶段，将细菌培养在下述培养基中：

-M17:促进乳酸球菌生长

-LB:允许芽孢杆菌和肠球菌生长

-BEA:反向筛选类杆菌属组群的培养基

然后根据克隆抑制产气荚膜梭菌生长的能力对其进行筛选。从而通过PCR显示rumC基因的存在(图1)。

表1：用于扩增不同的靶DNA片段的引物列表

保留四种菌株：AP1、AP2、AP3和AP4。

实施例2：鉴定保留的菌株

2.1rDNA 16S

使用保守引物(16F8:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3'(SEQ ID No.39)和16R1541:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(SEQ ID No.40))通过PCR扩增编码rRNA 16S的基因片段(大约1550bp)(在大肠杆菌编号系统中对应于位置8-1541)，然后测序。

使用“BLAST”类型的序列同源性研究程序，在数据库中对获得的序列进行比对。

菌株AP1(SEQ ID No.)＝>与根特节杆菌R 5812具有99.45％同一性

菌株AP2(SEQ ID No.)＝>与根特节杆菌R 5812具有99.37％同一性

菌株AP3(SEQ ID No.)＝>与根特节杆菌R 5812具有99.44％同一性

菌株AP4(SEQ ID No.)＝>与根特节杆菌R 5812具有99.31％同一性

2.2.PFGE鉴定

属于节杆菌属的菌株AP1、AP2、AP3和AP4在基因水平上必然存在遗传分化。用于在种内水平鉴定细菌菌株的参照技术主要是通过脉冲场凝胶电泳组建他们的染色体图谱(图2)(LR251012号分析报告-Biocéane)。

AP3和AP4菌株表现同一。但是，rumC基因的测序，以及他们的简化肽序列似乎以此部分表明AP3和AP4是两种不同的菌株(参见实施例4，第4.2点)。

实施例3：菌株的表征

3.1对于pH和对于胆酸盐的抵抗性

对菌株进行两种处理，以确定他们对于酸度和对于胆酸盐的抵抗性。

-酸度：0.85％NaCl缓冲液，pH2，包含胃蛋白酶(1mg/mL)。

-胆酸盐等渗缓冲液(1.24％K₂HPO₄，0.76％H₂PO₄，0.1％柠檬酸三钠，0.6％[NH₄]₂SO₄，pH6.7)，包含0.2％胆酸盐(50％胆酸钠，50％脱氧胆酸钠)。

表2：不同菌株的存活百分比

BS：胆酸盐；ND：未确定

AP4菌株能够更好地抵抗模拟胃部基质的条件。一般而言，所有菌株对于胆酸盐更敏感，但是，除了AP1菌株之外，其他菌株存活量足够。

3.2发酵参数

对于在BHI-YH中半厌氧生长之后获得的培养上清液，检测他们的发酵参数(活体内分析实验室)。

表3：检测发酵参数

正如预期的，评估节杆菌菌株的发酵参数是有难度的。培养条件使得无法阐明通过发酵产生的任何代谢产物的生产。也检查了丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的存在情况。但是，在我们的培养条件下，四种菌株中没有任何一种表现多产。

3.3测试存活温度

菌株对高温敏感。实际上，70℃以上没有任何一种菌株能存活。

根据这些结果，在成粒期间几乎不可能再添加这些菌株了。

3.4测试在水和食物中存活

节杆菌菌株AP4在水中存活非常良好(下文表4)。看上去它似乎能够在这些条件下生长。实际上，在水中若干天后，细菌群体加倍。

表4：在水中存活的百分比

	D1	D2	D3	D4	D7
						AP4	134％	144％	130％	166％	206％

在食物中，群体甚至在21天后仍保持相对稳定(图3)。根据这些结果，在饮用水中以及在食物中添加所述菌株是可能的。

3.5抗炎潜能

通过在存在或不存在IL1(炎症诱导分子)的情况下与细菌接触之后的Caco-2细胞(肠细胞系)培养上清液中由ELISA检测白介素IL8而评估炎症曲线的调节状况。

针对培养在培养孔中的细胞上清液获得这些结果。所述细菌不表现促炎症活性(不存在IL1时IL8分泌低)，也不表现抗炎症活性(IL1存在时IL8的量与对照相同)。

这些结果通过使用AP4菌株以及培养在滤膜上的Caco-2细胞得到重复。在这种情况下，这一菌株具有促炎症活性。

3.6酶活曲线

API ZYM系统是研究酶活性的一种半定量方法。使用高浓度细菌悬液接种测试酶样。

表5：Api Zym试验条的读数结果

I:第一次检测；II:第二次检测

不论使用何种菌株，有些活性能够毫无疑问地被检测到。酯酶、酯酶脂肪酶、亮氨酸氨基肽酶、缬氨酸氨基肽酶和酸性磷酸酶属于这种情况。有些活性看上去不是非常稳定，诸如亮氨酸氨基肽酶。

例如，AP1菌株在利用麦芽糖和岩藻糖时呈现与其他节杆菌不同的曲线。

3.7对抗生素的抵抗性

第一个检测在实验室中进行。使用抗生素扩散纸片(BBL^TM Sensi-Disc^TM敏感性测试纸片)进行抗微生物敏感性测试。

所测试抗生素以以下的量使用：杆菌肽10μg，红霉素15μg，青霉素10μg，氨苄青霉素10μg，万古霉素30μg，链霉素300μg，氯霉素30μg，环丙沙星5μg，磷霉素200μg，利福霉素25μg，和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑1.25μg/23.75μg。将抗生素敏感性测试的结果用读数盘处理，以确定菌株相对于所测定抑菌圈直径的敏感水平。

所述四种节杆菌菌株对所测试的所有抗生素敏感。

表6：对抗生素的敏感性

	AP1	AP2	AP3	AP4
					氨苄青霉素	S	S	S	S
红霉素	S	S	S	S
					庆大霉素	S	S	S	S
卡那霉素	S	S	S	S
					链霉素	R	R	R	R
四环霉素	R	S	S	S
					氯霉素	R/S	R/S	S	S
万古霉素	S	S	S	S
					环丙沙星	ND*	ND*	ND*	ND*
利奈唑酮	ND*	ND*	ND*	ND*
					克林霉素	R	S	S	S
泰乐菌素	ND*	ND*	ND*	ND*

*ND：由于缺乏折点而未确定。

根据这些测试，所有的菌株都对链霉素敏感。菌株AP1是最敏感的菌株。

3.8粘附性测试

对Caco-2细胞(上皮细胞系)评估细菌粘附性。

表7：细菌数和粘附率

菌株	CFU<sub>I</sub>	CFU<sub>A</sub>
			AP1	4.90.108	1.50.103
AP2	1.50.109	3.00.103
			AP3	1.75.108	6.00.103
AP4	1.42.109	3.00.104

CFU_I：初始计数 CFU_A：粘附后计数

尽管粘附性低，但我们的所有菌株对于肠细胞均有粘附性。菌株AP3和AP4似乎更有效地粘附。

实施例4：概念验证

4.1菌株无害性

在第一步中，通过电子显微镜观察细菌，以核查不存在与病原性相关联的形态特征。

细胞的形态是多变的(球形棒状)，这与节杆菌属的特征相符。细胞不具有鞭毛和菌毛。

在第二步中，建立体内测试。将10⁷细菌通过灌胃投予无菌小鼠(每种菌株3只动物)。每日投予共5日，进行排泄物采样。通过光学显微镜分析这些排泄物，以确认在至少4天期间存在细菌，证明他们存活于消化道中。应该注意不发生死亡、肠损伤和临床信号(虚脱、腹泻……)的情况。这些结果支持针对Caco-2细胞系的实验结果(不存在裂解或细胞分离)。

4.2rumC基因测序

将我们菌株中存在的不同rumC-样基因的序列与活泼瘤胃球菌E1菌株的序列进行对比(参见附录)。

表8：rumC-样基因相对于活泼瘤胃球菌E1基因的鉴定百分比(下表中的序列的标识符对应于在AP1至AP4菌株中鉴定的序列)

基因的保守性因菌株而异。rumC1基因是较为保守的一个基因。一般而言，rumC4基因和rumC5基因分歧较大，甚至分歧过大，以至于针对AP3和AP4菌株无法测序。

通过比较推算肽序列进行了相同的分析(参见附录)。

表9：推算的肽序列相对于活泼瘤胃球菌E1的鉴定百分比(下表中的序列的标识符对应于在AP1至AP4菌株中鉴定的序列)

一般而言，能够得出相同的结论。推算序列的同一性比基因的同一性低。在有些情况下，肽序列太分散(或者被截断，参见附录)，以至于无法确认活性(例如，RumC2_AP3和RumC4_AP1)。

4.3活性测试

使用细菌培养上清液进行针对产气荚膜梭菌菌株的活性测试。

所述四种菌株具有抗-产气荚膜梭菌活性(图5)。为了限制有机酸的作用，在测试之前中和上清液。进行两组测试，以确认对产气荚膜梭菌的抑制是由于“RumC-样”活性的观点。在第一步中，测试之前将上清液在95℃加热10分钟。与RumC的情况类似，活性是保守的。在第二步中，进行第一预纯化步骤(参见WO 2008/152252)：在Sep-Pak柱上用40％乙腈(ACN，图6)纯化上清液。在这种情形下，活性也被鉴定。

4.4体内评估节杆菌的抑制特性

在被称为“竞争性饮食”的条件下评估AP3和AP4菌株对于肉鸡生长性能(增重、耗量和耗量系数)的影响。这种饮食是以玉米为基础的、含有标准蛋白含量(23％)的饮食，喂食14天后接着给予高蛋白质(26％蛋白质)、以小麦和大麦为基础从而富含纤维的饮食，喂食14-35天。这种竞争性饮食与表10中的“对照饮食”相对应。

从第一天开始，以允许每只动物每天吸收10⁸CFU的浓度将AP3和AP4菌株喷到饲料上，并照此贯穿整个检测期间，即35天。这些饮食分别对应于表10中列出的“AP3”和“AP4”。

饮食“林可霉素(8.8％)”对应于添加高达8.8％的林可霉素的挑战性饮食(即，每吨饲料5.25g)。

针对每15只一批的鸡进行这四种处理，重复12次(即，总共720只鸡)。

表10：体内结果

ET：标准偏差；IC:耗量系数(增加1kg体重所需要消耗的饲料，IC＝耗量/增重)；％：与对照相比提高的百分比；耗量：整个检测过程中动物的饲料耗量。

所测试的两种菌株AP3和AP4对于肉鸡的生长性能具有类似的积极效应。鉴于体重增加并且耗量降低两方面的原因，他们允许耗量系数增加7％至8％。

序列表

<110> 安迪苏法国联合股份有限公司

<120> 新颖根特节杆菌菌株

<130> BR079715

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 1

Met Asn Ile Ile Ala Thr Tyr Gln Ser Leu Lys Glu Asn Gln Asn Gln

1 5 10 15

Asp Tyr Thr Pro Arg Leu Phe Val Phe Ala Gly Lys Ala Val Ala Asn

20 25 30

Ser His Asn Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Asn

35 40 45

Gly Val Val Thr Arg Asn Ala Asn Ala Asn Val Ala Lys Thr Ala

50 55 60

<210> 2

<211> 64

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 2

Met Arg Lys Ile Val Ala Gly Lys Leu Gln Thr Gly Ala Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Ser Lys Gly Gly Cys Lys Cys Ser Gly Gly Ala Val Val Glu Asn

20 25 30

Ser His Asn Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Asn

35 40 45

Gly Gly Asp Asn Lys Lys Cys Glu Cys Tyr Ser Cys Lys Asn Lys Ile

50 55 60

<210> 3

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 3

Met Lys Leu Val Glu Thr Lys Thr Thr Lys Thr Gly Thr Asn Phe Glu

1 5 10 15

Gly Asn Arg Ala Gly Cys Ile Cys Asn Gly Thr Val Ala Val Ala Asn

20 25 30

Ser His Asn Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Ser

35 40 45

Gly Val Val Thr Arg Asn Ala Asn Ala Asn Val Ala Lys Thr Ala

50 55 60

<210> 4

<211> 52

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 4

Trp Lys Leu Asn Met Ser Asp Thr His His Phe Glu Glu Gly Lys Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Gly Arg Val Thr Asn Arg Gly Glu Thr Ile Ile Met Val

20 25 30

Phe Arg Cys Trp Val Glu Cys Gly Pro Ser Asn Tyr Gln Lys Ser Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Glu

50

<210> 5

<211> 52

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 5

Lys Asn Cys Glu Arg Thr Leu Ile Ser Lys Glu Arg Leu Asp Val Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Phe Leu Arg Gly Val Cys Arg Asn Pro Asn Ser Asn Lys

20 25 30

Pro Gly Val Leu Val Val Trp Phe Trp Gly Glu Phe Gly Glu Pro Thr

35 40 45

Arg Asn Asp Met

50

<210> 6

<211> 64

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 6

Met Arg Lys Ile Val Ala Gly Lys Leu Gln Thr Gly Ala Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Ser Lys Trp Gly Cys Val Cys Ser Gly Ser Thr Ala Val Ala Asn

20 25 30

Ser His Asn Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Thr Arg Asn

35 40 45

Asn Gly Val Val Thr Arg Asn Ala Asn Ala Asn Val Ala Lys Thr Ala

50 55 60

<210> 7

<211> 65

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 7

Met Arg Ser Ile Glu Glu Cys Met Glu Thr Trp Ile Leu Glu Cys Arg

1 5 10 15

Gly Ser Gly Leu His Val Arg Asn Ala Lys Tyr Gly Arg Thr Pro Val

20 25 30

Ala Lys Ala Ala Val Gly Leu Tyr Arg Glu Ala Arg Lys Ser Gly Gln

35 40 45

Thr Gly Leu Asp Thr Val Gly Asn Ala Asn Ala Asn Leu Ala Arg Thr

50 55 60

Lys

65

<210> 8

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 8

Met Lys Leu Val Gly Gly Phe Pro Pro Gln Ala Ala Ala Ser Ile Lys

1 5 10 15

His Leu Gln Gly Ser Met Ala Ala Arg Thr Gln Arg Lys Arg Gly Leu

20 25 30

Leu Cys Gly Glu His Trp Ile Arg Pro Arg Arg Ser Phe Gln Leu Gln

35 40 45

Phe Gly Val Met Met Gln Ala Val Gln Lys Ser His Asn Gln Pro

50 55 60

<210> 9

<211> 56

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 9

Val Arg Glu Ala Leu His Ile Ala Ser Thr Phe Arg Arg Thr Gln Ala

1 5 10 15

Val Phe Ala Ala Asp Cys Arg Leu Glu Ile Leu Ile Met Gln Asp Gln

20 25 30

His Ile Val Leu Gly Met Val Glu Arg Trp Ala Val Thr Arg Asn Gln

35 40 45

Asn Tyr Thr Leu Glu Gln Arg Ser

50 55

<210> 10

<211> 53

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 10

Leu Gly Thr Ala Lys Pro Ile Lys Thr Gln Asn Asn Phe Glu Gly Asn

1 5 10 15

Gly Ala Gly Cys Phe Cys Gly Gly Ser Val Ala Ile Gln Ile Leu Ile

20 25 30

Ser Arg Glu Phe Leu Leu Cys Gly Phe Gly Gly Asn Leu Gly Asn Gln

35 40 45

Pro Ala Met Ile Cys

50

<210> 11

<211> 61

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 11

Met Arg Lys Ile Val Ala Gly Lys Leu Gln Thr Gly Ala Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Ser Lys Trp Trp Met Met Gln Trp Arg Cys Ser Ser Arg Asn Ser

20 25 30

His Asn Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Leu Glu Met Leu Met Gln Met Ser Gln Lys Arg His

50 55 60

<210> 12

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 12

Met Arg Lys Ile Val Ala Gly Lys Leu Gln Thr Gly Ala Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Ser Arg Ser Gly Cys Val Cys Ser Gly Ser Ala Ala Val Ala Ser

20 25 30

Ser His Tyr Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn His

35 40 45

Gly Ala Val Thr Arg Asn Ala Asn Tyr Asn Leu Ala Lys Lys Asn

50 55 60

<210> 13

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 13

Met Lys Leu Val Glu Thr Lys Thr Thr Lys Thr Gly Thr Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Asn Arg Ala Gly Cys Ile Cys Asn Gly Thr Val Ala Val Ala Asn

20 25 30

Ser His Tyr Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Ser

35 40 45

Gly Val Val Thr Arg Asn Ala Asn Ala Asp Leu Ala Arg Thr Ala

50 55 60

<210> 14

<211> 62

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 14

Met Ser Asn Ile Leu Ala Gly Lys Leu Gln Thr Gly Ala Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Ser Lys Trp Gly Cys Val Cys Ser Gly Ser Thr Ala Val Ala Asn

20 25 30

Ser His Asn Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Asn

35 40 45

Gly Val Ser Asp Lys Cys Cys Lys Cys Arg Lys Asn Gly Asn

50 55 60

<210> 15

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 15

Met Arg Lys Ile Val Ala Gly Lys Leu Gln Thr Gly Ala Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Ser Arg Ser Gly Cys Val Cys Ser Ala Ser Ala Ala Val Ala Ser

20 25 30

Ser His Tyr Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Arg

35 40 45

Gly Ala Val Thr Arg Asn Ala Asn Tyr Asn Leu Ala Lys Lys Asn

50 55 60

<210> 16

<211> 63

<212> PRT

<213> 根特节杆菌

<400> 16

Met Lys Leu Val Glu Thr Lys Thr Thr Lys Thr Gly Thr Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly Asn Arg Ala Gly Cys Ile Cys Asn Gly Thr Val Ala Val Ala Asn

20 25 30

Ser His Tyr Ala Gly Pro Ala Tyr Cys Val Gly Tyr Cys Gly Asn Ser

35 40 45

Gly Val Val Thr Arg Asn Ala Asn Ala Asp Leu Ala Arg Thr Ala

50 55 60

<210> 17

<211> 192

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 17

ttgaacatta ttgccactta tcaatcattg aaagagaacc agaaccaaga ctacacacca 60

cgcttgttcg tctttgccgg taaagcagta gcaaactctc ataatgcagg accggcgtat 120

tgcgtaggat actgtggaaa caacggagta gtgactagaa atgctaatgc aaatgtcgca 180

aaaacggcat aa 192

<210> 18

<211> 193

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 18

atgagaaaaa tcgtagcagg aaagttacag acaggagcag actttgaagg cagcaaaggt 60

ggatgtaaat gcagtggcgg tgcagtagta gaaaactctc ataatgcagg accagcgtat 120

tgcgtgggat actgtggaaa caacggagga gataacaaga aatgcgaatg ctattcttgc 180

aagaacaaaa taa 193

<210> 19

<211> 192

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 19

atgaaattag tagaaacaaa aacaacaaaa acaggaacaa actttgaagg gaatagagct 60

ggatgtattt gtaatggcac tgtagcagta gcaaattctc ataatgcagg accagcatat 120

tgtgttgggt attgcggaaa tagtggagta gtaacaagaa atgcgaatgc aaatgtcgca 180

aaaacagcat aa 192

<210> 20

<211> 164

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 20

tggaagctaa attagatgag cgacacacat cactttgaag aaggtaagcc aggccggggt 60

ggccgcgtaa caaacagagg cgaaactatt ataatggtgt ttagatgttg ggtggagtgt 120

gggccctctt agaactatca aaaatcaatt aataactatg aaag 164

<210> 21

<211> 159

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 21

caaaaattgt gagagaacac ttatttcaaa ggagagactg gatgtactgc tgtcgctgtt 60

tttgcggggg gtctgtcgca atccaaattc taataagccg ggagttcttg ttgtgtggtt 120

ttggggggaa tttggggaac caacccgcaa tgatatgtt 159

<210> 22

<211> 198

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 22

atgagaaaaa tcgtagcagg aaagttacag acaggagcag actttgaagg cagcaaatgg 60

ggatgtgttt gtagtggaag cacagcagta gcaaactctc ataatgcagg accggcgtat 120

tgcgtaggat actgtacata gagaaacaac ggagtagtga ctagaaatgc taatgcaaat 180

gtcgcaaaaa cggcataa 198

<210> 23

<211> 216

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 23

atgaggtcaa tcgaagaatg catggaaact tggatacttg agtgctgaag aggcagtgga 60

ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagaaa tatggaagaa ccccagtggc gaaggcggca 120

gtcggtctgt actgacgtga ggctcgaaag tctgggtagc aaacaggatt agatacggta 180

ggaaatgcga atgcgaatct tgcaagaaca aaataa 216

<210> 24

<211> 210

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 24

atgaaattag ttggagggtt tccgcctcaa gcggccgcta gcattaagca tcttcagggg 60

agtatggccg caaggtgaac tcaaaggaag cgggggcttc tctgcggaga gcattggtaa 120

atttgaagac cgcgaaggtc cttccagctg cagtttgggg tgatgtaaat gcaggcggtg 180

cagtagtaga aatctcataa tcagccataa 210

<210> 25

<211> 173

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 25

gggtacgcga agcactgcac atcgcttcaa cttttaggag gacgcaggct gtgtttgcag 60

cggactgtcg acttgaaatt ctcataatgc aggaccagca tattgtgttg gggatggtgg 120

aaagatgggc agtaaccaga aatcaaaatt atactcttga acaaaggtct taa 173

<210> 26

<211> 160

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 26

ttaggaacag caaaaccaat aaaaacgcaa aataattttg aaggaaacgg ggctggttgt 60

ttttgcgggg ggtctgtcgc aatccaaatt ctaataagcc gggagttctt gttgtgtggt 120

tttgggggga atttggggaa ccaacccgca atgatatgtt 160

<210> 27

<211> 194

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 27

atgagaaaaa tcgtagcagg aaagttacag acaggagcag actttgaagg cagcaaatgg 60

tggatgtaaa tgcagtggcg gtgcagtagt agaaactctc ataatgcagg tccagcgtat 120

tgcgtgggat actgtggaaa caacggaggg tagtgactag aaatgctaat gcaaatgtcg 180

caaaaacggc ataa 194

<210> 28

<211> 192

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 28

atgagaaaaa tcgtagcagg aaagttacag acaggagcag actttgaagg cagcagaagt 60

ggatgtgttt gtagtggaag cgcagcagta gcaagctctc attatgcagg accagcatat 120

tgcgtaggat actgtggaaa ccatggagca gtaacaagaa atgcgaatta taatcttgca 180

aaaaaaaact ag 192

<210> 29

<211> 192

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 29

atgaaattag tagaaacaaa aacaacaaaa acaggaacag actttgaagg aaatagggct 60

ggatgtattt gtaatggtac tgtagcagtg gcaaattctc attatgcagg accggcatat 120

tgtgtgggat attgtggcaa cagtggagtg gtgacaagaa atgccaatgc agatcttgca 180

agaactgcat ag 192

<210> 30

<211> 194

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 30

atgagcaata tcttagcagg aaagttacag acaggagcag actttgaagg cagcaaatgg 60

ggatgtgttt gtagtggaag cacagcagta gcaaactctc ataatgcagg accggcgtat 120

tgcgtaggat actgtggaaa caacggagta agtgactaga aatgctaatg caaatgtcgc 180

aaaaacggca ataa 194

<210> 31

<211> 192

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 31

atgagaaaaa tcgtagcagg aaagttacag acaggagcag actttgaagg cagcagaagt 60

ggatgtgttt gtagtgcaag cgcagcagta gcaagctctc attatgcagg accagcatat 120

tgcgtaggat actgtggaaa ccgtggagca gtaacgagaa atgcgaatta taatcttgca 180

aaaaaaaact ag 192

<210> 32

<211> 192

<212> DNA

<213> 根特节杆菌

<400> 32

atgaaattag tagaaacaaa aacaacaaaa acaggaacag actttgaagg aaatagggct 60

ggatgtattt gtaatggtac tgtagcagtg gcaaattctc attatgcagg accggcatat 120

tgtgtgggat attgtggcaa cagtggagtg gtgacaagaa atgccaatgc agatcttgca 180

agaactgcat ag 192

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

tggggatgtg tttgtagtag 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tccgtttttg cgacatttgc 20

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

atgaatgctg ggcgagaaat ttgtgcggac 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ggagaccgca cctactggac aatctccttc 30

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gaaaggagga acaaaacatg ag 22

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

tcgtgccaga ttagcatttg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

agagtttgat cctggctgag 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

aaggaggtga tccagccgca 20

Claims

1.一种对产气荚膜梭菌具有活性的根特节杆菌菌株，其选自以下菌株：2014年2月19日以编号DSM 28444提交DSMZ的AP1、2014年2月19日以编号DSM 28445提交DSMZ的AP2、2014年2月19日以编号DSM 28446提交DSMZ的AP3，或者2014年2月19日以编号DSM 28447提交DSMZ的AP4。

2.一种组合物，其包括根据权利要求1所述的菌株的至少一种发酵液。

3.根据权利要求2所述的组合物，其以液体或者粉末的形式存在。

4.一种营养添加剂，其包括至少一种根据权利要求1所述的根特节杆菌菌株，和/或根据权利要求1所述的菌株的至少一种发酵液。

5.根据权利要求4所述的营养添加剂，其特征在于其以液体或者粉末的形式存在。

6.一种动物饲料，其特征在于其包括根据权利要求4或权利要求5所述的营养添加剂，以及营养基。

7.根据权利要求1所述的菌株的至少一种发酵液和/或至少一种根据权利要求1所述的菌株的用途，其用于制备营养添加剂、食物或药物。

8.根据权利要求1所述的菌株的发酵液，或者根据权利要求1所述的菌株的用途，其用于制备治疗和/或预防肠道菌群失调的药物。

9.根据权利要求8所述的用途，用于制备治疗和/或预防单胃动物的坏死性肠炎的药物。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述单胃动物是家禽和猪。

11.至少一种根据权利要求1所述的菌株，根据权利要求1所述菌株的至少一种发酵液，至少一种根据权利要求4或权利要求5中任一项所述的营养添加剂，和/或至少一种根据权利要求6所述的动物饲料的用途，其用于制备改善养殖动物的生长性能的饲料。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述养殖动物是鸡或猪。

13.至少一种根据权利要求1所述的菌株，和/或根据权利要求1所述菌株的至少一种发酵液，和/或至少一种根据权利要求4或权利要求5中任一项所述的营养添加剂，和/或至少一种根据权利要求6所述的动物饲料的用途，其用于制备改善养殖动物的畜产性能的饲料。