JP2010527625A - 抗菌活性を有するRumCペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1:Ruminococcus gnavus E1のRumCペプチドの保存された配列
配列番号2:エドマン分解法により試験的に決定されたRuminococcus gnavus E1のRumCペプチドのペプチド配列
配列番号3:エドマン分解法により試験的に決定されたRuminococcus gnavus E1のRumCペプチドのペプチド配列
配列番号4:配列番号7から推定されたRuminococcus gnavus E1のRumC1ペプチドのペプチド配列
配列番号5:配列番号8から推定されたRuminococcus gnavus E1のRumC2ペプチドのペプチド配列
配列番号6:配列番号9から推定されたRuminococcus gnavus E1のRumC3ペプチドのペプチド配列
配列番号7:Ruminococcus gnavus E1のrumC1遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号8:Ruminococcus gnavus E1のrumC2遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号9:Ruminococcus gnavus E1のrumC3遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号10〜12:試験的に決定されたペプチド配列
従って、本発明は、抗菌活性を有するペプチドに関する。好ましくは、これらのペプチドは、Ruminococcus gnavus、例えばRuminocuccus gnavusの変異株から単離される。参考として、これらのペプチドは、2006年12月19日にCNCM I−3705番として、CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris)に寄託されたRuminococcus gnavus菌株、すなわち、LEM 9-17菌株から単離され得る。
本発明は、抗菌活性をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、Ruminococcusの抗菌活性をコードする。
本発明の一実施形態によると、本発明に係るペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、当業者に知られているクローニング技術を用いて発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明に係るペプチドをコードしている配列の転写及び翻訳に必要な配列を含む。
本発明は、本発明に係る少なくとも1つのポリヌクレオチド又は発現カセットを含み、宿主生物を形質転換させるクローニングベクター又は発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明に係るポリヌクレオチド又は発現カセットが挿入されているプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスに相当する。これらのベクターを構築し、これらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するための技術は、当業者に知られている。特に、ポリヌクレオチド又はペプチドの発現誘導のために、宿主細胞において自己で維持、自己複製又は自己増殖できるベクターが、一般に用いられ得る。当業者は、形質転換させるための宿主生物の機能、及び用いられる形質転換技術の作用から適切なベクターを選択する。
本発明の対象は、本発明に係る少なくとも1つのポリヌクレオチド、少なくとも1つの発現カセット又は少なくとも1つのベクターの宿主生物への組み込みにより、該宿主生物を形質転換させる方法である。ポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに組み込まれてもよく、また、宿主生物において安定に複製されてもよい。宿主生物の形質転換の方法は、当業者に知られ、文献に広く記載されている。
Ruminococcus gnavusの新規の菌株は、2006年12月19日にCNCM I−3705番として、CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris)に寄託された。CNCMは、ブダペスト条約第7条に従う国際寄託当局である。
本発明は、本発明に係る抗菌活性を有するペプチドの調製方法に関し、該方法は以下の工程を含んでいる。
b)前記ペプチドを含む培養上清を回収する。
本発明に係る組成物は、本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストを含む。前記組成物は、液体状又は粉末状である。これらの組成物は、種々の成分を含む。
本発明は、薬物の製造のための本発明に係るペプチド、本発明に係る宿主生物、本発明に係る菌株、本発明に係る宿主生物の発酵マスト又は本発明に係る菌株の発酵マストの用途に関する。
1.細菌株及び培養培地
RumCを産生するRuminococcus gnavus E1は、健常な成人の糞便の優位な微生物叢から単離された(Dabard等.,Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001)。R.gnavus L14菌株は、インビトロにおいてRumAを産生する能力を失い、インビボにおいてRumCを合成できるR.gnavus E1の自然変異体である。
5g/Lの酵母抽出物(Yeast Extract,Fluka)
5mg/Lのヘミン(Hemin,Sigma)
寒天BHI−YH:上記の材料+15g/Lの寒天(BACTO agar,Difco Laboratories)
2.液体検体を用いる抗菌活性試験
液体検体を用いる抗菌活性試験を行うために、104個〜105個のC.perfringens CpA細胞を寒天培地に播く。30分間室温に置いた後に、パスツールピペットを用いて、寒天培地に直径が6mmのウェルを形成する。形成したウェル及び培養シャーレに100μL以下の検体を播き、37℃で16時間〜24時間培養する。検体がC.perfringens CpAに対する直接的な抗菌物質を含む場合、細菌の成長は阻害されて、ウェルの周囲に成長抑制によるハローの形成が引き起こされる。
抗菌物質を潜在的に産生する菌株を50μg/mLのトリプシンを追加する又は他の方法により含む寒天培地において、24時間培養した後に、抗菌物質を潜在的に産生する菌株を標的菌株を含む軟寒天培地(7.5g/Lの寒天を含む)に播く。この軟寒天培地は、104個〜105個の標的菌株の細胞を含む5mLの液体培地で灌流された5mLの寒天培地を即座に混合することにより調製される。その培養シャーレを、16時間〜24時間、37℃で再び保温する。成長抑制によるハローは、抗菌物質を産生するコロニーの周囲に見られる。
10gの盲腸の内容物を30mLのPBS(NaCl 137mM, KCl 2.68mM, Na2HPO4 8.1mM, KH2PO4 1.47mM, pH7.4)により希釈し、10000×g、4℃の条件で15分間遠心分離を行う。これにより、壊死細胞片及び食物の残留物を含む沈殿物が除去される。
遠心分離ろ過装置は、遠心分離を用いて分子量により、2つの分画にタンパク質を分離するろ過膜である。これは、検体の濃縮又は脱塩のために用いることもできる。
盲腸の内容物の上清の分子ふるいは、セファデックスG−75(2.4×187cm)のカラムにより行われる。検体(容量はカラムの容積の約2%とする)をカラムに吸着させ、PBSを用い、流速を1mL/分とし、4℃で溶出を行い、2mLの600分画が回収する。それぞれの分画の280nmの吸光度を検出することによりクロマトグラムが得られる。
活性CM分画の分子ふるいは、FPLCにより行われる。検体をHiLoad 26/60 Superdex 30pgカラム(GEヘルスケア)に吸着させる。PBSを用いて、2.5mL/分の流速で溶出を行う。溶出されたタンパク質を、280nmの吸光度の変化を測定することにより検出する。2分の溶出に相当する分画は自動的に回収される。
陽イオン交換HPLCは、Waters 616 Pump注入器を備えるWaters 600S Contorollerにより行われる。検体(0.5mL)をTSKのCM-3SW Spherogel分取用カラムに吸着させる。20mMの酢酸ナトリウム緩衝液によるpH5とした条件下において、0M〜1Mの濃度勾配をつけたNaClを用いて0.8mL/分の流速で溶出を行う。初めの20分間は、NaClの非存在下で均一濃度において溶出を行い、その後の30分間は、0Mから0.5MにリニアにNaClの濃度勾配がつけられた条件下で行う。その後の5分間は、均一濃度の条件下で溶出を行い、その後の1分間でNaClの濃度を1Mにし、均一濃度で15分間続け、最後に開始時の条件に戻す。溶出されたタンパク質を、Waters 486 Tunable Absorbance Detectorを用いて280nm又は214nmの吸光度を測定することにより検出する。分画は自動的に回収され、それをAmicon Ultra PL-5装置を用いて脱塩する。
陽イオン交換クロマトグラフィは、FPLCの連鎖により行われる。検体をHi-Prep 16/10 CM FFカラム(GEヘルスケア)に吸着する。20mM酢酸ナトリウム緩衝液によりpH5とした条件下において、0M〜0.4Mの濃度勾配をつけたNaClを用いて溶出を行う。NaClの非存在下の均一濃度で2mL/分の流速の条件により、溶出を50分間行う。その後に、40分間かけて0Mから0.4MにリニアにNaClの濃度を変化させ、5mL/分の流速で溶出を続ける。溶出されたタンパク質を、280nmの吸光度の変化を測定することにより検出する。1mLの分画は、自動的に回収され、それをSep-Pak C18カートリッジにより脱塩する。
逆相HPLCは、Alliance Waters 1690 Separations Moduleにより行われる。0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)を用いて事前に酸性化された検体(100μL)を、Vydac 218TP52 250×2分析用カラムに吸着する。一定の流速(0.5mL/分)で溶出を行う。15%のアセトニトリルの均一濃度で10分間の溶出を行った後に、60分かけてアセトニトリルの濃度を15%から30%にリニアに濃度を変化させる。1分間でアセトニトリルの濃度を70%に変更し、溶出を均一濃度で19分間続けた後に、開始時の条件に戻す。溶出されたタンパク質を、Waters 996 Photodiode Array Detectorを用いて214nmにおける吸光度の変化を測定することにより検出する。アセトニトリルは、Speed Vac Concentrator(Savant)を用いて蒸発させる。
質量分析は、Timone proteomic plateau(薬科大学、マルセイユ、フランス)において行われた。
この技術は、フェニルイソチオシアネート(C6H5N=C=S)を有するタンパク質の遊離末端アミノ酸の反応に基づく。この環状化合物は、基本的な媒体において、タンパク質の第1のアミノ酸残基に求核的に攻撃を行う。ペプチドのフェニルチオカルボミル(PTC)誘導体は、その後に、加水分解により切断される。第1のアミノ酸のアニリノ−チアゾリノン(ATZ)及びこのアミノ酸を失ったタンパク質が得られる。AZT−アミノ酸は、フェニルチオヒダントイン−(PTH)アミノ酸に転換される。
37℃で24時間培養されたL14菌株の14mLの培養液を2mLチューブに7つに分け、その後に、これらのチューブに対して5800×gで10分間遠心分離を行う。細胞の沈殿物に対して、2mLの0.1Mクエン酸塩緩衝液(クエン酸21mg/mL、NaOH8.8mg/mL、pH5.5)を用いて、2度の洗浄を行い、その後に、強力な変異誘発剤であるN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NG)の濃度が増大するように変化させているクエン酸塩緩衝液をそれぞれに加える。
本モデルによると、これらのカラムは、相が流されるシリンジ形状の中にあり、又は、シリンジの端に固着されたミニカラムである。緩衝液の流動は、蠕動型ポンプにより保証される。第1段階において、カラムにH2Oを通過させ、その後にCH3CNを通過させ、最後に0.05%TFAを含むH2Oを通過させるにより、カラムは平衡化される。その後に、0.05%TFAを用いて事前に酸性化された検体を吸着させる。H2O−0.05%TFA、40%CH3CN−0.05%TFA及びCH3CN−0.05%TFAを連続的に加えることにより、3つの工程において溶出を連続的に行う。
RumCを含む分画を分割し、ヒートブロックを用いて5分〜15分間それぞれを異なる温度で熱し、その後に4℃で保存する。その後に、それらを用いて抗菌活性試験を行う。
RumCを含む分画を分割し、それぞれを所望の緩衝液により約10倍に希釈する。室温で10分間置いた後に、それぞれの溶液をVivaspin 500 3kDaろ過装置に吸着し、その後に製造業者の説明書に従って遠心分離を行う。Vivaspin 500により保持されている分画に緩衝液を加え、そのろ過装置に対して再び遠心分離を行う。Vivaspin 500 3kDaにより保持された、すなわち、RumCを含む分画のそれぞれの容量は、開始時の容量と一致するように緩衝液を用いて調節する。これらの分画を4℃で保存し、その後に、それらを用いて抗菌活性試験を行う。
pH4.4緩衝液:0.2M pH4.4 酢酸ナトリウム緩衝液
pH7緩衝液:50mM KH2PO4−39mM NaOH。
1.盲腸の内容物からのRumCの精製
Ruminococcus gnavus E1菌株は培養可能であるにもかかわらず、RumCは、試験された培養条件下のインビトロにおいて産生されない。RumCを精製するために、E1菌株を宿しているモノゼニックラットの盲腸の内容物を用いること、又は、インビトロにおいてRumCを産生できるR.gnavus変異株を作製することが必要である(第2節を参照)。
第1工程として、PBSにより盲腸の内容物を希釈した。
精製の第2工程において、盲腸の内容物を遠心分離することにより、細菌、壊死細胞片及び食物の残留物を除去する。
前記のように調製された溶液をAmicon Ultra-15 PL-5システムにより濃縮し、その後に、分子ふるいカラムにかける。
得られた全ての分画をC.perfringens CpA菌株に対して試験した。これは、モノゼニックラットの盲腸の内容物中に抗C.perfringens物質が存在するかどうか確認する試験であった。
分子ふるいは、セファデックスG−75カラム(2.4×187cm)により行われた。回収した2mLの600分画のそれぞれの280nmにおける吸光度を検出することにより、溶出をモニタリングした。
活性GF分画にあるRumCの大きさを評価するために、分子量が知られている標準タンパク質を前記と同一のセファデックスG−75カラムに吸着させ、それぞれの溶出容量を測定した(図2A)。その後に、物質の分子量の対数(log(MM))とその溶出容量(Ve)との釣り合いを定義する較正曲線を描いた(図2B)。683mLの溶出容量の平均値を用いると、外挿であるが、抗菌物質は選択された標準タンパク質の範囲内にあり、その分子量は、約5200Daであると評価された。
カルボキシメチル(CM)−Sepherogelカラムによる陽イオン交換クロマトグラフィに活性GF分画をかける場合、HPLC法を用いることが予測された。pH5においてNaClの濃度勾配を用いて溶出を行い、これを214nmにおいてモニタリングした(図3)。
214nmにおける種々の吸収ピークが得られた。
慣習により、溶液中の任意の活性単位(AAU)の数値は、活性のある最終希釈度の逆数となるように定義される。従って、精製により得られたそれぞれの活性分画の希釈系列液(2倍)に対して抗C.perfringens活性の試験を行った。
2重ピーク分画及び単一ピーク分画における生成物の分子量は異なるが、エドマン法により、AGXIXSGSVAV(配列番号3)である単一の主要なN末端配列を決めることが可能である。
用いられた技術は、R.gnavus L14菌株の無作為の変異誘導であった。この菌株は、インビトロでRumAを産生する能力を失ったが、インビボでRumCを合成できるR.gnavus E1の自然発生的な変異体である。この菌株は、強力なアルキル化剤であるN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NG)処理を受けた。
産生及び精製試験は、産生能を有する7つのクローンのうちの1つのクローンである変異体9−17に対して行った。
イオン交換クロマトグラフィを行う前に、検体を脱塩する必要がある。
活性CM分画の分子ふるいは、10kDa未満の質量を有するペプチドの分離ができるカラムを用いたFPLC法により行われた。溶出は280nmの吸光度の変動を検出することによりモニターされる。タンパク質の量は少なく、分離は不十分であることがわかる(図示せず)。それにもかかわらず、選択された分画において抗C.perfringens活性を試験した。吸着された活性の5%のみがふるいの後に認められた。従って、この技術を精製のために採用しなかった。その一方で、活性分画(GF47−50)は、質量分析法により分析され、4235Daのペプチドに対して実質的に純粋であることが証明された(図8)。
活性CM分画から混入物を除去する他の試みは、ろ過装置を用いて行われた。RumCは5kDaフィルターにより(わずかに小さな分子量を有するにもかかわらず)保持されるため、第1の試験を、分離限界が5kDaであるVivaspin 500を用いて行った。残念ながら、不純物もそのフィルターに保持される。但し、それらの分子量は2.5kDa未満である。具体的に、質量分析法において、精製により得られたいかなるものも認められなかった(結果は示さず)。従って。第2の試験を、分離限界が10kDaであるMicroconろ過装置を用いて試みた。具体的に、その分子量にもかかわらず、RumCが10kDaフィルターにより保持される(10kDa R分画)ことが以前に述べられていた。質量分析法は以前の結果を確認し、混入物の多くの割合が保持されない分画において除去されることを可能とする(図7C)。
3つのRumCのピーク(4235Da、4324Da及び4456Da)を含む10kDa R分画を逆相クロマトグラフィにかけた。流速及び勾配の条件は、盲腸の内容物からRumCを精製するための条件と同一であり、得られた結果は同等である。2つの異なる分画は、C.perfringensに対する活性がある2重ピーク分画及び単一ピーク分画である。
精製プロトコールを評価するために、定量的活性試験をそれぞれの活性分画の2倍の系列希釈液を用いて行った。それぞれの分画に含まれる任意活性単位(AAU)の数値を算出し、精製収率が推定した(表5)。活性物質の相当な損失は、培養上清の脱塩の工程において見られ、陽イオン交換クロマトグラフィの後に、さらなる脱塩工程が続く。その損失は、陽イオン交換クロマトグラフィにおいて起こるおそれは十分にありそうだが、これはプロトコールの正当性における疑いを認めない。
2重ピーク及び単一ピークの分画を質量分析法により分析した。得られた結果は、盲腸の内容物を用いる精製から得られた分画を用いて得られた結果と同一である。2重ピーク分画は、4324Da及び4456Daのペプチドを含むが、単一ピーク分画は、4235Daのペプチドを含む。
これらの分画に対して配列決定を行った。
4.1.異なる菌株に関する抗菌活性
RumCの抗菌活性について、R.gnavus E1(SN CCE1)菌株を宿すモノゼニックラットの盲腸の内容物の上清を濃縮した第1段階を用いて、異なるグラム陽性病原菌株及びグラム陰性病原菌株に対して試験した。他の試験として、SN CCE1に感受性のある菌株に対して、2つの精製された分画を用いて行った。その結果は表6に示す。
RumCの抗菌力について、精製されたRumC分画のそれぞれの最低阻害濃度をインビボで測定すること、及びC.perfringensに対して用いられる対照抗生物質であるメトロニダゾールの最小阻害濃度と比較することにより評価した。
熱に対するRumCの耐性についての第1の予備試験を、同一のペプチド量を異なる温度で15分間置くことにより行った。インビボの2つのRumC分画(2重ピーク及び単一ピーク分画)において、75℃で15分間の処理は活性に影響はなかった。しかしながら、100℃では、ペプチドは15分以内に完全に不活性化される。
活性CM分画に含まれているペプチドのpH耐性を、pH2、pH4.4及びpH7において試験した。
Claims (24)
- 配列番号1の配列のペプチド、
配列番号1のポリペプチドと少なくとも80%の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチド、
配列番号2の配列のペプチド、
及び配列番号2のポリペプチドと少なくとも80%の相同性を有するペプチドを含んでいるペプチドのうちから選択されるペプチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性を有するペプチド。 - 配列番号3の配列のペプチドをさらに含んでいる請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号4、配列番号5又は配列番号6の配列のペプチドから選択されるペプチドをさらに含んでいる請求項1に記載のペプチド。
- 質量分析法により測定された分子量が4000Daから4600Daまでである請求項1〜3のうちのいずれか1項に記載のペプチド。
- Ruminococcus gnavus変異株から単離された請求項1〜4のうちのいずれか1項に記載のペプチド。
- 2006年12月19日にCNCM I−3705番として、CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris)に寄託されたRuminococcus gnavus菌株から単離された請求項5に記載のペプチド。
- 配列番号7、配列番号8又は配列番号9の配列のポリヌクレオチド、
配列番号7、配列番号8又は配列番号9の配列のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、
及び請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのうちから選択されるポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする抗菌活性をコードしているポリヌクレオチド。 - 転写方向に、
宿主生物において機能するプロモータ、
請求項7に記載のポリヌクレオチド、
及び前記宿主生物におけるターミネータ配列を含んでいることを特徴とする発現カセット。 - 請求項7に記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項8に記載の発現カセットを含んでいるベクター。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチド、請求項8に記載の発現カセット及び/又は請求項9に記載のベクターを用いて形質転換された宿主生物。
- 2006年12月19日にCNCM I−3705番として、CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris)に寄託されたRuminococcus gnavus菌株。
- 請求項10に記載の宿主生物又は請求項11に記載の菌株によって得られるタンパク質混合物又は発酵マスト。
- 請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載のペプチド、請求項10に記載の宿主生物、請求項11に記載の菌株、請求項10に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項11に記載の菌株の発酵マストを含んでいる組成物。
- 液体状又は粉末状である請求項13に記載の組成物。
- 請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載のペプチド、請求項10に記載の宿主生物、請求項11に記載の菌株、請求項10に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項11に記載の菌株の発酵マストを含んでいる栄養性添加物。
- 液体状又は粉末状である請求項15に記載の栄養性添加物。
- 動物のための栄養基礎成分及び請求項15又は16に記載の栄養性添加物を含んでいることを特徴とする飼料。
- 薬物、栄養性添加物又は飼料の製造のための、請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載のペプチド、請求項10に記載の宿主生物、請求項11に記載の菌株、請求項10に記載の宿主生物の発酵マスト又は請求項11に記載の菌株の発酵マストの用途。
- ブタ又は家禽の壊死性腸炎の予防又は治療を目的とする薬物又は栄養性添加物の製造のための請求項18に記載の用途。
- ヒトの消化器疾患の予防又は治療を目的とする薬物又は栄養性添加物の製造のための請求項18に記載の用途。
- 動物に処理するための請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載のペプチドの非治療的用途。
- 前記ペプチドは、前記動物に内在的な菌株又は前記動物に外因的な菌株から得られる請求項21に記載の用途。
- 前記ペプチドは前記動物に内在的な菌株から得られ、前記動物に内在的な菌株による前記ペプチドの産生は促進される請求項21に記載の用途。
- 前記ペプチドは前記動物に内在的な菌株から得られ、前記動物に内在的な菌株の成長は促進される請求項21に記載の用途。
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