TW201946537A

TW201946537A - 新穎芽孢枯草桿菌菌株及使用其製備發酵大豆產物的方法

Info

Publication number: TW201946537A
Application number: TW108106478A
Authority: TW
Inventors: 徐孝貞; 金斐那; 金貞銀; 金成俌; 朴承源; 洪暎鎬
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-12-16
Also published as: KR20190024612A; EP3676371A4; US11332710B2; UA126923C2; AR112892A1; BR112020003916A2; EP3676371A1; KR102092851B1; JP6952879B2; CN111465685A; US20200199691A1; CN111465685B; TWI702914B; US20220251501A1; JP2020532293A

Abstract

本發明係有關用以製備發酵大豆產物的方法，包括：將芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ24-34(KCCM12038P)菌株接種至大豆粕(soybean meal)或是大豆蛋白濃縮物中；以及獲得藉由培養芽孢枯草桿菌菌株而發酵之發酵大豆粕或發酵大豆蛋白濃縮物、由該方法所製備之發酵大豆產物，以及包含發酵產物的動物飼料組成物。由該方法所製備之發酵大豆產物不包含黏液，顯示絕佳抗菌活性，且具有高含量之低分子量胜肽。

Description

新穎芽孢枯草桿菌菌株及使用其製備發酵大豆產物的方法

本發明是有關一種新穎芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ24-34(KCCM12038P)菌株及使用其製備發酵大豆產物的方法。

一般而言，動物飼料包含魚粉(fishmeal)作為蛋白質來源，但由於生產魚粉之國家中近期的魚粉產量降低，或是魚粉的供需已變得不穩定，魚粉在全球的成本已提升。因此，對於可被用作魚粉之替代物之蔬菜蛋白質來源的需求增加，且研發該蔬菜蛋白質來源的努力已持續在進行。典型的蔬菜蛋白質包括包含於堅果、豆類及穀類中的蛋白質，但相較於其他豆類(beans)，蔬菜蛋白質中之大豆(soybean)已知為具有較為豐富之蛋白質、脂肪酸及多糖。

脫脂大豆粕(defatted soybeam meal，此後稱為大豆粕(soybeam meal))為對具有高蛋白質及脂肪含量之大豆進行萃取脂肪後剩餘的副產物。然而，大豆粕包含各種抗營養因子(anti-nutritional factors (ANFs))，其可在作為飼料時對消化率(digestibility)有不利的影響(Li et al.,J.Anim Sci.,68：1790,1990)。特別是，胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor(TI)) 已知為活體內(in vivo)藉由抑制酵素活性而降低蛋白質利用的典型抗氧化劑。尤其是，當抗營養因子被添加於供幼體家畜(young livestock)使用的飼料時，其使用量會受到限制。另外，大豆蛋白係使用水或鹽而自大豆粕萃取。依據自脫脂大豆粕移除之非蛋白質成分，諸如水溶性及非水溶性碳水化合物，這些大豆蛋白可以被分類為脫脂大豆粉(soy flour)、大豆蛋白濃縮物、結構化大豆蛋白(structured soy proteins)、水解大豆蛋白(hydrolyzed soy proteins)，或大豆蛋白分離物(soy protein isolates)等大豆蛋白加工物processed soy protein products。另外，由於大豆蛋白具有高度蛋白質含量，除了被用於肉類加工品、奶類加工品以及諸如麵包或零食等食物外，其可被用於家畜飼料(livestock feed)。

然而，自大豆粕萃取之大豆蛋白包含由蛋白質次單元所組成之高分子量蛋白質以及妨害消化的許多抗營養因子(ANFs)及類似物。特別是，這些抗營養因子已知會妨害動物的消化能力(digestive ability)。因此，為了將大豆蛋白用於動物飼料中，有需要聚焦於降低抗營養因子以增加動物飼料之消化率，並將高分子量蛋白質轉換成低分子量胜肽之研究。

同時，目前生產的大豆蛋白加工物，諸如大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物，或水解大豆蛋白係由化學或是酵素處理所生產。然而，化學加工方法產生生產成本高的問題，且在製造過程期間之熱處理、化學處理、熱乾燥或類似者會導致蛋白質變性並損失水溶性胺基酸而實質上降低蛋白質溶解度。有鑑於此，化學加工方法係受到不會發生極端蛋白質變性之程度的熱處理。因此，大量的胰蛋白酶抑制劑-其等係抗營養因子-係存在於最終大豆蛋白產物中。

解決大豆蛋白加工物的化學加工方法的一個手段-使用芽孢桿菌屬細菌(Bacillus)或菌類(fungi)以進行發酵的生物加工方法之發酵大豆產物已被研發(韓國發明專利第10-0645284、10-0459240、10-0925173，及10-1139027號)。然而，即使對於由該生物加工方法所製備的發酵大豆粕或發酵大豆濃縮物，在加工物中的低分子量胜肽的含量以及抗營養因子的含量-其係與改進消化率有關-可能依據微生物諸如芽孢桿菌屬細菌、乳酸菌及酵母的種類及菌株改變。特別是，即使是相同種類之微生物，含量可能依據酵素生產能力及各菌株之生長速率而改變(韓國發明專利第10-1517326號)。亦即，用於生物處理方法中的菌株對於指示(indicating)最終之大豆蛋白加工物的特性以及消化率的差異為關鍵性的因素。

相關先前技術包括韓國發明專利第10-0645284號、第10-0459240號、第10-0925173號及第10-1139027號。根據揭露於這些發明專利案中的技術，由於許多抗營養因子可在發酵過程期間使用枯草桿菌(Bacillus subtilis)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、洛德乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)及啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之微生物群體(microorganism population)而被移除，且進一步地蛋白質或碳水化合物可以被分解成低分子量胜肽形式，用於飼料之具有高消化吸收速率之高品質蛋白質材料是真的可以被實施。然而，該等微生物群體，特別是枯草桿菌及芽孢枯草桿菌-其等係用於大豆粕或大豆蛋白濃縮物之發酵-由於低抗菌活性(antibacterial activity)，其等有具有對外部汙染物之低抗性以及低蛋白酶生產能力(protease-producing ability)的缺點。另外，一些微生物菌株在發酵過程期間產生黏液(mucilage)，且由於這些黏液，發酵產物的滲透性 (permeability)發生退化，藉此不利地影響好氧性發酵的效率。

同時，作為本發明的相關先前技術，由申請人在韓國發明專利第10-1517326號中所揭露的芽孢枯草桿菌K2G菌株能夠移除包括胰蛋白酶抑制劑之抗營養因子、具有高的蛋白水解能力(proteolytic ability)，並具有抗菌活性，且可用以提供具有低分子量胜肽之動物飼料。然而，以上提及的前案並未揭示也未教示具有對抗包括沙門氏菌、弧菌及發光桿菌等各種病原微生物之抗菌活性，且能夠增加低分子量胜肽的含量且抑制黏液的產生的新穎菌株，以及使用該菌株製備發酵大豆產物的方法。

在這些條件下，本發明的發明人已盡力研發用以製備低分子量胜肽之發酵大豆產物的方法，其係將新穎芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株接種至大豆粕或大豆蛋白濃縮物中，且已研發具有絕佳抗菌活性且無黏液產生、具有增加之低分子量胜肽含量的發酵大豆產物，藉此完成本發明。

[先前技術文件] [專利文件]

(發明專利文件1)韓國發明專利第10-0645284號(於2006年11月6日登記)

(發明專利文件2)韓國發明專利第10-0459240號(於2004年11月19日登記)

(發明專利文件3)韓國發明專利第10-0925173號(於2009年10月29日登記)

(發明專利文件4)韓國發明專利第10-1517326號(於2015年4月27日登記)

(發明專利文件5)韓國發明專利第10-1139027號(於2012年4月16日登記)

[非專利文件]

(非專利文件1) Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990

本發明的一個目的是提供用以製備低分子量胜肽之發酵大豆產物的方法，其係藉由將新穎芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株接種(inoculating)至大豆粕或大豆蛋白濃縮物中。

本發明的另一目的是提供新穎的芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株，其中低分子量胜肽之含量被增加且其具有絕佳的抗菌活性，且無黏液產生。

本發明的再一目的是提供包含該發酵大豆產物之動物飼料組成物。

本發明的其他目的以及優點由詳細說明以及所附之申請專利範圍以及圖式將為顯見的。未敘述於本說明書中的內容可以由本發明所屬技術領域或相似技術領域具有通常知識者充分認知並推論而得，且因此該等敘述將被省略。

揭露於本發明中的各說明及實施例可被分別應用於其他說明及實施例。即，此處所揭露之各種元件的所有組合都落於本發明的範圍內。另外，本發明的範圍並非意欲被下述特定說明所限制。

在達到上述目標的其中一個態樣中，本發明提供用以製備發酵大豆產物的方法，其包含：將芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株接種至大豆粕或大豆蛋白濃縮物中；以及獲得藉由培養該芽孢枯草桿菌菌株而發酵的發酵大豆粕或發酵大豆蛋白濃縮物。

根據本發明之該芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株具有絕佳之蛋白酶活性及對病原體有絕佳抗菌活性，且在發酵期間具有經降低的黏液產生能力，且因此，高品質發酵大豆產物可被生產。

此處所使用的用語「發酵大豆產物」代表通過將本發明之菌株或是控制之菌株接種至大豆蛋白濃縮物或大豆粕所獲得的產物、發酵大豆蛋白濃縮物或發酵大豆粕。

此處所使用的用語「大豆蛋白濃縮物」代表自大豆-其係豆科植物-萃取之蛋白質的濃縮物。自大豆萃取的蛋白質是通過使用諸如己烷(其係有機溶劑)或類似者自大豆萃取大豆油，且接著自殘餘的脫脂大豆移除非蛋白質成分，諸如水溶性及非水溶性碳水化合物所生產的蛋白質。

此處所使用的用語「大豆粕」代表最常使用之蔬菜蛋白質飼料，其為由溶離(milking)大豆-其係豆科植物-所得之產物。大豆粕係對動物而言最為經濟且高品質的蔬菜蛋白質飼料，且係自大豆萃取油時所產生之副產物。

此處所使用的用語「芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)」，其係桿菌屬(genus Bacillus)的革蘭氏陽性土壤細菌。已知其具有與枯草桿菌相近的關係且生產稱為巴那酶(barnase)的抗生素-其係一種BamH1酵素-以及核糖核酸酶。此土壤細菌已知對於植物的根部感染，特別是在農業領域上可作為抗菌活性菌(antibacterial active bacteria)。

近年來，抗生素在動物飼料中的使用已受到限制，且發酵大豆產物-其係蔬菜蛋白質-被用作蛋白質來源。因此，飼料組成物的天然抗菌特性，特別是發酵大豆產物之抗菌活性對於降低由病原微生物所致之疾病的發生已變得重要。因此，本發明之發明人已盡廣泛地努力以研發具有對抗各種病原體之抗菌活性，同時能夠產生具有絕佳活性之蛋白酶且同步在發酵作用期間降低黏液產生能力(mucilage-producing ability)的菌株。具體而言，已知用以製備傳統之發酵大豆產物的芽孢枯草桿菌被製備，且菌株藉由UV(紫外光)照射而選擇及分離用以進行菌株的改良，在這其中，具有對抗各種病原微生物之絕佳抗菌活性的本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株可被選擇出來。此處所使用的用語「改良(improvement)」可以由突變、基因重組、基因選殖(gene cloning)或類似手段達成，以改良菌株之缺陷或生產力，且突變可包括基因(gene)突變、染色體(chromosome)突變，或基因體(genomic)突變。物理突變、化學突變或生物突變等突變可使用UV射線而誘發，且UV射線可以使用UV燈泡照射一段時間，在此期間200奈米(nm)至300奈米之波長達到95%至100%的死亡率。在本發明中，係以254奈米之UV波長照射一段時間，在此期間野生型(wild-type)菌株之死亡率達到99.99%，藉此分離並僅獲得形成菌落之突變菌株。

根據一實施例，根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株具有絕佳的對抗病原體之抗菌活性。舉例而言，芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株具有對抗選自於由鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、美人魚發光桿菌(Photobacterium damsel)、鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)和愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)所組成之群組的至少一種病原的抗菌活性。抗菌活性可以使用稀釋法(dilution method)、紙錠擴散試驗(disk diffusion test)、E試驗(E-TEST)或類似者量測。

具體而言，沙氏桿菌可能造成家畜食物中毒，而其他細菌包括弧菌屬(Vibrio species)之細菌已知對養殖魚類造成包括敗血症(sepsis)等疾病、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)對蝦造成弧菌病(vibriosis)、對鰤魚(yellowtail)造成巴氏桿菌症(pasteurellosis)及對比目魚造成愛德華病(edwardsiellosis)。對於這些病原細菌，根據本發明之芽孢枯草桿菌有效地抑制其等的生長，且因此使用芽孢枯草桿菌而製備的發酵大豆產物或是包含芽孢枯草桿菌之發酵大豆產物可具有對抗這些病原體的抗菌活性。

傳統的發酵大豆產物具有下列問題：由於分別衍生自醣類(saccharide)及大豆原料之蛋白質的左聚糖形式的聚果糖以及聚胺基戊二酸酯(polyglutamate)之間的聚合反應，在發酵過程期間所產生的酵素會產生黏稠黏液(sticky mucilage)。此黏液的產生導致發酵大豆產物集結(aggregate)成團塊(lumps)，此使得攪拌變得困難且難以控制，且造成發酵產物中的經溶解的氧氣及溫度的轉移，因此導致在量產程序中有許多問題。黏液的產生可以由通過菌落的表型觀察量測黏液的黏性或是光澤度(glossiness)，或是藉由量測聚合物物質諸如聚γ-麩氨酸(poly-γ-glutamic acid)的含量而被測定。

根據一實施例，根據本發明的芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株可具有低的黏液生產能力。更具體而言，由芽孢枯草桿菌所生產的發酵大豆產物具有低含量的黏稠黏液且幾乎不會集結成團塊，且因此能夠使用其製備高品質的發酵大豆產物(請見實例4)。

根據一實施例，根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株可生產高活性蛋白酶並將大多數的大豆蛋白-其係由聚合物所構成-水解而分解成低分子量胜肽，藉此顯著地增加發酵大豆產物之消化-吸收速率(digestion-absorption rate)。本發明之胜肽由胺基酸之各種組合，通過肽鍵而形成聚合物，且該聚合物通常由2至50個彼此鍵結之胺基酸所組成。低分子量胜肽係具有低分子量的小胜肽(small peptide)，且具有在消化期間促進吸收的優點，藉此在用作動物飼料時增加消化率。依據被包括於最終製備之所欲的水解物中的低分子量胜肽的種類及組成比例，大豆蛋白濃縮物-其係原料-之含水量、蛋白質含量或類似者可被適當地選擇及使用。

根據一實施例，由根據本發明之芽孢枯草桿菌所製備之發酵大豆產物可包含40%或更多之具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽。更具體而言，發酵大豆產物包含40%至100%、50%至95%、60%至90%、70%至90%、75%至90%、75%至85%，或80%至85%之具有30kDa或更低之分子量的胜肽。另外，發酵大豆產物可包含15%或更高之具有10kDa或更低之分子量的胜肽。更具體而言，發酵大豆產物可包含15%至80%、20%至70%、30%至65%、40%至65%，或是50%至60%之具有10kDa或更低之分子量的胜肽。該百分比(%)可代表由GPC所得之蛋白質分子量分布中，代表特定分子量範圍之部分區域佔總區域的百分比例。根據一實施例，由根據本發明之芽孢枯草桿菌所製備的發酵大豆產物可具有與其在發酵前相比，經增加之蛋白質含量。此代表即使是與以傳統已知菌株進行發酵之發酵大豆產物相比，可藉由在較短期間內增加蛋白質含量而縮短發酵時間。亦即，根據本發明之芽孢枯草桿菌可以藉由顯著地增加發酵大豆產物中低分子量胜肽的含量而改良飼料的品質，且可藉由更快速地增加蛋白質含量而縮短發酵時間。

本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株之16S rRNA被分析，結果顯示其與作為標準菌株之芽孢枯草桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum)FZB42T(CP000560)相近的關係，且16S rRNA基因序列同源性(homology)被確認為99.93%(1507bp/1508bp)。因此，根據本發明之突變菌株CJ24-34被命名為芽孢枯草桿菌植物亞種CJ24-34，且於2017年6月15日依據布達佩斯條約寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，存取碼為KCCM12038P。

根據一實施例，用以製備發酵大豆產物之方法可以進一步包括控制大豆粕或大豆蛋白濃縮物之含水量，並在將芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株接種於大豆粕或大豆蛋白濃縮物之前，使大豆粕或大豆蛋白濃縮物受到熱處理及冷卻的步驟。較佳是在藉由在固體發酵之前噴灑或混合適當量的水而控制大豆粕或大豆蛋白濃縮物-其係原料-之含水量後，進行預定時間的熱處理。具體而言，含水量可被依據所欲的發酵大豆產物之蛋白質或低分子量胜肽之含量，或為了設定發酵時間為目的而被控制。另外，熱處理的目的是用以殺死原料中的各種細菌(germs)以及藉由破壞原料的細胞壁而使蛋白質變性，藉此提供所欲的微生物得以旺盛(vigorously)生長的環境。熱處理方法可以使用各種所屬技術領域中廣為人知的方法進行而並不加以限制。具體而言，熱處理方法可以使用蒸氣或過熱蒸氣來進行。

根據一實施例，本發明之大豆粕或大豆蛋白濃縮物可藉由將含水量控制於30%(v/w)至80%(v/w)之範圍內，並在將熱處理溫度控制於70℃至130℃之下進行10分鐘至30分鐘之熱處理，接著冷卻至30℃至50℃而製備。本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株的培養液可以基於各大豆粕及大豆蛋白濃縮物之重量之10重量%的量被接種，並於20℃至50℃下發酵8小時至72小時。

更具體而言，大豆粕或大豆蛋白濃縮物的經控制的含水量(v/w)可在30%至80%、30%至70%、30%至60%、30%至50%、30%至40%、40%至80%、40%至70%、40%至60%，或40%至50%的範圍內。大豆粕的含水量可依據所欲的發酵大豆粕之蛋白質或低分子量胜肽含量，或是為了設定發酵時間的目的而被適當地控制於低濕度條件或高濕度條件之下。

根據一實施例，當熱處理溫度低或熱處理時間短，將具有細菌之殺菌作用(germicidal effect)可能被減損，且隨後的發酵過程可能無法被順利進行的問題。相對地，當熱處理溫度高或處理時間長，由於大豆粕中之蛋白質發生變性，消化率降低，因此最終產物的品質會減損。因此，較佳選擇在上述範圍內的處理溫度或處理時間以預防上述問題。在熱處理程序期間，具有產生存在於大豆粕或大豆蛋白濃縮物中之污染物幾乎被滅除的化學環境(chemical environment)之效果，且隨後的固態發酵過程被順利進行(smoothly carried out)。再者，預期的是妨害消化率的抗營養因子諸如胰蛋白酶抑制劑(TI)可被些微降低。

更具體而言，熱處理溫度可以在70℃至120℃、70℃至 110℃、70℃至100℃、80℃至130℃、80℃至120℃、80℃至110℃、80℃至100℃、90℃至130℃、90℃至120℃、90℃至110℃，或90℃至100℃之範圍內。再者，更具體而言，熱處理時間可以為10分鐘至30分鐘或20分鐘至30分鐘。

上述經熱處理的大豆粕或大豆蛋白濃縮物可以被冷卻至固態發酵得以進行的溫度。冷卻程序可以通過使用運送式(conveyor-type)空氣冷卻器之轉換程序(transfer process)而執行。更具體而言，轉換程序可以被執行直到大豆粕或大豆蛋白濃縮物之溫度達到30℃至50℃、35℃至45℃，或35℃至40℃。

發酵的培養溫度可以是20℃至50℃，更具體而言是30℃至50℃、40℃至50℃、30℃至40℃，或20℃至40℃，但不限於此且可以依據所欲的發酵大豆產物的品質而變化。另外，發酵的培養時間可以為8小時至72小時，更具體而言，10小時至70小時、10小時至60小時、10小時至50小時、10小時至40小時、10小時至30小時、10小時至20小時，或8小時至18小時，但並不限於此且可依據所欲的發酵大豆產物的品質而變化。

根據一個實施例，根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株可以10⁵CFU/克(CFU/g)至10⁹CFU/克、10⁵CFU/克至10⁸CFU/克、10⁶CFU/克至10⁹CFU/克，或10⁶CFU/克至10⁸CFU/克的量被接種至大豆粕或大豆蛋白濃縮物。被接種的菌株的量可為影響大豆粕或大豆蛋白濃縮物之固體發酵的重要因素。當被接種之菌株的量少，可能需要長時間來製備發酵產物，且因此，發酵時間被延長且很有可能發生其他微生物所致之汙染。相對地，當被接種之菌株的量過高，發酵時間可被縮短，但可能難以適當地維持發酵環境。特別是，由於發酵效能可能顯著地依據發酵菌株的生長特性以及發酵設備的種類而定，較佳是適當地考量在生產階段中之菌株的特性(characteristics)而選擇接種量。

根據一實施例，發酵大豆產物可以藉由將根據本發明之芽孢枯草桿菌菌株接種至大豆粕或大豆蛋白濃縮物，隨後進行固體發酵而獲得。例如，填充床(packed-bed)發酵器可被用於發酵過程中。填充床發酵器可包括各種種類，諸如批次式充氣培養裝置(batch-type aeration culture apparatus)、閉鎖式培養裝置(closed-type culture apparatus)、連續式充氣培養裝置(continuous-type aeration culture apparatus)或類似者，且只要可以被使用以製備發酵大豆產物，任何種類皆可被用於本發明之方法中而不被限制，且適當的裝置可根據生產規模(production scale)而被選擇及使用。舉例而言，以菌株接種之大豆粕或大豆蛋白濃縮物可被放置於填充床發酵器中，具有5公分(cm)至50公分的厚度並在20℃至50℃下發酵8小時至72小時。

根據一實施例，本發明之方法可進一步包含將發酵步驟後所獲得之發酵大豆產物在低溫及低濕度下乾燥及粉碎的步驟。在緊接發酵作用之後的發酵大豆產物之剩餘含水量(residual moisture content)可能是20%(v/w)至50%(v/w)。乾燥程序可被加入以製備具有10%(v/w)至12%(v/w)之含水量的發酵大豆產物的最終產物。由於團塊可能會形成於發酵大豆產物中，在發酵作用完成後，在乾燥步驟後可添加粉碎程序以使得發酵大豆產物的顆粒尺寸變得均一。乾燥及粉碎程序可以各種已知方法進行。然而，若乾燥係在過高溫度下進行，發酵大豆產物中的活細菌可能被殺死，因此，乾燥程序較佳在低溫下進行。另外，粉碎程序可被進行以依據發酵大豆產物的預期用途而使其具有各種尺寸；舉例而言，鎚碎機(hammer mill)可被使用。

由於低分子量胜肽之高含量，藉由使用根據本發明之芽孢枯草桿菌所製備之發酵大豆產物可改良動物之消化-吸收速率，且由於具有高蛋白質含量而可取代動物性蛋白質，因此其係高度適用於作為高品質的蛋白質飼料材料。

根據一實施例，本發明提供芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株(KCCM12038P)，菌株培養物(culture)、培養物之濃縮物，或培養物之乾燥產物。如上所述，菌株係一種新穎菌株，且使用菌株所製備之發酵大豆產物具有低含量之黏液但具有高含量之低分子量胜肽，並顯示抗菌活性。

根據一實施例，本發明提供包含芽孢枯草桿菌菌株的抗菌組成物、菌株培養物、培養物之濃縮物，或培養物之乾燥產物，且其具有對抗選自於由鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、美人魚發光桿菌(Photobacterium damsel)、鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)和愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)所組成之群組的至少一種病原的抗菌活性。有關上述內容之細節，可參考上述敘述內容以及實例。

根據一實施例，本發明提供包含由上述方法所製備之發酵大豆產物的飼料組成物。根據本發明之飼料組成物中之發酵大豆產物的含量可依據被施用之家畜的種類及年齡、施用型式、所欲效果或類似者而被控制。舉例而言，發酵大豆產物可被以1重量%至99重量%的量被使用，更具體而言，被以10重量%至90重量%，及20重量%至80重量%的量被使用，但本發明不限於此。

為了服用(administration)，除了發酵大豆產物之外，本發明之飼料組成物可進一步包括下列的混合物：至少一有機酸諸如檸檬酸、反丁烯二酸、己二酸、乳酸或類似物；磷酸鹽諸如磷酸鉀、磷酸鈉、聚磷酸鹽或類似物；天然抗氧化劑諸如多酚、兒茶素、生育酚、維生素C、綠茶提取物、甲殼素、單寧酸，或類似物。若需要的話，其他典型的添加劑諸如抗流感劑、緩衝劑、制菌劑(bacteriostatic agent)或類似物可被添加。另外，稀釋劑、分散劑、表面活性劑、黏著劑(binder)或潤滑劑可被額外添加以將該組成物調配成可注射的製劑(injectable preparation)諸如水溶液、懸浮液、乳液(emulsion)或類似物、膠囊、顆粒或錠劑。

更甚者，除了主要成分-包括蔬菜蛋白質飼料諸如粉狀或碎塊小麥、大麥、玉米或類似物，動物蛋白質飼料諸如血粉、肉粉、魚粉或類似物，動物脂肪以及蔬菜油-之外，本發明的飼料組成物可被與各種輔助組分，諸如胺基酸、無機鹽、維生素、抗氧化劑、抗真菌劑、抗微生物劑或類似物，營養補給、生長加速劑、消化-吸收加速劑，以及預防劑(prophylactic agent)一同使用。

當本發明之飼料組成物被用作飼料添加劑時，飼料組成物可單獨被添加或與其他組分一同被使用，且可以根據典型地方法而適當地被使用。飼料組成物可以被製備成立即釋放(immediate-release)配方或持續釋放(sustained-release)配方的服用形式，且與無毒之藥學可接受之載體組合。可食用的載體可為玉米澱粉、乳糖、蔗糖或是丙二醇。固體載體可以呈錠劑、粉末、藥片(troches)或類似者的服用形式，且液體載體可以呈糖漿 (syrups)、液體懸浮物、乳液、溶液或類似者的服用形式。另外，服用劑(administration agent)可包括防腐劑、潤滑劑、溶液加速劑，或是穩定劑且亦可包括其他用以改良發炎疾病的助劑，以及對預防病毒有效的物質。

本發明之飼料組成物可被應用於動物的飲食，即，用於許多動物包括哺乳動物、禽類、魚類及甲殼類的飼料。其可以被用於商業上重要的哺乳類，諸如豬、牛、羊或類似者，用於動物園的動物諸如大象、駱駝或類似者，或家畜諸如狗、貓等。商業上重要的禽類可包括雞、鴨、鵝或類似者，且商業上培育之魚類及甲殼類諸如鱒魚及蝦亦被包括。

根據本發明之飼料組成物可以基於家畜飼料之乾重，以每1公斤(kg)大約10克(g)至500克，較佳10克至100克的量被混合。在被完全混合後，飼料組成物較佳可以被作為粉料(mash)提供，或是進一步受到粒化(pelletizing)、擴大(extensification)或是擠製(extrusion)程序。

根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株提供用於製備發酵大豆產物之用途。

根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株具有絕佳抗菌活性及蛋白水解能力，並具有低黏液產生能力。因此，具有高含量之低分子量胜肽以及絕佳抗菌活性的的高品質發酵大豆產物可藉由將菌株接種至大豆粕或大豆蛋白濃縮物中而製備。特別是，若本發明之發酵大豆產物投餵給(delivered to)容易受到暴露於各種病原細菌影響的動物，由於其抗菌活性，不但由病原細菌所造成的感染率(infection rate)被降低，存活率增加，且由於高含量之低分子量胜肽，消化-吸收速率可被增強。

圖1為顯示發酵大豆蛋白濃縮物之照片。

圖2為顯示發酵大豆蛋白濃縮物之SDS-PAGE結果的圖表。

圖3為顯示發酵大豆粕之SDS-PAGE結果的圖表。

圖4為顯示在低濕度條件下的發酵大豆粕之SDS-PAGE結果的圖表。

圖5為顯示本發明之新穎芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株的譜系關係的系統發生樹(phylogenic tree)。

[實施例之詳細說明]

本發明係有關於新穎芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株、使用其製備發酵大豆產物的方法，以及其發酵產物。此後，本發明將以實例及實驗例的方式詳細敘述。然而，這些實例僅被提供用以達到說明之目的，且不應被解釋為限制本發明之範圍者。

此後，本發明將通過實例及實驗例而被詳細敘述。

[實例1]新穎芽孢枯草桿菌菌株之分離

已知被典型地用於大豆粕或大豆蛋白濃縮物之發酵的芽孢枯草桿菌(此後稱為「CJ823菌株」，請見韓國發明專利第10-1517326號)被製備，且接著菌株的改良係以下列方式進行。

首先，CJ823菌株藉由在TSB(Tryptic soy broth，胰化酪蛋白大豆培養液)平板培養基(plate medium)(培養基組成物：17.0克之酶解酪蛋白(enzymatic digest of casein)、3.0克之酶解大豆粕(enzymatic digest of soybean meal)、5.0克之氯化鈉(NaCl)、2.5克之磷酸氫二鉀、2.5克之右旋糖(dextrose)、15克之洋菜、25℃，最終pH值：7.3±0.2)中，於37℃下培養12小時而活化。經活化之菌株藉由將約2個接種環(platinum loop)(稀釋至波長660奈米下約0.2之吸光度)的量懸浮於9毫升之0.8%氯化鈉滅菌液(sterilizing solution)中而被作為種菌(seed culture)。50毫升之先前製備的TSB被以1%之菌種懸浮液接種並接著在37℃下以180rpm的速度培養直到660奈米下的吸光度達到約4.0至5.0。在培養種菌後，培養溶液被離心(8000rpm，4℃，10分鐘)以將細胞自上清液分離。經分離的細胞被以與培養溶液相同量之0.8%之NaCl滅菌液清洗兩次。20毫升之0.8% NaCl滅菌液被與細胞混合使得細胞濃度達到在660奈米下約0.8之吸光度，且15毫升之混合物被塗抹至無菌培養皿(sterile petri dish)。接著，使用UV燈(VIBER LOURMAT，115伏特，60赫茲)，在約50公分之高度照射波長為254奈米之UV射線至細胞。UV照射執行一段時間直到根據UV照射時間，野生種之菌株的死亡率達到99.99%。隨後，0.1毫升之經UV照射的混合物被添加至TSA平板培養基(培養基組成：胰化酪蛋白大豆洋菜(tryptic soy agar)，15克之酶解酪蛋白、5克之酶解大豆粕、5克之NaCl，15克之洋菜，25℃，最終pH：7.3±0.2)在37℃下經過12小時，且僅有突變菌株形成菌落被分離及獲得。

[實例2]芽孢枯草桿菌之蛋白水解能力及抗菌活性的量測

根據實例1之由分離而獲得的每個突變菌株的蛋白水解能力及抗菌活性由下列方法確認。作為控制組，本發明所屬領域中已知的枯草桿菌(Bacillus subtilis，存取碼KCCM11438P)及芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens，CJ823菌株)被使用(此後分別稱為控制組1及控制組2)。

1)蛋白水解能力

為了量測在實例1中所獲得的突變菌株的蛋白水解能力，菌株通過接種在包含2%(w/v)脫脂乳之YM洋菜培養基(3克之酵母萃取物、3.0克之麥芽精、10克之蛋白腖(peptone)、20.0克之洋菜)(Difco，USA)中進行培養，且由基質(substrate)降解所形成的淨區(clear zone，C)的尺寸在量測所形成之菌落(生長(G))的同時被量測。

更具體而言，各突變菌株在37℃下被於TSB培養基(培養基組成：17.0克之酶解酪蛋白、3.0克之酶解大豆粕、5.0克之NaCl、2.5克之磷酸氫二鉀、2.5克之右旋糖，最終pH值：25℃下7.3±0.2)中，伴隨200rpm之攪拌速度培養12小時。接著，每個突變菌株之1.0微升(μL)培養液被等分至包含脫脂乳之YM洋菜培養基並在37℃下培養16小時。在培養完成後，形成於培養基上的菌落的直徑(G)以及淨區的尺寸(C)被量測。

2)對抗鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)的抗菌活性

鼠傷寒沙氏桿菌(ATCC14028)-能夠導致家畜疾病的典型病原體-被使用以量測於上述實例1中所獲得的突變菌株的抗菌活性。更具體而言，突變菌株各自於GYP培養基(培養基組成：10克葡萄糖、8克酵母萃取物、2克聚蛋白腖(polypeptone)，pH：7.0)中，於37℃下，180rpm的攪拌速度下培養12小時。每個突變菌株之1.5微升培養液被等分至補充有1x10⁵CFU/毫升之鼠傷寒沙氏桿菌的GYP洋菜培養基(培養基組成：10克葡萄糖、8克酵母萃取物、2克聚蛋白腖、15克洋菜，pH：7.0)中，並於37℃下培養15小時。在培養完成後，突變菌株之菌落周圍所形成的淨區的尺寸被量測且抗菌活性之力價(titer)被量測。

表1顯示通過量測淨區(C)之尺寸所得的抗菌活性、菌落之直徑(G)、其等之比例(C/G)、其等之尺寸差異(C-G)，以及在菌株的培養完成後所量測之淨區的尺寸。

根據表1，在突變菌株中，CJ24-28、CJ24-29、CJ24-32、CJ24-33、CJ24-34及CJ24-36具有淨區之尺寸與形成菌落之尺寸之間較高的比例(C/G)(2.28-2.53)，其中CJ24-28、CJ24-29及CJ24-34具有最高的抗菌活性(都是+++++)。相對地，控制組1具有最低的C/G值，且控制組2具有第二低的C/G值(分別為1.00及1.50)，且其等的抗菌活性僅分別為++及++++。亦即，相較於傳統已知的枯草桿菌及芽孢枯草桿菌，已確認的是突變菌株具有經增強之蛋白水解能力及抗菌活性。因此，當菌株被應用於大豆蛋白濃縮物或大豆粕以製備發酵大豆產物，可以預期發酵大豆產物會顯示抗菌活性。

[實例3]CJ24-34菌株之抗菌活性的量測

進一步進行實驗以確認在實例2中被選為具有絕佳抗菌活性的菌株(CJ24-28、CJ24-29及CJ24-34)之中，由於具有最大的淨區尺寸(C)及菌落直徑(G)而具有絕佳蛋白水解能力的CJ24-34菌株，是否具有對抗沙氏桿菌(Salmonella)之外的病原微生物的抗菌活性。為了確認抗菌活性，病原微生物諸如創傷弧菌、腸炎弧菌、美人魚發光桿菌、鰻利斯頓氏菌、乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)、和愛德華氏菌被使用，且其等已知對養殖魚類造成疾病例如敗血症、霍亂弧菌對蝦造成弧菌病、對鰤魚造成巴氏桿菌症、對比目魚造成鏈球菌症(streptococcosis)，及對比目魚造成愛德華病。在病原微生物之中，創傷弧菌、腸炎弧菌、美人魚發光桿菌，及乳酸鏈球菌是由慶尚大學附設醫院分部國家病源體收集中心(Gyeongsang National University Hospital Branch of National Culture Collection to Pathogens)所獲得之菌株，而鰻利斯頓氏菌及愛德華氏菌係由KCTC(Korean Collection for Type Cultures，韓國菌種中心)獲得。各病原微生物係在下表2之對應的培養基及溫度中培養。接著，單一菌落(single colonies)被選擇，且被轉移到測試管並在對應的液體培養基中隔夜(overnight)預先培養(pre-cultured)。經預先培養溶液被再次以0.1%接種至100毫升之用於各病原細菌之對應的液體培養基，並培養約12小時。培養溶液被用於製備用於各病原細菌之洋菜培養基，以測試抗菌活性。

由在GYP洋菜培養基(1%葡萄糖、0.8%酵母萃取、0.2%蛋白腖、0.2%洋菜)中培養本發明之CJ24-34菌株所獲得的單一菌落被接種至包含3毫升之GYP培養基(1%葡萄糖、0.8%酵母萃取、0.2%蛋白腖)的試管中，並在37℃下以180rpm的速率進行隔夜預培養。經預培養之溶液再次於0.1%接種至100毫升之GYP培養基，並在37℃下以180rpm的速率培養。接著，培養16小時後及20小時後的培養液被收集(secured)，且各培養液之10毫升以8000rpm的速度在4℃下離心10分鐘以取得上清液。上清液被再次通過0.2微米的注射式過濾器過濾以製備濾液。

為了測試自洋菜培養基中CJ24-34菌株分泌(secreted)的抗菌物質之抗菌活性，對應於各病原細菌之培養條件的洋菜培養基被製備並在121℃下滅菌15分鐘。洋菜培養基被冷卻，且事先製備之各病原細菌之培養液在洋菜培養基固化之前被以1%添加至洋菜培養基並混合，且接著混合物被轉移至方形盤(square plate)以固化接種有各病原細菌之洋菜介質。佩尼圓筒杯(peni cylinder cup)被放置於完全固化之洋菜培養基盤上，且300微升之事先製備的CJ24-34濾液(16小時，20小時)被裝載(loaded)於各杯中，且對應之細菌係根據各病原細菌之培養條件進行培養。在培養完成後，出現在培養各病原細菌之洋菜培養基中的淨區的尺寸被量測。此時，佩尼圓筒杯的尺寸為7毫米(mm)，且淨區之尺寸係通過量測包括由抗菌物質所產生之淨區的點(spot)的直徑而進行比較。淨區之尺寸的增加代表病原細菌由於由CJ24-34菌株所分泌之抗菌物質而無法生長。另外，在此實驗中，產生於佩尼圓筒杯內部的淨區被解讀為抗菌活性的指示劑(indicator)，但其等的尺寸並未如同佩尼圓筒杯之外部所產生的淨區般量測。

參考表3中所述的淨區尺寸，已確認的是本發明之CJ24-34菌株分泌具有對抗特定病源細菌抗菌活性的抗菌物質。佩尼圓筒杯的尺寸是7毫米，且基於此，已確認的是CJ24-34菌株之抗菌物質抑制創傷弧菌、美人魚發光桿菌、鰻利斯頓氏菌，及愛德華氏菌的生長。同時，腸炎弧菌之淨區的尺寸為7毫米，其是與佩尼圓筒杯相同的尺寸，且在量測外部淨區的尺寸時可以被評估為不具有抗菌活性。然而，已確認的是當實質上從盤體上觀測時，淨區是部分存在於佩尼圓筒杯內部，且因此，可推論具有對抗此病原的一些抗菌活性。亦即，在此實驗中所測試的6種病原細菌中，CJ24-34菌株展現對抗5種病原細菌(創傷弧菌、腸炎弧菌、美人魚發光桿菌、鰻利斯頓氏菌，及愛德華氏菌)之抗菌活性。因此，當本發明之CJ24-34菌株被應用於大豆蛋白濃縮物或大豆粕，預期的是其中病原細菌之增生被避免之發酵大豆產物，以及包含其之動物飼料組成物可被製備。

[實例4]芽孢枯草桿菌之黏液產生能力之量測

為了確認在實例2中被選擇為具有絕佳蛋白水解能力及抗菌活性的突變菌株CJ24-28、CJ24-29及CJ24-34之黏液產生能力，菌株被進一步在GYP洋菜培養基中培養，且各菌落的表現型(phenotype)被密切觀測。敘述於實例2中之控制組2(芽孢枯草桿菌，CJ823菌株)被使用作為控制組。

實驗結果顯示控制組2的菌株菌落被觀測為黏且光滑的，此確認了黏液的產生，而實例2中選擇的突變菌株CJ24-28、CJ24-29及CJ24-34的菌落中，由於沒有觀測到光滑或是黏滯性，已確認其黏液的產生被抑制。

[實例5]CJ24-34菌株在大豆蛋白濃縮物中的黏液產生能力及發酵能力

進行實驗以確認當CJ24-34菌株藉由接種至大豆蛋白濃縮物而發酵時的黏液產生及發酵能力，在實例2及實例3中被選擇的突變菌株之中，此菌株已被確認具有絕佳蛋白水解能力及抗菌活性。實例2中提及的控制組1(枯草桿菌：存取碼KCCM11438P)及控制組2(芽孢枯草桿菌：CJ823)都被使用作為控制組。

CJ24-34菌株於GYP培養基(培養基組成：葡萄糖10克/升，酵母萃取8克/升，大豆蛋白腖2克/升)中預培養，且由預培養所獲得之培養液被再次接種至GYP培養基中，使得其等的量加總為1%，且進行培養直到在660奈米下之吸光度達到6或更高。

大豆蛋白濃縮物通過將含水量控制至約43%(v/m)而製備，並在100℃下進行熱處理30分鐘，接著冷卻至30℃至50℃。基於大豆蛋白濃縮物之重量的10重量%之CJ24-34菌株之培養液被接種至預處理之大豆蛋白濃縮物，且經接種之培養液的含水量被控制至約46%。

大豆蛋白濃縮物在維持於37℃之溫度及95%之濕度下的定溫及濕度室中進行發酵16小時。在發酵前，大豆蛋白濃縮物之pH為約6.8，且各菌株以約10⁷CFU/克之量接種。在發酵完成後，黏液的產生被檢查，且發酵產物之濕度、活菌數(viable cell count)及pH值被再次量測。

發酵產物之蛋白質含量以及蛋白質含量之增加係基於發酵產物乾燥後的乾重(dry weight)進行量測。

圖1為藉由應用CJ24-34菌株及兩個控制組菌株而發酵之發酵大豆蛋白濃縮物的照片。圖1A及圖1C分別為以控制組1(枯草桿菌)及根據本發明之CJ24-34菌株發酵之發酵大豆蛋白濃縮物的照片，且由於在發酵產物中未觀測到黏滯性或是團塊，已確認黏液的產生被抑制。相對地，圖1B係以控制組2(芽孢枯草桿菌)發酵之發酵大豆蛋白濃縮物的照片。發酵產物係非常黏滯的且形成團塊。亦即，傳統芽孢枯草桿菌產在發酵期間產生大量黏液，根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株幾乎不產生黏液，藉此確認其可被用於量產發酵產物。

為了檢驗使用本發明之CJ24-34菌株而製備的發酵產物之特性，發酵大豆蛋白濃縮物(其中包括各控制變數的各菌株被使用)之根據時間(0小時，16小時)之含水量、活菌數、pH、蛋白質含量及蛋白質含量的增加被確認(表4)。根據實驗結果，以根據本發明之CJ24-34菌株發酵的發酵大豆蛋白濃縮物具有約37%至39%之含水量、8或更高之pH值、以及約10⁹CFU/克或更高之活菌數。另外，相較於原料之蛋白質含量，蛋白質含量增加約4%，此確認了發酵能力。

[實例6]發酵大豆蛋白濃縮物之蛋白質降解及分子量分布

在此實例中，實例5之發酵大豆蛋白濃縮物的蛋白質降解及分子量分布被分析，以確認包括於發酵產物中之胜肽的尺寸及分布。上述參數係分別以SDS-PAGE及GPC量測。

1)SDS-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)

100毫克之原料(大豆蛋白濃縮物)及實例5中所製備之發酵大豆蛋白濃縮物(CJ24-34菌株及控制組1之發酵大豆蛋白濃縮物)各自被懸浮於5毫升之8M尿素溶劑中，經超聲波震盪(sonicated)，且接著以8000rpm離心10分鐘以分離上清液。上清液以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)定量並裝載於SDS-PAGE膠上。

圖2為顯示發酵大豆蛋白濃縮物之SDS-PAGE結果的圖表。自圖2的最左欄起，M代表生物標記，1代表原料(大豆蛋白濃縮物)之蛋白質分布，2及3代表根據本發明之CJ24-34菌株之發酵大豆蛋白濃縮物的蛋白質分布，而4及5代表控制組1之發酵大豆蛋白濃縮物的蛋白質分布。根據圖2所顯示的蛋白質分布，可以確認的是根據本發明之CJ24-34菌株的發酵大豆蛋白濃縮物幾乎不包含聚合物蛋白，且幾乎完全是由低分子量胜肽所組成，因此，在將對應的菌株應用為飼料時，可以預期會有消化-吸收速率的改良。相對地，控制組1之發酵大豆蛋白濃縮物仍然包含聚合物蛋白質，確認聚合物蛋白質並未適當地被分解。

2)GPC(凝膠滲透層析)

GPC為在被量測之樣品中推導蛋白質分子量分布的方法，其是藉由分析具有不同分子量的標準蛋白質以決定每個蛋白質的滯留時間，並接著通過計算標準曲線而推導分子量及滯留時間之間的關係。更具體而言，在具有特定分子量之蛋白質的滯留時間被計算後，層析圖係根據時間而被分割成不同區塊，且在整個層析圖區域中的每個分子量範圍之部分區域的比率被計算以推導蛋白質分子量分布。

100毫克之原料(大豆蛋白濃縮物)及根據實例5製備之發酵大豆蛋白濃縮物(CJ24-34菌株之發酵大豆蛋白濃縮物及控制組1之發酵大豆蛋白濃縮物)分別被懸浮於5毫升之8M尿素溶劑中，經超聲波震盪，並接著以8000rpm離心10分鐘以分離上清液。隨後，上清液通過0.45微米(μm)之針筒過濾器(syringe filter)而過濾，且濾液係由GPC分析。結果顯示於表5中。

表5顯示原料及發酵大豆蛋白濃縮物之GPC結果。如表5所示，根據本發明之CJ24-34菌株之發酵大豆蛋白濃縮物(1)及(2)包含約80%之具有30kDa或更低之分子量的胜肽，以及約55%之具有10kDa或更低之分子量的胜肽，確認這些發酵大豆蛋白濃縮物是大量由低分子量胜肽所構成。相對地，雖然與原料相比，控制組1之發酵大豆蛋白濃縮物包含較多之低分子量胜肽，具有10kDa或更低之分子量的胜肽的含量僅為約23%至24%，確認其等大多(mostly)是由高分子量胜肽所構成。

[實例7]CJ24-34菌株之大豆粕發酵能力、蛋白質降解，及分子量分布

為了確認根據本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株即使在施用於大豆粕時是否具有絕佳發酵能力，兩種芽孢枯草桿菌(KCCM11471P及KCCM11906P)-其等傳統上被使用為發酵大豆粕之生產菌株-被使用作為控制組，且其等的發酵能力被確認。KCCM11471P及KCCM11906P被分別標記為控制組3及控制組4。

芽孢枯草桿菌菌株於GYP培養基(培養基組成：葡萄糖10克/升，酵母萃取8克/升，大豆蛋白腖2克/升)中預培養，且由預培養所獲得之培養液被再次以1%接種至GYP培養基，值到660奈米下的吸光度達到6或更高。

大豆粕藉由將含水量控制至約43%(v/w)及在100℃下熱處理30分鐘，接著冷卻至30℃至50℃而製備。基於大豆粕之重量，10重量%之芽孢枯草桿菌培養液各自被接種至預處理之大豆粕中，且經接種之培養液的含水量係控制至約46%。在發酵前，大豆粕之pH值為約6.8，且各菌株以約10⁷CFU/克之量被接種。以培養液接種之大豆粕在維持於37℃之溫度及95%之濕度的定溫及溼度室中被發酵18小時。經發酵的大豆粕在發酵起始後14、16及18小時後被取樣且隨時間之蛋白質含量的改變被量測，而結果顯示於表6中。

[表6]

表6顯示發酵大豆粕中之蛋白質含量以及蛋白質含量的增加。如表6所示，CJ24-34菌株之發酵大豆粕的蛋白質含量以及蛋白質含量的增加較控制組3或控制組4者高。更具體而言，當進行相同時間的發酵作用時，CJ24-34菌株發酵大豆粕的蛋白質含量平均較控制組3高約1%，且較控制組4高約0.5%。從製備發酵大豆粕之技術觀點來看，藉由快速增加蛋白質含量來縮短發酵時間是非常重要的，且因此，本發明之芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株具有能夠改良發酵大豆產物之生產力並降低生產成本的優點。

同時，為了確認構成發酵大豆粕之胜肽的尺寸，以CJ24-34菌株發酵之發酵大豆粕以及原料(大豆粕)之蛋白質降解及分子量分布被分析。在此方面，GPC係以實例6中所敘述的相同方式使用。

圖3為顯示原料(大豆粕)及以CJ24-34菌株發酵之發酵大豆粕的SDS-PAGE結果的圖表。從圖3左欄起，M代表生物標記，1代表原料(大豆粕)之蛋白質分布，而2代表以本發明之CJ24-34菌株發酵之發酵大豆粕的蛋白質分布。如圖3所示，已確認的是根據本發明之CJ24-34菌株的發酵大豆粕幾乎不包含聚合物蛋白質且大多是由低分子量胜肽所構成，且因此，當對應的菌株被應用為飼料時，消化-吸收率之改良可被預期。

表7顯示用以檢測原料(大豆粕)及發酵大豆粕之胜肽組成的GPC結果。如表7中所示，原料(大豆粕)包含約82%之具有30kDa或更高之分子量的之胜肽，且主要係由高分子量胜肽所構成。相對地，以根據本發明之CJ24-34菌株發酵之發酵大豆粕包含約82%之具有30kDa或更低之分子量的胜肽，以及約58%之具有10kDa或更低之分子量的胜肽，確認其係大幅由低分子量胜肽所構成。亦即，包含於原料中的大部分聚合物蛋白質被分解成低分子量胜肽，且因此，當菌株被應用於飼料時，可以預期的是消化性可能增加。

[實例8]低濕度條件下CJ24-34菌株之大豆粕發酵能力

根據本發明之C24-34菌株於GYP培養基(培養基組成：葡萄糖10克/升、酵母萃取8克/升、大豆蛋白腖2克/升)中預培養，且自預培養所獲得的培養液被再次以1%接種至GYP培養基中，並進行培養直到660奈米下吸光度達到6或更高。

大豆粕係藉由將含水量控制在約31%(v/w)並於100℃下熱處理30分鐘，接著冷卻至30℃至50℃而製備。基於大豆粕之重量，10重量%之芽孢枯草桿菌培養液被接種至預處理之大豆粕中，且經接種之培養基(culture medium)之含水量被控制於約36%之低濕度條件。以培養液接種的大豆粕於維持在37℃之溫度及95%之濕度的定溫及溼度室中被發酵12小時。自發酵起始起8、10及12小時之發酵大豆粕被取樣，且含水量、活菌數、蛋白質含量，以及蛋白質含量的增加被量測。

如表8所示，隨著發酵時間經過，含水量逐漸降低且活菌數增加至7.0×10⁹CFU/克。另外，由於大豆粕之糖含量在芽孢枯草桿菌的生長期間被利用，已確認的是發酵產物的蛋白質含量在12小時後增加約4%。亦即，已確認的是根據本發明之菌株即使在低濕度條件下之大豆粕中仍具有發酵能力。為了確認在低濕度條件下之大豆粕中之胜肽的尺寸組成，SDS-PAGE及GPC被以敘述於實例6中之相同方式分析以確認蛋白質降解及分子量分布。

圖4為顯示低濕度條件下發酵大豆粕之SDS-PAGE結果的圖表。自圖4左欄起，M代表生物標記、1代表原料(大豆粕)之蛋白質分布，而2、3及4分別代表發酵8小時、10小時及12小時之發酵大豆粕的蛋白質分布。如圖4所示，隨著發酵期間大豆粕原料之聚合物蛋白質的分解，低分子量胜肽的含量增加，藉此確認當應用於飼料時，可能帶來增加消化能力的效果。

表9顯示根據原料及發酵時間(8、10、12小時)之低濕度條件下發酵大豆粕的GPC結果。如表9所示，以根據本發明之CJ24-34菌株發酵12小時的發酵大豆產物包含約52%之具有30kDa或更低之分子量的胜肽，以及約24.8%之具有10kDa或更低之分子量的胜肽。相對地，原料(大豆粕)幾乎是由聚合物胜肽所構成，其包含約16.3%之具有30kDa或更低之分子量的胜肽。亦即，可確認的是可觀量的包含於原料中的聚合物蛋白質被分解成低分子量胜肽，且因此，可以預期以本發明之CJ24-34菌株發酵的大豆粕在應用於飼料時，由於低分子量胜肽的高含量，可帶來消化率的增加。

[實例9]本發明之突變芽孢枯草桿菌CJ24-34菌株之16S rRNA基因序列及譜系學分析

對於根據本發明之CJ24-34突變菌株之辨識，菌株的16S rRNA基因序列使用顯示於下表10中的序列進行分析。

對於藉由16S rRNA基因之序列而進行菌株的辨識，菌株由PCR，使用27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，SEQ ID NO.1)及1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'，SEQ ID NO.2)作為通用因子(universal primer)進行放大(amplified)，並接著被純化。對於序列的決定，27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')，518F(5'-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3',SEQ ID NO.3)、805R(5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3'，SEQ ID NO.4)，及1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')被使用以分析1508bp之序列。序列使用BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits(應用生物系統公司(Applied Biosystems Inc.)，美國)被定序，並由ABI 3730XL DNA分析儀(應用生物系統，林肯中心大道850號，福斯特城，CA 94404，美國)進行分析。

16S rRNA序列之分析結果顯示，已確認的是本發明之CJ24-34突變菌株包含SEQ ID NO.5之16S rRNA序列。序列表係附於圖式的最後。基因序列的相似度藉由比較從EzTaxon伺服器(http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/)及GenBank/EMBL/DDBJ所註冊之序列而決定。

在使用序列進行多序列比對(multiple sequence alignment)後，譜系樹(phylogenic tree)係使用MEGA 6程式而產生，且分類位置(taxonomic position)被分析(圖5)。

由譜系學分析的結果可知，本發明之CJ24-34突變菌株顯示與芽孢枯草桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum) FZB42T(CP000560)相近的關係，其係標準菌株，且16S rRNA基因序列同源性(gene sequence homology)被確認為99.93%(1507bp/1508bp)。

根據本發明之突變菌株CJ24-34被命名為芽孢枯草桿菌植物亞種CJ24-34(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum CJ24-34)且依據布達佩斯條約於2017年6月15日被寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)存取碼為KCCM12038P。

[產業利用性]

本發明對於提供具有絕佳抗菌活性及蛋白質水解能力，以及低黏液產生能力的新穎芽孢枯草桿菌菌株、其中動物飼料之消化率被改良的低分子量胜肽之發酵大豆粕或發酵大豆蛋白濃縮物，以及其製備方法方面具有絕佳功效。因此，本發明係在動物飼料、食物及醫藥產業中非常有用的發明。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

寄存機關：財團法人食品工業發展研究所

寄存日期：2019年2月14日

寄存號碼：BCRC 910867

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

寄存國家：韓國

寄存機關：韓國微生物培養中心(國際寄存機構)

寄存日期：2017年6月15日

寄存號碼：KCCM12038P

<110> CJ Cheiljedang Corporation

<120> NOVEL BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS STRAIN AND METHOD FOR PREPARING FERMENTED SOY PRODUCT USING THE SAME

<130> OPA18233

<150> KR 10-2017-0111472

<151> 2017-08-31

<150> KR 10-2018-0054965

<151> 2018-05-14

<160> 5

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> universal primer for 16S rRNA for identification-27F

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> universal primer for 16S rRNA for identification-1492R

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> universal primer for 16S rRNA for identification-518R

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> universal primer for 16S rRNA for identification-805R

<400> 4

<210> 5

<211> 1508

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 16S rRNA sequence ofBacillus amyloliquefacienssubsp.plantarumCJ24-34

<400> 5

Claims

一種用以製備發酵大豆產物的方法，包含：將芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株接種至大豆粕或大豆蛋白濃縮物中；以及獲得藉由培養芽孢枯草桿菌菌株而發酵之發酵大豆粕或發酵大豆蛋白濃縮物。
如請求項1所述之用以製備發酵大豆產物的方法，其中，該發酵大豆產物具有對抗選自於鼠傷寒沙氏桿菌( Salmonella typhimurium)、創傷弧菌( Vibrio vulnificus)、腸炎弧菌( Vibrio parahaemolyticus)、美人魚發光桿菌( Photobacterium damsel)、鰻利斯頓氏菌( Listonella anguillarum)和愛德華氏菌( Edwardsiella tarda)所組成之群組的至少一病原的抗菌活性。
如請求項1或2所述之用以製備發酵大豆產物的方法，其中，該發酵大豆產物包含40%或更多之具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽。
如請求項1至3之任一項所述之用以製備發酵大豆產物的方法，進一步包含在將該菌株接種至該大豆粕或大豆蛋白濃縮物前，控制該大豆粕或大豆蛋白濃縮物之含水量並使該大豆粕或大豆蛋白濃縮物受到熱處理。
如請求項4所述之用以製備發酵大豆產物的方法，其中，該大豆粕或發酵大豆蛋白濃縮物之含水量係控制於30%(v/w)至80%(v/w)之範圍內，且該熱處理係在70℃至130℃下進行10分鐘至30分鐘。
如請求項1至5之任一項所述之用以製備發酵大豆產物的方法，其中，該芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株係在10 ⁵CFU/克至10 ⁹CFU/克的細胞計數下被接種。
如請求項1至6之任一項所述之用以製備發酵大豆產物的方法，其中，培養係在20℃至50℃下進行8小時至72小時。
如請求項1至7之任一項所述之用以製備發酵大豆產物的方法，還進一步包含乾燥及粉碎上述獲得之發酵大豆粕或發酵大豆蛋白濃縮物。
一種芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株。
一種抗菌組成物，其包含芽孢枯草桿菌CJ24-34(KCCM12038P)菌株、該菌株之培養物、該培養物之濃縮物，或該培養物之乾燥產物，且具有對抗選自於鼠傷寒沙氏桿菌( Salmonella typhimurium)、創傷弧菌( Vibrio vulnificus)、腸炎弧菌( Vibrio parahaemolyticus)、美人魚發光桿菌( Photobacterium damsel)、鰻利斯頓氏菌( Listonella anguillarum)和愛德華氏菌( Edwardsiella tarda)所組成之群組的至少一病原的抗菌活性。
一種發酵大豆產物，其係由如請求項1至8之任一項所述之用以製備發酵大豆產物的方法所製備。
一種動物飼料組成物，其包含如請求項11所述之發酵大豆產物。