KR20190128200A - 동물 기능 파라미터를 개선하는 바실러스 서브틸리스 균주 - Google Patents
동물 기능 파라미터를 개선하는 바실러스 서브틸리스 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 a) DSM32324로 기탁된 균주, b) DSM32325로 기탁된 균주, 및 c) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 감도를 갖고; 대장균 (Escherichia coli) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에 대한 억제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균주를 제공한다. 본 발명은 또한, 직접 공급 미생물 (Direct Fed Microbial, DFM), 프리믹스, 동물 사료 첨가제 또는 동물 사료로서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상, 좋기로는 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32324 및/또는 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325를 포함하는 바실러스 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, 본 발명에 따른 균주 또는 조성물을 동물에게 공급함으로써 i) 체중 증가 (WG) 상승, ii) 사료 전환율 (FCR) 저감, iii) 괴사성 장염 병변 점수 감소, iv) 괴사성 장염 빈도 감소, v) 괴사성 장염 사망률 감소, vi) 유럽 생산 효능 인자 (EPEF) 증가, 및 vii) 사망률 감소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물 기능 파라미터를 개선하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은
a) DSM32324로 기탁된 균주,
b) DSM32325로 기탁된 균주, 및
c) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감도 (sensitivity)를 갖고; 대장균 (Escherichia coli) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에 대한 억제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 돌연변이 균주
로 이루어진 군으로부터 선택된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 직접 공급 미생물 (Direct Fed Microbial, DFM), 프리믹스, 동물 사료 첨가제 또는 동물 사료로서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상, 좋기로는 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32324 및/또는 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325를 포함하는 바실러스 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명에 따른 균주 또는 조성물을 동물에게 공급함으로써
i) 체중 증가 (WG) 상승,
ii) 사료 전환율 (FCR) 저감,
iii) 괴사성 장염 병변 점수 감소,
iv) 괴사성 장염 빈도 감소,
v) 괴사성 장염 사망률 감소,
vi) 유럽 생산 효능 인자 (EPEF) 증가, 및
vii) 사망률 감소
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물 기능 파라미터를 개선하는 방법을 제공한다.
2006년 유럽 연합에서 항생제 성장 촉진제가 단계적으로 폐지됨에 따라 인간 및 수의학적 중요성 억제에 대하여 높은 효능 및 감수성 (susceptibility)을 갖는 비용-효과적인 사료 첨가제의 필요성이 증가하였다.
바실러스-계 프로바이오틱 사료 첨가제는 돼지와 가금류의 건강과 생산에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 포자는 열에 안정적이며 최대 90-95℃ 온도의 펠릿화 공정에서 살아남을 수 있기 때문에 이러한 산물들은 사료 산업과 관련된다. 내생포자-형성 박테리아인 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니프로미스 (Bacillus licheniformis)는 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 안전한 것으로 일반적으로 간주 (Generally Regarded as Safe, GRAS)되며 미국 사료 관리 협회 (Association of American Feed Control Officials, AAFCO)에 의해 동물 식이 또는 물에 포함이 허용된다.
WO2013/153159는 항생제 민감도, 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제 활성, 및 높은 포자 형성성을 갖는 바실러스 균주를 선택하는 방법을 기술한다.
선별된 많은 분리주들은 유럽 식품 안전청 (EFSA)에 의해 정의된 중단 지점을 넘는 바람직하지 않은 항생제 저항성을 보였으며 안전성 문제로 인해 폐기되었다. 상기 분리주들 중 몇몇은 클로스트리디움 퍼프린젠스의 억제를 나타낸 반면, 소수의 분리주들만이 대장균을 억제하였다. 병원체를 가장 잘 억제한 균주는 주로 B. 아밀로리퀴파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 종이었다.
WO2016/060934는 표 7에서 10종의 바실러스 균주들의 항-대장균 활성을 보여준다. 6종의 B. 아밀로리퀴파시엔스 균주 중 5종이 항-대장균 활성을 입증한 반면, 2종의 B. 서브틸리스 균주 중 오직 하나인, Kemin 제품인 클로스타트로부터 단리된 균주만이 항-대장균 활성을 나타내었다. 흥미롭게도, 이 균주는 나중에 B. 아밀로리퀴파시엔스인 것으로 밝혀졌다 (cf. WO2016/118840 (46 면, 23 행)).
WO2016118840은 생산 동물의 건강 및 기능을 개선하기 위한 다양한 바실러스 균주를 개시하는데, 특히 2종의 B. 아밀로리퀴파시엔스 균주 및 2종의 B. 서브틸리스 균주이다 (표 3.1 참조). 오직 2종의 균주들, DSM29870으로 기탁된 B. 서브틸리스 균주 및 DSM29869로 기탁된 B. 아밀로리퀴파시엔스 균주만이 시험된 8 가지 항생제 모두에 대해 민감한 것으로 밝혀졌다. 앰피실린에 대한 결과는 제공되지 않았다.
DSM29870으로 기탁된 B. 서브틸리스 균주는 시험관 내에서 대장균 균주들인 ATCC10535 및 ATC25922의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 4). 실시예 7은 3 종의 클로스트리디움 퍼프린젠스 챌린지 (challenge) 시험의 결과를 제공한다. 이들 시험에서 측정된 모든 파라미터와 관련하여 DSM29870 공급 그룹 (T4)와 바시트라신 공급 그룹 (T3) 간 유의한 차이는 없었다. 괴사성 장염 병변에 의한 BWG, FCR 및 조류 사망률에 대한 결과는 비-감염, 비-처리 그룹 (T1)과 감염, 비-처리 그룹 (T2) 사이의 중간이었다.
그러나, 생산 동물의 건강 및 기능을 개선시키기 위해 이용될 수 있는 프로바이오틱 균주에 대한 요구는 여전히 존재한다.
본 발명은
a) DSM32324로 기탁된 균주,
b) DSM32325로 기탁된 균주, 및
c) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감도를 갖고; 대장균 (Escherichia coli) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에 대한 억제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 돌연변이 균주
로 이루어진 군으로부터 선택된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균주를 제공한다.
박테리아 균주는 성장하거나 증식시 유전적으로 변하지 않고 남아있는 박테리아를 말한다. 이러한 동일한 박테리아 다수는 균주를 언급할 때 포함된다.
예를 들어, 직접 공급 미생물 (DFM), 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스, 또는 동물 사료로서, 본 발명에 따른 1종 이상의 바실러스 서브틸리스 균주를 포함하는 조성물은 동물에게 공급될 수 있다.
본 발명에 따른 1종 이상의 바실러스 서브틸리스 균주는, 공급자에 의한 생산 중에, 생산 후에, 또는 동물에게 급여하는 사람에 의하여 상기 동물에의 급여 제공 직전에, 사료에 첨가될 수 있다. 본원에 기재되는 방법 및 조성물에 사용된 바실러스 서브틸리스 박테리아는, 이들이 건조 펠릿화된 사료 산물을 제조하는 공정의 열 및 압력 조건에서 (포자로서) 생존할 수 있기 때문에 특히 적합하다.
클로스트리디움 퍼프린젠스로 인하여 야기되는 괴사성 장염은 현대 가금류 생산에 있어서 심각한 경제적 문제가 되었다. 실시예에 기재된 일부 생체 내 연구의 목적은 육계 케이지 연구 (broiler cage study)에서 괴사성 장염 (NE)의 발병에 대한 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주를 포함하는 사료 첨가제의 효과를 조사하는 것이었다. 가금류에서의 다른 생체 내 연구는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 이용하여 챌린지하거나 하지 않은 기능에 초점을 맞추었다.
바실러스 서브틸리스 DSM32324 및 DSM32325가 준임상 괴사성 장염의 발병에 미치는 영향을 평가하기 위하여 개별 배터리/플로어 펜 연구가 수행되었다. 하나는 유럽 (실시예 3, DSM32324)에 기반을 두고 하나는 미국 (실시예 4, DSM32325)에 기반을 둔, 두 개의 서로 다른 독립적인 연구 시설이 이용되었는데, 이는 2종 균주의 효과를 평가하기 위하여 약간 다른 평가 파라미터가 사용되었음을 의미한다.
바실러스 서브틸리스 DSM3234의 경우, 비처리 감염 대조 그룹에 비하여 사료 첨가제로서의 바실러스 서브틸리스 DSM3234를 고려할 때, 21 일, 35 일 및 42 일에 측정된 기능 파라미터들인 사료 전환율 (FCR) 및 평균 체중 증가 (AWG)가 모든 데이터 지점에서 유의미한 개선을 나타내었다. 놀랍게도, 바실러스 처리 그룹은, 비-감염, 비-의약 대조 그룹이 챌린지 받지 않았으며 건강하다고 간주되었음에도 불구하고, 후자 그룹과 유의한 차이를 보이지 않았다 (표 7).
유도된 준임상 생체 내 장염 챌린지 시험에서, 바실러스 서브틸리스 DSM3234는 닭의 괴사성 장염 병변 점수를 감소시키고 괴사성 장염 사망률을 유의하게 감소시켰다 (표 8).
바실러스 서브틸리스 DSM32325는, 25 일 및 26 일의 데이터를 조합하였을 때, 감염된 비처리 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 방식으로 닭의 괴사성 장염 빈도를 감소시켰다. 놀랍게도, 괴사성 장염 빈도는 아목시실린 처리 대조 그룹에서보다 바실러스 처리 그룹에서 심지어 더 낮았다 (표 9).
또한, 바실러스 서브틸리스 DSM32325는, 25 일 및 26 일의 데이터를 조합하였을 때, 감염된 비처리 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 방식으로 괴사성 장염 중증도 (평균 점수)를 감소시켰다. 놀랍게도, 상기 평균 점수는 아목시실린 처리 대조 그룹에서보다 바실러스 처리 그룹에서 심지어 더 낮았다 (표 10).
2종의 B. 서브틸리스 균주는 또한 두 가지 기능 급여 시험에서 평가되었는데, 실시예 5 (DSM32324 및 DSM32325) 및 실시예 6 (DSM32324)이다.
실시예 5는 1800 마리 Ross 308 수컷 육계의 시험 결과를 제공하고, 글로벌 비대 주기 (0-42 일령) 동안 바실리 균주 DSM32324 또는 DSM32325로 보충된 육계가 대조군 동물보다 유의하게 성장한다는 것을 발견하였다. DSM19489, DSM32324 및 DSM32325로 보충된 모든 육계의 사료 전환 (FCR) 및 EPEF는 대조군 동물의 것들에 비하여 유의하게 개선되었다.
실시예 6은 처리 그룹당 1300 마리 Ross 308 수컷 육계의 시험 결과를 제공하고, DSM19489는 사망률 감소 경향을 보이고 (p = 0.096) 바실러스 서브틸리스 DSM32324는 특히 피니셔 기간에 괄목하고 유의하게 사망률을 감소시켰음을 입증하는데, 이는 전체 시험에 대하여 사망률의 통계적 유의성도 제공하는 것이다.
실시예 7은 3 개의 선택된 바실리 균주 (DSM32324, DSM32325 및 DSM25840)의 기능 및 겉보기 회장 소화성에의 효과를 조사하고, 3 가지 균주 모두 놀랍게도 우수하고 현저히 개선된 결과를 보여주었다고 결론지었다.
DSM32324로 보충된 조류는 비-보충된 조류에 비하여 더 높은 일일 체중 증가 (표 16), 개시 기간 중 더 높은 일일 사료 섭취 및 사료 전환율을 보였고 (데이터 미도시), D42에 더 높은 단백질 소화율을 보였다 (표 17).
DSM25840로 보충된 조류는 비-보충된 조류에 비하여 더 높은 일일 체중 증가 (표 16) 및 개시 기간 중 더 높은 일일 사료 섭취를 보였고 (데이터 미도시), D42에 더 높은 체중 (표 16) 및 D42에 더 높은 회분, 단백질 및 에너지 소화율을 보였다 (표 17).
DSM32325로 보충된 조류는 비-보충된 조류에 비하여 더 높은 일일 체중 증가 (표 16) 및 개시 기간 중 더 높은 일일 사료 섭취를 보였고 (데이터 미도시), D42에 더 낮은 Ca 및 인 소화율을 보였다 (표 17).
결론적으로, 이들 연구는 DSM32324 및 DSM32325로 기탁된 바실러스 서브틸리스 균주들이 생체 내 챌린지 시험에서 괴사성 장염의 감소에 대한 효과 및 가금류의 기능 파라미터에 대한 긍정적인 효과를 보여준다는 것을 입증하였다. 중요한 발견은 체중 증가 (Weight Gain)의 현저한 상승, 사료 전환율 (FCR)의 현저한 감소, 사망률의 현저한 감소 및 유럽 생산 효능 인자 (EPEF)의 현저한 증가였다.
실시예 8은, DSM32324, DSM25840 및 DSM32325를 8:3:5의 비율로 포함하는 본 발명의 바실러스 조성물 EPB5가, 상기 프로바이오틱의 첨가없이 상응하는 식이를 급여받은 조류와 비교할 때 육계의 기능을 개선시켰다는 것을 보여준다. 사료 전환율 및 평균 체중 증가에 대하여도 긍정적인 반응이 입증되었다. 놀랍게도, EBP5 처리 그룹은 바실러스 단일 균주 처리 그룹에 비해 몇 가지 기능 파라미터에 있어서 유의미한 개선을 보였으며, 이는 다시금 비-의약 감염된 대조 그룹에 비해 기능 파라미터에 있어서 유의한 차이를 보여준 것이다. 또한, 단일 균주 바실러스 서브틸리스 DSM32234, 바실러스 서브틸리스 DSM32235와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 DSM25840 뿐만 아니라 조합인 EBP5 양자 모두가 닭의 괴사성 장염 병변 점수를 감소시키고 생체 내 챌린지 시험에서 괴사성 장염 사망률을 현저하게 감소시켰다.
실시예 9는 본 발명의 바실러스 조성물이, 상기 프로바이오틱의 첨가 없이 상응하는 급여를 받은 조류와 비교할 때, 250 mg/kg 내지 2000 mg/kg의 투여량 수준에서 1 일 내지 147 일령 (147-d 급여 기간)의 칠면조의 기능을 개선시켰음을 보여준다. 체중 증가, 사료 전환율 및 배설물의 건조 물질 함량에 대하여도 긍정적인 반응이 입증되었다.
실시예 10은 본 발명의 바실러스 조성물이, 백신의 초기 살모넬라 콜로니화 및 육계 닭에서 살모넬라 하이델베르크 (Salmonella Heidelberg) 챌린지에 대한 그의 후속 보호 능력에 영향을 미치지 않으면서 살아있는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella Typhimurium) 백신과 같은 백신과 조합될 수 있음을 보여준다. 이 연구는 백신과 바실러스 조성물 양자 모두를 포함하는 것에 추가적인 효과까지 있을 수 있다는 것을 보여준다 (표 20).
정의
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 및 문구는 그들의 기술적으로-인정 된 의미를 가지며, 이는 표준 텍스트, 저널 레퍼런스, 및 당업자에게 알려진 문맥을 참조하여 찾을 수 있다. 본원 개시의 맥락에서 이들의 특정 사용을 명확히 하기 위해 다음의 정의가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 표시하지 않는 한, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
동물 사료: "동물 사료"라는 용어는 동물이 섭취하기에 적합하거나 동물이 섭취하도록 의도된 임의의 화합물, 제제 또는 혼합물을 말한다. 단위 동물 (monogastric animal)에 대한 동물 사료는 농축물 뿐만 아니라 예를 들어 비타민, 미네랄, 효소, 아미노산 및/또는 다른 사료 성분 (예컨대, 프리믹스 형태의)을 포함한다. 동물 사료는 여물 (forage)을 더 포함할 수 있다. 가금류 사료의 예는 실시예 3 내지 7에 주어진다.
조성물: 용어 "조성물"은 본원에 기재된 바와 같은 담체 및 1종 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 말한다. 본원에 기재된 조성물은 직접 공급 미생물 (DFM), 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스 또는 동물 사료일 수 있다.
농축물: "농축물"이라는 용어는 어분, 당밀, 올리고새커라이드, 수수, 종자 및 곡물 (예컨대, 옥수수, 귀리, 호밀, 보리, 밀로부터 파쇄, 분쇄 등에 의하여 제조되는 것들 또는 그 전체 중 하나), 지방 종자 프레스 케이크 (예컨대, 면화씨, 홍화, 해바라기, 대두 (예컨대, 대두박), 유채/카놀라, 땅콩 (peanut) 또는 땅콩(groundnut) 유래), 야자 커널 케이크, 효모 유래 물질 및 주정박 (distillers grains)(예컨대, 습식 주정박 (wet distillers grains, WDS) 및 건조 주정박 (dried distillers grains with solubles, DDGS))와 같은 단백질 및 에너지 농도가 높은 사료를 의미한다.
C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염 제어: 용어 "C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염 제어"는 동물에서 C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 방법 및/또는 조성물을 의미한다. 따라서, 용어 "C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염 제어"는 C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염이 감소되거나 완전히 제거됨을 의미한다.
직접 공급 미생물: "직접 공급 미생물" 또는 "DFM"이라는 용어는 적절한 양으로 투여될 때, 숙주에서, 개선된 소화 또는 건강과 같은 이점을 부여하는, 포자를 포함하는 살아있는 미생물을 의미한다.
혐기성 조건에서의 효소적 활성: "혐기성 조건에서의 효소적 활성"이라는 용어는 혐기성 조건하에서 성장하는 동안 바실러스 균주에 의하여 생성되는 효소의 활성을 의미한다. WO2013/153159의 실시예 4는 효소 자일라나아제, 셀룰로오스 및 프로테아제의 생산을 위한 바실러스 균주를 시험하는 방법을 기술한다.
유럽 생산 효능 인자 (European Production Efficacy Factor, EPEF): 유럽 생산 효능 인자는 살아있는 조류떼의 기능을 비교하는 방법이다. 이 단일-수치는 농장 내 및 농장 간의 기능 비교를 용이하게 하며 환경, 기후 및 관리 변수를 평가하는데 사용될 수 있다. EPEF는 [(생존력 (%) x 생존 질량 (kg)) / (고갈 연령 (days) x FCR)] x 100으로 계산되며, 여기서 생존력은 연구 종료시 살아있는 조류의 백분율이고, 생존 질량은 연구 종료시 조류의 평균 체중 증가이고, 고갈 연령은 연구 종료시 조류의 연령이고, FCR은 연구 종료시 사료 전환율이다.
유효량/농도/투여량: "유효량", "유효 농도" 또는 "유효 투여량"이라는 용어는 동물의 소화 또는 수율을 향상시키기에 충분한 박테리아 균주(들)의 양, 농도 또는 투여량으로 정의된다. 절대 수의 실제 유효 투여량은, 문제 동물의 건강 상태, 다른 성분의 존재를 포함하는 요인들에 따라 달라진다. 박테리아 균주의 "유효량", "유효 농도" 또는 "유효 투여량"은 당업자에게 공지된 통상적인 분석에 의하여 결정될 수 있다. 가금류에 대한 유효량의 예는 실시예 3, 4, 5, 6 및 7에 주어진다.
사료 전환율 (FCR): FCR은 사료 질량을 원하는 산출량의 증가로 변환시키는 동물의 효율의 척도이다. 육류용으로 사육된 동물들 - 예컨대 돼지, 가금류, 소, 양 및 생선의 산출량은 그 동물이 얻은 질량이다. 구체적으로, FCR은, 특정된 기간을 통틀어 섭취된 음식의 질량을 산출량으로 나눈 것이다. FCR은 실시예 7에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다. FCR의 개선은 FCR 값의 감소를 의미한다.
동물에게 급여: "동물에게 급여하는" 또는 "동물에게 급여되는"이라는 용어는 본 발명의 조성물이 유효량으로 상기 동물에게 경구로 투여됨을 의미한다. 경구 투여는, 예컨대 특정된 기간, 예컨대 며칠, 1 주일, 몇 주, 1 개월 또는 몇 개월에 걸쳐 일일 1회 이상 반복될 수 있다. 가금류 급여는, 예컨대 실시예 3, 4, 5, 6, 및 7에 기술된 대로 수행될 수 있다. 따라서, "급여하는" 또는 "급여되는"이라는 용어는 임의 유형의 경구 투여, 예컨대 동물 사료 또는 식수를 통한 투여, 또는 특정 상황에서 경구 위관영양 또는 에어로졸 스프레이에 의한 투여를 의미한다.
여물: 본 명세서에서 정의되는 용어 "여물"은 또한 조사료 (roughage)를 포함한다. 여물은 신선한 식물 재료, 예컨대 여물 식물, 잔디 및 기타 여물 식물, 해초, 싹 튼 곡물 및 레귐 (legume)의 건초 및 사일리지, 또는 이들의 임의 조합이다. 여물 식물의 예는 알팔파 (루서른), 버즈풋 트레포일, 유채속 (예컨대, 케일, 유채 (카놀라), 루타바가 (스웨덴 순무), 순무), 클로버 (예컨대, 알자이크 클로버, 레드 클로버, 서브테라니안 클로버, 화이트 클로버), 잔디 (예컨대, 버뮤다 그래스, 브롬 그래스, 펄스 오트 그래스, 페스큐 (fescue), 히스 그래스, 메도우 그래스, 오차드 그래스, 라이그래스, 티머시 그래스), 옥수수 (메이즈), 기장, 보리, 귀리, 호밀, 수수, 대두 및 밀 및 비트와 같은 채소를 들 수 있다. 여물은 곡류 생산의 작물 잔류물들 (옥수수 대, 밀짚, 보리, 귀리, 호밀 및 기타 곡물), 비트 톱밥과 같은 채소 잔류물, 대두 줄기 및 잎과 같은 종자 생산 잔류물, 유채 및 기타 레귐, 및 동물 또는 인간 소비용 곡류 정제로부터의 또는 연료 생산 또는 기타 산업으로부터의 분획을 더 포함한다.
클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제 활성: 용어 "클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제 활성"은 클로스트리디움 퍼프린젠스의 성장이 억제되고 및/또는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 일부 또는 전부가 사멸됨을 의미한다. 이는 실시예 1에 기재된 분석에 의해 결정될 수 있다.
대장균에 대한 억제 활성: "대장균에 대한 억제 활성"이라는 용어는 대장균의 성장이 억제되고 및/또는 대장균의 일부 또는 전부가 사멸됨을 의미한다. 이는 실시예 1에 기재된 분석에 의해 결정될 수 있다.
단리됨: 용어 "단리됨"은 본 명세서에 기재되는 박테리아 균주가 자연적으로 발생하지 않는 형태로 또는 그러한 환경에 존재한다는 것을 의미하고, 즉 상기 균주가 자연에서 관련되는 자연 발생적 구성들 중 하나 이상 또는 모두로부터 적어도 부분적으로 제거된다는 것을 의미한다.
펠렛: "펠렛" 및/또는 "펠렛화"라는 용어는 고형의 둥근, 구형 및/또는 원통형 정제 또는 펠렛을 말하고, 이러한 고체 형태, 특히 사료 펠렛 및 고체 압출 동물 사료를 형성하는 방법을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "압출" 또는 "압출하는"은 당업계에 널리 공지된 용어이며, 본 명세서에서 기재되는 바와 같이 압력하에 오리피스를 통해 조성물을 강제하는 방법을 말한다.
가금류: "가금류"라는 용어는 그들이 생산하는 알 및/또는 그들의 고기 및/또는 그들의 깃털을 얻기 위하여 인간에 의하여 유지되는 길들여진 조류를 의미한다. 가금류는 종계, 육계 및 산란계를 포함한다. 가금류는 닭기러기류 (superorder Galloanserae)(파울), 특히 닭목 (order Galliformes)(닭, 뿔닭, 메추라기 및 칠면조 포함) 및 흔히 "물새"로 알려져 있고 집오리와 집거위를 포함하는 기러기목 (order Anseriformes)의 오리과 (family Anatidae)의 구성원을 포함한다. 가금류는 또한 그 고기를 목적으로 희생된 기타 조류, 예컨대 비둘기 및 타조를 포함한다. 가금류의 예로는 닭 (산란계, 육계 및 병아리 포함), 오리, 거위, 비둘기, 칠면조 및 메추라기를 들 수 있다.
C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염을 예방(하다): "C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염을 예방(하다)"라는 용어는 동물에서 C. 퍼프린젠스 감염 및/또는 괴사성 장염의 발병을 예방하는 방법 및/또는 조성물을 의미한다.
환원당: 환원당은 반응성 알데히드기를 갖거나, 당으로 하여금 환원제로서 작용할 수 있도록 하는 것을 형성할 수 있는 임의의 당이다. 환원 말단은 중합체 탄수화물들 간의 글리코시드 결합의 효소적 분해에 의하여 형성된다. 환원당은 글루코오스, 글리세르알데히드 및 갈락토오스뿐만 아니라 락토오스와 말토오스와 같은 디새커라이드를 포함하며 Nelson-Somogyi (NS) 또는 디니트로살리실산 (DNS) 방법으로 측정할 수 있다. DNS는 환원당 및 기타 환원 분자와 반응하여 3-아미노-5-니트로살리실산을 형성하는 방향성 화합물로, 540 nm에서 빛을 강하게 흡수한다. 분석은 사료가 동물에 의해 섭취되고 소화관에서 소화될 때의 상황을 시뮬레이션한다. 여러 가지 바실러스 균주들의 비전분 폴리새커라이드 (NSP)를 환원당으로 분해하는 능력이 실시예 2에서 조사되었다.
조사료 (roughage): "조사료"라는 용어는 섬유질, 밀기울, 종자 및 곡물의 겉껍질 및 작물 잔류물 (예컨대, (식물)대, 코프라, 짚, 겨, 사탕무 폐기물)과 같이 높은 수준의 섬유질을 갖는 건조한 식물성 물질을 의미한다.
항생제에 대한 민감함: "항생제에 대한 민감함"이라는 용어는 박테리아 균주의 성장이 상기 박테리아 균주가 달리 자라는 조건하에서 억제되는 박테리아 균주의 표현형적 특성을 의미한다. 이와 관련하여, 항생제에 대한 민감도는 CLSI 가이드라인 (M07-A8 및 M45-A2)에 따라 테스트된다. 바실러스 균주는, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대하여 단지 EFSA Journal 2012; 10(6):2740에 구체화된 중단점 농도나 그 아래에서 성장이 검출되는 경우 민감한 것으로 간주된다. 앰피실린에 대하여는, 바실러스에 대하여 EFSA에 의하여 주어진 어떠한 중단점은 없고; 민감한 것으로 간주되는 균주에 대한 중단점 4 mg/L이 선택되었다.
사일리지 : "사일리지"라는 용어는, 말 및 반추 동물, 예컨대 낙타, 라마, 소, 양과 같은 초식 동물에게 급여하거나 혐기성 소화조의 바이오 연료 공급스톡으로 사용될 수 있는 발효된 고-수분 저장 사료를 의미한다. 이는, 인사일리지, 인사일리징 또는 사일리징이라고 불리는 공정에서 발효되고 저장되며, 보통 녹색 식물 전체를 이용하여 (곡물만이 아님), 그래스나 시리얼 작물 (에컨대, 메이즈, 수수, 귀리, 호밀, 티모시, 포리지 그래스 식물) 또는 클로버/트레포일, 알팔파, 베치류와 같은 레귐 작물로부터 만들어진다. 많은 농작물로부터 사일리지를 만들 수 있으며 유형에 따라 특수 용어를 사용할 수 있다 (귀리에 대하여 오틀리지, 알팔파에 대하여 헤일리지). 사일리지는 자른 녹색 초목을 사일로에 넣거나, 플라스틱 시트로 덮인 큰 더미에 쌓거나, 큰 베일을 플라스틱 필름으로 싸서 만들어진다.
포자: "포자" 및 "내포자"라는 용어는 상호 교환 가능하고, 당업자에게 잘 알려져 있고 이해되는 일반적인 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바, 포자라는 용어는 휴면기의 보호된 비-생식 상태의 미생물을 말한다.
안정한: 용어 "안정한"은 당업계에 공지된 용어이며, 양호한 측면에서, 안정하다는 것은 미생물이, 동물의 건강을 개선시키기 위하여 그 동물에게 투여될 때까지 살아있는 형태로 유지될 수 있는 그 미생물의 능력을 의미하는 것으로 의도된다.
돼지: "돼지 (swine)" 또는 "돼지 (pig)"라는 용어는, 고기와 같은 음식을 위하여, 인간에 의하여 길들여진 가축 돼지를 의미한다. 돼지는 Sus 속의, 예컨대 Sus scrofa domesticus 또는 Sus domesticus의 구성원을 포함하며, 자돈, 이유돈, 육성돈, 피니셔, 호크, 폴트, 길트, 모돈 및 임신 모돈을 포함한다.
식물성 단백질: 용어 "식물성 단백질"은 변형된 단백질 및 단백질-유도체를 포함하는 식물로부터 유래하거나 또는 식물로부터 기원하는 1종 이상의 단백질을 포함하는 임의의 화합물, 제제 또는 혼합물을 말한다.
식물성 단백질은 식물성 단백질 공급원, 예컨대 레귐 및 시리얼, 예컨대 콩과 (Fabaceae)(Leguminosae) 패밀리의 식물, 예컨대 대두, 루핀, 완두콩 또는 콩; 십자화과, 명아주과, 예컨대 비트, 사탕무, 시금치 또는 퀴노아; 및 벼과로부터의 물질로부터 유래할 수 있다. 식물성 단백질 공급원의 다른 예는 시리얼, 예컨대 보리, 밀, 호밀, 귀리, 메이즈 (옥수수), 쌀 및 수수이다.
체중 증가: 동물의 체중 증가는 특정 기간에 걸친 동물의 체중 증가이다. 평균 체중 증가 결정의 예는 실시예 3에서 주어지고 일일 체중 증가 결정의 예는 실시예 7에서 주어진다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대하여 민감도를 갖고; 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제 활성을 갖는, DSM32324로 기탁된 균주, DSM32325로 기탁된 균주, 및 DSM32324 또는 DSM32325의 돌연변이 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바실러스 서브틸리스 균주를 제공한다.
본원에 기재되는 박테리아 균주는 단리된 것으로, 즉 자연에 발생하지 않는 형태 또는 환경으로 존재한다.
"돌연변이 박테리아" 또는 "돌연변이 균주"는 모 균주 DNA에는 존재하지 않는, 그 게놈 (DNA)에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연적 (자발적, 자연 발생적) 돌연변이 박테리아 또는 유도된 돌연변이 박테리아를 말한다. "유도된 돌연변이체"는 그 돌연변이가 인간의 처리에 의해 유도된, 예컨대 종래 사용되는 임의의 돌연변이화 처리를 이용하는 처리에 의하여 유도되는 박테리아로서, 예컨대 그 처리는 화학 돌연변이제, 예컨대 (i) 염기 유사체와 같이 DNA와 관련되거나 그 안으로 혼입되는 돌연변이제, 예컨대 2-아미노푸린 또는 ICR-191과 같은 인터킬레이팅 제제, (ii) DNA와 반응하는 돌연변이제, 예컨대 알킬레이팅 제제, 예컨대 니트로소구아니딘 또는 하이드록실아민, 또는 에탄 에틸 술포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘 (NTG), UV- 또는 감마 조사 등이다. 반면에, "자발적 돌연변이체"또는 "자연 발생적 돌연변이체"는 인간에 의하여 돌연변이화되지 않은 것이다. 돌연변이체는 몇몇 돌연변이화 처리를 받았을 수 있지만 (단일 처리는 스크리닝/선택 단계가 뒤따르는 하나의 돌연변이화 단계로 이해되어야 한다), 현재는 20 가지 이하, 10 가지 이하, 또는 5 가지 이하의 처리 (또는 스크리닝/선택 단계)가 수행되는 것이 선호된다. 현재 양호한 돌연변이체에 있어서, 박테리아 게놈에서 뉴클레오티드의 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만 또는 심지어 0.0001% 미만이 모 균주와 비교하여 다른 뉴클레오티드로 대체되거나 결실되었다.
상기 기재된 바 돌연변이 박테리아는 비-GMO이며, 즉 재조합 DNA 기술에 의하여 변형되지 않는다. 무작위 돌연변이화에 의하여 돌연변이체를 제공하는 상기 양호한 방법에 대한 대안으로서, 예컨대 위치-지정 돌연변이화에 의하여, 예컨대 적절하게 설계된 클로닝 기술을 사용함으로써 그러한 돌연변이체를 제공하는 것 또한 가능하다.
돌연변이체가 자발적으로 발생하는 돌연변이체로 제공되는 경우, 상기 균주는 임의의 선행하는 돌연변이화 처리없이 선택 단계를 거친다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 DSM32324의 뉴클레오티드 서열에 대하여 98% 이상 (예컨대, 98.5% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 99.5% 이상, 예컨대 99.6% 이상, 예컨대 99.7% 이상, 예컨대 99.8% 이상, 예컨대 99.9% 이상)의 서열 동일성을 갖는다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 DSM32324의 아미노산 서열에 대하여 98% 이상 (예컨대, 98.5% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 99.5% 이상, 예컨대 99.6% 이상, 예컨대 99.7% 이상, 예컨대 99.8% 이상, 예컨대 99.9% 이상)의 서열 동일성을 갖는다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 DSM32325의 뉴클레오티드 서열에 대하여 98% 이상 (예컨대, 98.5% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 99.5% 이상, 예컨대 99.6% 이상, 예컨대 99.7% 이상, 예컨대 99.8% 이상, 예컨대 99.9% 이상)의 서열 동일성을 갖는다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 DSM32325의 아미노산 서열에 대하여 98% 이상 (예컨대, 98.5% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 99.5% 이상, 예컨대 99.6% 이상, 예컨대 99.7% 이상, 예컨대 99.8% 이상, 예컨대 99.9% 이상)의 서열 동일성을 갖는다.
바실러스 균주는 그 억제 구역이 최소 0.5 mm (낮은 억제)이면 대장균에 대한 억제 활성을 나타내는 것으로 간주된다. 좋기로는, 상기 억제 구역은 0.5 mm 이상 내지 2 mm (중간), 보다 좋기로는 2 mm 이상 (높음)이다. 상기 억제 구역은 다양한 대장균 균주에 대하여 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 대장균에 대한 억제 활성을 나타내는 것으로 여겨지는 균주는, 시험된 모든 대장균 균주에 대하여 적어도 0.5 mm의 억제 구역을 나타내어야 한다. 좋기로는, 대장균 균주 중 2, 3, 4종 또는 더욱 좋기로는 모든 5종의 대장균 균주들에 대한 억제 구역은 적어도 0.5 mm 내지 2 mm이다. 더더욱 좋기로는, 대장균 균주 중 2, 3, 4종 또는 더욱 좋기로는, 모든 5종의 대장균 균주들에 대한 억제 구역은 2 mm를 넘는다.
바실러스 균주는 그 억제 구역이 최소 0.5 mm (낮은 억제)이면 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제 활성을 나타내는 것으로 간주된다. 좋기로는, 상기 억제 구역은 0.5 mm 이상 내지 2 mm (중간), 보다 좋기로는 2 mm 이상 (높음)이다. 상기 억제 구역은 다양한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주에 대하여 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제 활성을 나타내는 것으로 여겨지는 균주는, 시험된 모든 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주에 대하여 적어도 0.5 mm의 억제 구역을 나타내어야 한다. 좋기로는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 중 2, 3, 4종 또는 더욱 좋기로는 모든 5종의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주들에 대한 억제 구역은 적어도 0.5 mm 내지 2 mm이다. 더더욱 좋기로는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 중 2, 3, 4종 또는 더욱 좋기로는, 모든 5종의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주들에 대한 억제 구역은 2 mm를 넘는다.
좋기로는, 바실러스 균주는 또한 비 전분 폴리새커라이드 (NSP)의 분해로부터 환원당의 양을 증가시킬 수 있어야 한다. NSP를 환원당으로 분해하는 여러 가지 바실러스 균주들의 능력이 실시예 2에서 조사되었으며, 결과는 표 4에 제공되어 있다. 상기 실시예에서 개요된 대로 시험되었을 때 500 kJ/kg 이상의 사료에 대하여 이용가능한 양의 당을 증가시키는 능력을 가지는 균주들이 양호한 것으로 여겨진다.
상세한 분석 설명에 기초하여, 당업자는 특정 바실러스 균주가 상기 항생제 민감도, 억제 활성 및 NSP를 분해하는 능력을 따르는지 여부를 결정하기 위하여 이들 분석을 반복할 수 있다. 이러한 방식으로, 당업자는 상기 언급된 특성을 갖는 균주들을 일관되게 생성할 수 있을 것이다. 좋기로는, 당업자는 또한, 예컨대 WO2013/153159에 기술된 바와 같이, 상기 균주가 위장관에서 충분한 정도로 생존할 수 있는지를 보장하기 위하여 pH 4에서 상기 영양 세포의 민감도를 분석하고, 및 담즙 저항성을 분석하는 것을 포함시킬 것이다. 명백히, 이들 분석은 임의의 순서로 수행될 수 있으며, 기준을 충족시키지 못하면 일부 균주들은 과정 중에 제외될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상을 포함하는 바실러스 조성물을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 상기 바실러스 조성물은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 바실러스 조성물은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 2종, 예컨대 바실러스 서브틸리스 DSM32324 및 바실러스 서브틸리스 DSM32325의 조합을 포함한다.
본 발명에 따른 바실러스 조성물은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 중 1종 이상과 1종 이상의 다른 바실러스 균주의 조합을 포함할 수 있다. 상기 바실러스 조성물은 2종 이상의 균주, 예컨대 3종 이상, 예컨대 4종 이상, 예컨대 5종 이상의 바실러스 균주를 포함할 수 있는데, 그들 중 하나 이상은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주이다.
상기 바실러스 조성물에서 바실러스 균주는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 바실러스 조성물은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상 및/또는 바실러스 리체니포르미스 균주 1종 이상 및/또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 1종 이상을 포함할 수 있는데, 예컨대, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 2종 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 1종 이상이다. 상기 조성물은 바실러스 서브틸리스 DSM32324 및/또는 바실러스 서브틸리스 DSM32325를, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 DSM25840 및/또는 바실러스 리체니포르미스 DSM17236 및/또는 바실러스 서브틸리스 DSM19489와 조합하여 포함할 수 있다. 본 발명의 바실러스 균주와 다른 바실러스 균주의 임의의 다른 가능한 조합이 또한 이루어질 수 있다. 특정 예시로서, 상기 바실러스 조성물은 바실러스 서브틸리스 DSM32324, 바실러스 서브틸리스 DSM32325 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 DSM25840을 포함한다. 다른 특정 예시로서, 상기 바실러스 조성물은 바실러스 서브틸리스 DSM32324, 바실러스 서브틸리스 DSM32325 및 바실러스 리체니포르미스 DSM17236을 포함한다. 또 다른 특정 예시에서, 상기 바실러스 조성물은 바실러스 서브틸리스 DSM32324, 바실러스 서브틸리스 DSM32325 및 바실러스 서브틸리스 DSM19489를 포함한다.
하나 이상의 균주가 사용되는 경우, 조성물 중 각 균주의 분율은, CFU/조성물g으로 계산된 박테리아 단리물의 총량의 1 내지 99%, 예컨대 20 내지 80%, 예컨대 30 내지 70%, 더욱 특히 20%, 33%, 40% 또는 50%일 것이 고려된다. 각 균주는 대략 동일한 수 또는 비동일한 수로 존재할 수 있다.
본 발명의 양호한 구현예는 DSM32324, DSM25840 및 DSM32325를 8:3:5의 비로 포함하는 바실러스 조성물이다.
관련된 바실러스 균주(들)은 당업자에게 공지된 상업적으로 관련된 형태로 제공된다. 따라서, 한 가지 구현예에서, 상기 조성물의 바실러스 균주(들)은 건조된 (예를 들어, 분무 건조된) 또는 동결된 형태로 존재한다. 상기 조성물은 임의의 적절한 형태로, 예컨대 액체 형태로 제공될 수 있는데, 예컨대 겔, 슬러리, 분말 또는 펠렛이다.
양호한 구현예에서, 상기 바실러스 조성물은 상기 조성물 내에서 각각의 박테리아 균주들 105 내지 1012 CFU/g, 예컨대 5 x105 내지 1012 CFU/g, 더 좋기로는 106 내지 1012 CFU/g, 및 가장 좋기로는 107 내지 1012 CFU/g, 예컨대 108 내지 1011 CFU/g, 예컨대 109 내지 1010 CFU/g을 포함한다. 상기 바실러스 조성물은 조성물 그램당 각 균주 5 x 104 CFU 이상을 포함하는데, 이것이 본 발명의 조성물을 예컨대 자연 발생적 균주들을 갖는 동물 사료와 구별한다.
용어 "CFU/g"는, 칼슘 카보네이트와 같은 담체, 알루미늄 실리케이트 및 키이젤구어 (규조토)와 같은 케이킹방지제, 및 상기 조성물에 존재하는 기타 성분을 포함하는 조성물의 그램 중량에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 바실러스 균주 1종 이상 및 담체 1종 이상 및/또는 상기 조성물을 동물에게 급여하기에 적합하게 만드는 또는 식수용 첨가제로서 다른 성분을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "프리믹스"는, 후에 원하는 포함률로 동물 사료에 첨가되는, 프리믹스를 만들기 위한 담체에 첨가된 바실러스 균주를 말한다.
혹은, 본 발명의 바실러스 균주 1종 이상은 하기에 상세히 논의되는 바와 같이 동물 사료 성분과 함께 제형화될 수 있다. 이러한 조합은 표준 펠렛화 공정을 통해 압출되는 펠렛 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 바실러스 균주 1종 이상을 동물 사료 또는 그의 관련 성분에 첨가하는 단계를 포함하는, 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스의 제조 방법을 제공한다.
바실러스 박테리아는 더 많은 영양 세포로 분열할 수 있는 포자 및 영양 세포로서 존재한다. 본원에서 바실러스를 언급할 때, 이는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 포자 및 영양 세포 양자 모두에 관한 것이다.
본 발명의 바실러스 조성물에서, 바실러스 균주(들)은 좋기로는 포자로서 제공된다. 포자 형성의 주요 기능은 일반적으로 환경적 스트레스 기간 동안 박테리아의 생존을 보장하는 것이다. 따라서, 이들은 자외선 및 감마선, 건조 (desiccation), 리소자임, 온도, 기아 및 화학 살균제에 내성이다. 포자 코트는 많은 독성 분자에 대해 불침투성이며 발아에 관여하는 효소를 함유할 수도 있다. 코어는 DNA 및 리보솜과 같은 일반적인 세포 구조들을 갖지만, 포자는 대사적으로 비활성이다.
박테리아의 영양 형태는 박테리아 병원체를 감소시키거나 동물의 위장관에서 다른 유익한 효과를 가질 수 있는 이펙터를 생성한다. 따라서, 동물에 투여한 후 포자의 재활성화 및 발아가 중요하다.
문헌으로부터, 담즙이 동물의 GIT에서 영양 세포의 생존 및 발아 및 성장에 약간의 부정적인 영향을 미친다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 프로바이오틱 박테리아는 동물 사료에 첨가하기 위한 프로바이오틱 바실러스 조성물로서 유용하기 위하여는 일반적으로 낮은 pH를 견딜 수 있고 담즙 염에 저항성이어서 동물의 장에서 생존 및 증식할 수 있어야 한다. 실시예는 이와 관련하여 유용한 시험관 내 시험을 제공한다. 낮은 pH (위장 조건을 시뮬레이션)에 대한 민감도 시험은 영양 세포의 pH 4에 대한 내성에 중점을 두고 있다. 포자가 pH 2-3에서 내성이며 영양 세포는 pH 2에서 사멸할 것이라는 점은 잘 알려져 있다. 그러나, 위장의 pH는 특히 급여 조건에서 최대 4의 pH 값을 가질 수 있다. 이것은 포자의 발아를 초래할 수 있으며, 따라서 pH 4에서 영양 세포의 민감도를 시험하는 것은 중요하다. 선택된 균주는 좋기로는 pH 4에서 내성이어야 한다.
DSM32324 및 DSM32325로 기탁된 바실러스 서브틸리스 균주들을, pH 4에서 영양 세포의 민감도 및 담즙 저항성에 대하여 분석하여 상기 균주들이 적합한지 확인하였다.
바실러스 조성물은 1종 또는 2종의 상이한 B. 서브틸리스 균주들 및/또는 1종 또는 2종의 B. 리체리포르미스 균주들 및/또는 1종 또는 2종의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주들을 포함할 수 있고, 각 균주는 특정한 역할 및/또는 기능을 수행할 수 있도록 독립적으로 선택된다. 이들 균주들의 조합은 동물 사료, 예컨대 가금류 사료와 조합되어 궁극적으로 농업 동물 (예컨대, 가축 및/또는 가금류)의 건강과 생산성을 향상시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 균주들 및/또는 조합된 균주들은 가금류에서 위장 병원체를 감소시키고 상업적 가금류의 체중 증가를 상승시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 바실러스 조성물은 백신, 예컨대 살아있는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella Typhimurium) 백신과 조합되어, 살모넬라에 의한 감염을 감소시키고 및/또는 FCR을 증가시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상을 포함하고, 하나 이상의 농축물(들), 비타민(들), 미네랄(들), 효소(들), 아미노산(들) 및/또는 기타 사료 성분(들)을 더 포함하는 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스를 제공한다. 한 가지 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 바실루스 서브틸리스 균주 DSM32324를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325를 포함한다. 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 바실러스 서브틸리스 DSM32324 및 바실러스 서브틸리스 DSM32325 양자 모두를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 동물 사료는 여물을 포함한다. 일반적으로, 여물은 식물성 단백질 공급원을 포함한다. 특정 구현예에서, 식물성 단백질 공급원은 콩과 (family Fabaceae)의 식물 1종 이상으로부터의 물질이다. 다른 특정 구현예에서, 상기 식물성 단백질 공급원은 명아주과 (family Chenopodiaceae)의 식물 1종 이상으로부터의 물질이다. 식물성 단백질 공급원의 다른 예시는 유채 및 양배추이다. 다른 특정 구현예에서, 대두는 양호한 식물성 단백질 공급원이다. 예로서, 여물은 0-80% 메이즈; 및/또는 0-80% 수수; 및/또는 0-70% 밀; 및/또는 0-70% 보리; 및/또는 0-30% 귀리; 및/또는 0-40% 대두박; 및/또는 0-10% 어분; 및/또는 0-20% 유장을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 상기 여물 및 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상은 농축물과 혼합된다. 다른 구현예에서, 상기 여물 및 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상은 프리믹스와 혼합된다. 또 다른 구현예에서, 상기 여물 및 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상은 비타민 및/또는 미네랄과 혼합된다. 또 다른 구현예에서, 상기 여물 및 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상은 1종 이상의 효소와 혼합된다. 또 다른 구현예에서, 상기 여물 및 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상은 기타 사료 성분, 예컨대 착색제, 안정제, 성장 개선 첨가제 및 방향성 화합물/향료, 폴리불포화 지방산 (PUFA); 반응성 산소 생성 종, 항균성 펩티드, 항진균성 폴리펩티드 및 아미노산과 혼합된다.
특정 구현예에서, 상기 동물 사료는 예컨대, 자돈의 급여를 위하여 밀크 (예컨대, 모돈, 소, 염소, 양)로 구성되거나 이를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 동물 사료는 예컨대, 자돈의 급여를 위하여 밀크 대체물로 구성되거나 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 동물 사료는 1종 이상의 비타민, 예컨대 1종 이상의 지용성 비타민 및/또는 1종 이상의 수용성 비타민을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 동물 사료는 1종 이상의 미네랄, 예컨대 1종 이상의 미량 미네랄 및/또는 1종 이상의 매크로 미네랄을 포함할 수 있다. 보통 지용성- 및 수용성- 비타민과, 미량 미네랄은 사료 첨가를 위하여 의도되는 소위 프리믹스의 일부를 형성하는 반면, 매크로 미네랄은 보통 사료에 별도로 첨가된다. 지용성 비타민의 비제한적 예는 비타민 A, 비타민 D3, 비타민 E 및 비타민 K, 예컨대 비타민 K3를 포함한다. 수용성 비타민의 비제한적 예는 비타민 B12, 비오틴 및 콜린, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니아신, 엽산 및 판토테네이트, 예컨대 Ca-D-판토테네이트를 포함한다. 미량 미네랄의 비제한적 예는 붕소, 코발트, 클로라이드, 크롬, 구리, 플루오라이드, 요오드, 철, 망간, 몰리브덴, 셀레늄 및 아연을 포함한다. 매크로 미네랄의 비제한적 예는 칼슘, 마그네슘, 포타슘 및 소듐을 포함한다.
본 발명의 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 또한 피타아제 (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); 자일라나아제 (EC 3.2.1.8); 갈락타나아제 (EC 3.2.1.89); 알파-갈라토시다아제 (EC 3.2.1.22); 프로테아제 (EC 3.4); 포스포리파아제 A1 (EC 3.1.1.32); 포스포리파아제 A2 (EC 3.1.1.4); 리소포스포리파아제 (EC 3.1.1.5); 포스포리파아제 C (3.1.4.3); 포스포리파아제 D (EC 3.1.4.4); 아밀라아제, 예컨대 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1); 리소자임 (EC 3.2.1.17); 및 베타-글루카나아제 (EC 3.2.1.4 또는 EC 3.2.1.6), 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 첨가되는 아미노산 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 동물 사료에 사용되는 아미노산의 예는 리신, 알라닌, 베타-알라닌, 트레오닌, 메티오닌 및 트립토판이다. 본 발명의 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 착색제, 안정제, 성장 개선 첨가제 및 방향성 화합물/향료, 폴리불포화 지방산 (PUFA); 반응성 산소 생성 종, 항균성 펩티드 및 항진균성 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 착색제의 예는 베타-카로틴, 아스타잔틴 및 루테인과 같은 카로티노이드가 있다. 방향성 화합물/향료의 예는 크레오솔, 아네톨, 데카-, 운데카- 및/또는 도데카-락톤, 이오논, 아이론, 진저롤, 피페리딘, 프로필리덴 파탈리드, 부틸리덴 파탈리드, 캡사이신 및 타닌이 있다. 폴리불포화 지방산의 예는 C18, C20 및 C22 폴리불포화 지방산이며, 예컨대 아라키돈산, 도코소헥사엔산, 에이코사펜타에노산 및 감마-리놀레산이다. 반응성 산소 생성 종의 예는 화학제, 예컨대 퍼보레이트, 퍼술페이트 또는 퍼카보네이트; 및 효소, 예컨대 옥시다아제, 옥시제나아제 또는 신테타아제이다.
한 가지 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 하나 이상의 항콕시듐제제를 포함한다.
상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 담체를 더 포함한다. 상기 담체는 하기 화합물들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 물, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 1,2-프로필렌 글리콜 또는 1,3-프로필렌 글리콜, 소듐 클로라이드, 소듐 벤조에이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 술페이트, 포타슘 술페이트, 마그네슘 술페이트, 소듐 티오술페이트, 칼슘 카보네이트, 소듐 시트레이트, 덱스트린, 말토덱스트린, 글루코오스, 수크로오스, 소르비톨, 락토오스, 유청, 유청 퍼미에이트, 밀가루, 밀기울, 옥수수 글루텐 박, 전분 및 셀룰로오스.
한 가지 구현예에서, 상기 1종 이상의 박테리아 균주는 펠릿화를 위한 압출 공정 동안 가해지는/달성되는 압력을 받을 때 안정적이다. 특정 구현예에서, 상기 1종 이상의 박테리아 균주는 1 bar 내지 40 bar 범위의 압력에서 안정하다.
특정 구현예에서, 상기 1종 이상의 박테리아 균주는 고온에서 안정하다. 특히, 상기 박테리아 균주는 펠렛화를 위한 압출 공정 동안 달성되는 온도에 노출될 때 안정적이다. 보다 특정한 구현예에서, 상기 1종 이상의 박테리아 균주는 70℃ 내지 120℃ 범위의 온도에서 안정하다.
한 가지 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 추가 미생물 1종 이상을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 하기 속 중 하나 이상으로부터의 박테리아를 더 포함한다: 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코쿠스 (Lactococcus), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 바실러스 (Bacillus), 페디오코쿠스 (Pediococcus), 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 카르노박테리움 (Carnobacterium), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 클로스트리디움 (Clostridium) 및 메가스파에라 (Megasphaera) 또는 이들의 임의의 조합.
특정 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 하기 균주들 중 하나 이상으로부터의 박테리아를 더 포함한다: 바실러스 아밀로리퀴파시엔스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 심플렉스 (Bacillus simplex), 바실러스 모자벤시스 (Bacillus mojavensis), 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis), 바실러스 심플렉스 (Bacillus simplex), 바실러스 아트로파에우스 (Bacillus atrophaeus), 바실러스 메틸로트로피쿠스 (Bacillus methylotrophicus), 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실러스 발리스모르티스 (Bacillus vallismortis), 바실러스 테킬렌시스 (Bacillus tequilensis) 또는 이들의 임의의 조합.
특정 구현예에서, 상기 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스는 1종 유형 이상의 효모를 더 포함한다. 1종 유형 이상의 효모는: 새커로마이세타세아에 (Saccharomycetaceae), 새커로마이세스 (Saccharomyces)(예컨대, S. 세레비시아에 (S. cerevisiae) 및/또는 S. 불라르디이 (S. boulardii)), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces)(예컨대, K. 막시아누스 (K. marxianus) 및 K. 락티스 (K. lactis)), 칸디다 (Candida)(예컨대, C. 유틸리스 (C. utilis), 토룰라 (Torula) 효모라고도 불림), 피치아 (Pichia)(예컨대, P. 파스토리스 (P. pastoris)), 토룰라스포라 (Torulaspora)(예컨대, T. 델브루에키이 (T. delbrueckii)), 파피아 (Phaffia) 효모 및 바시디오마이코타 (Basidiomycota)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
동물 식이는, 예를 들어 매쉬 사료 (비-펠렛) 또는 펠렛 사료로서 제조될 수 있다. 통상, 분쇄된 사료 (feed-stuff)를 혼합하고, 문제 종의 사양에 따라 충분량의 필수 비타민 및 미네랄이 첨가된다. 박테리아 배양물 및 임의의 효소는 고체 또는 액체 제제로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 매시 사료의 경우, 성분 혼합 단계 전이나 단계 중에 고체 또는 액체 배양물 제제가 첨가될 수 있다. 펠렛 사료의 경우, (액체 또는 고체) 바실러스 조성물은 또한 사료 성분 단계 전이나 단계 중에 첨가될 수 있다. 통상, 본 발명의 액체 바실러스 조성물은 임의로 폴리올, 예컨대 글리세롤, 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 함께 박테리아 균주(들)을 포함하고, 펠렛화 단계 후에, 예컨대 펠렛 상에 상기 액체 제제를 분무함으로써 첨가된다. 박테리아는 또한 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스에 포함될 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 예컨대, 대장균 및/또는 클로스트리디움, 예컨대 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile ), 클로스트리디움 노비이 (Clostridium novyi), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 또는 클로스트리디움 셉티쿰 (Clostridium septicum)에 의한 박테리아 집락 또는 감염의 예방 또는 제어에 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 예컨대, 대장균 및/또는 클로스트리디움, 예컨대 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile ), 클로스트리디움 노비이 (Clostridium novyi), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 또는 클로스트리디움 셉티쿰 (Clostridium septicum)에 의한 박테리아 집락 또는 감염의 예방 또는 제어를 위한 방법으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 균주 또는 본 발명에 따른 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 동물에서 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 바실러스 조성물을 동물, 특히 단위 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물 급여 방법에 관한 것이다.
단위 동물은 가금류, 예컨대, 육계, 종계, 산란계, 칠면조, 타조, 메추라기, 오리 및 거위, 초식 동물, 예컨대 말 및 반추 동물, 예컨대 낙타, 라마, 소 및 양, 송아지, 돼지, 예컨대 자돈, 이유돈, 육성돈, 피니셔, 호크, 폴트, 길트, 모돈, 임신 모돈, 설치류, 예컨대 토끼, 애완 동물, 예컨대 고양이 및 개 및 물고기 (연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어를 포함하지만 이에 국한되지 않음); 및 갑각류 (쉬림프 및 프로운을 포함하지만 이에 국한되지 않음)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 돼지 및/또는 가금류가 양호한 단위 동물이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상의, 또는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상을 포함하는 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스의, 동물, 특히 단위 동물의 기능을 개선하기 위한 용도에 관한 것이다.
실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주의 투여는 동물의 위장 건강을 개선, 예를 들어 장염을 예방 또는 제어하고, 대조군에 비하여 처리된 동물에 대한 개선된 동물 기능 파라미터를 제공한다. 동물 기능 파라미터는 체중 증가 (WG), 사료 전환율 (FCR), 사망률 감소 및 유럽 생산 효능 인자 (EPEF)의 증가를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 균주 또는 본 발명에 따른 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는, 동물 사료의 소화율, 예컨대 단백질 소화율을 증가시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물 기능 파라미터를 개선하기 위한, 본 발명에 따른 균주, 또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다:
i) 체중 증가 (WG) 상승,
ii) 사료 전환율 (FCR) 감소,
iii) 괴사성 장염 병변 점수 감소,
iv) 괴사성 장염 빈도 감소,
v) 괴사성 장염 사망률 감소,
vi) 유럽 생산 효능 인자 (EPEF) 증가, 및
vii) 낮은 사망률.
본 발명의 양호한 구현예에서, "동물 기능"은 동물의 체중 증가에 의하여 및/또는 사료 전환율에 의하여 결정된다. "동물 기능 개선"은, 본 발명의 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스를 포함하지 않는 동물 사료에 비하여, 동물 사료에서 상기 본 발명의 동물 사료, 동물 사료 첨가제 또는 프리믹스 사용의 결과로 체중 증가 상승 및/또는 사료 전환율 감소 및/또는 사료에서 영양소 소화율이나 소화 에너지 및/또는 대사 에너지의 개선 및/또는 사료 효율 증가가 있음을 의미한다. 좋기로는, "동물 기능 개선"은 체중 증가 상승 및/또는 사료 전환율 감소가 있음을 의미한다.
"체중 증가 상승"은 상기 본 발명의 사료 조성물 없는 사료로 급여된 동물에 비하여 사료 조성물을 포함하는 사료로 급여되어 체중이 증가된 동물을 말한다. 구체적으로, 동물의 체중 증가 (WG)는 특정 기간 동안의 동물의 체중 증가이다. 한 가지 구현예에서, 체중 증가의 향상은 0.5% 이상, 예를 들어 1% 이상, 예를 들어 2% 이상, 예를 들어 2.5% 이상, 예를 들어 3% 이상, 예를 들어 4% 이상, 예를 들어 5% 이상, 예를 들어 6% 이상, 예를 들어 7% 이상, 예를 들어 8% 이상, 예를 들어 9% 이상, 예를 들어 10% 이상의 것이다.
한 가지 구현예에서, 체중 증가의 향상은 0.5% 이상, 예를 들어 0.8% 이상, 예를 들어 1.2% 이상, 예를 들어 1.5% 이상, 예를 들어 1.8% 이상, 예를 들어 2.0% 이상, 예를 들어 2.5% 이상, 예를 들어 3.0% 이상, 예를 들어 4.0% 이상, 예를 들어 5.0% 이상, 예를 들어 6.0% 이상, 예를 들어 7.0% 이상의 체중 증가를 결과한다. 양호한 구현예에서, 체중 증가의 향상은 1.8% 내지 2.0%, 2.0% 내지 2.2%, 2.2% 내지 2.4%, 2.4% 내지 2.6%, 2.6% 내지 2.8%, 2.8% 내지 3.0%, 3.0% 내지 3.2%, 3.2% 내지 3.4%, 3.4% 내지 3.6%, 3.6% 내지 3.8%, 3.8% 내지 4.0%, 4% 내지 5%, 5% 내지 7%, 7% 내지 10%, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 체중 증가를 결과한다.
"사료 전환율 감소" 또는 "사료 전환율 개선"은 사료에서 사료 첨가제 조성물의 이용이, 사료가 상기 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않을 때 특정 양으로 동물의 체중을 증가시키는데 필요로 되는 사료의 양과 비교하여, 동물의 체중을 동일한 양으로 증가시키기 위해 상기 동물에게 급여되는데 필요로 되는 상기 사료의 양 감소를 결과한다는 것을 의미한다.
한 가지 구현예에서, 사료 전환율 (FCR)의 개선은 -2.5% 이하, 예를 들어 -2.6% 미만, 예를 들어 -2.7% 미만, 예를 들어 -2.8% 미만, 예를 들어 -2.9% 미만, 예를 들어 -3.0% 미만의 FCR을 결과한다. 양호한 구현예에서, FCR의 개선은 -5% 내지 -2%의 FCR, 예를 들어 -4% 내지 -2%의 FCR, 예를 들어 -3.5% 내지 -2.5%의 FCR을 결과한다. 특정 구현예에서, FCR의 개선은 -5% 내지 -4.5%, -4.5% 내지 -4%, -4% 내지 -3.8%, -3.8% 내지 -3.6%, -3.6% 내지 -3.4%, -3.4% 내지 -3.2%, -3.2% 내지 -3.0%, -3.0% 내지 -2.8% 및 -2.8% 내지 -2.5%, 또는 이들 간격의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 간격 내 FCR을 결과한다.
본원에서 사용되는 영양분 소화율은 위장관 또는 위장관의 특정 분절, 예를 들어 소장에서 사라지는 영양분의 분율을 의미한다. 영양분 소화율은, 대상체에게 투여되는 것과 대상체의 대변에서 배출되는 것 사이의 차이 또는 대상체에게 투여되는 것과 위장관의 특정 분절, 예컨대 회장의 소화물에 잔류하는 것 사이의 차이로 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 영양분 소화율은, 일정 기간 동안의 배설물의 총수집에 의한 영양분 섭취와 배설된 영양분 사이의 차이로 측정될 수 있으며; 또는 동물에 의하여 흡수되지 않는 불활성 마커를 사용하여, 연구원이 전체 위장관 또는 위장관 분절에서 사라진 영양분의 양을 계산할 수 있게 함으로써 측정될 수 있다. 이러한 불활성 마커는 티탄늄 다이옥사이드, 크롬 옥사이드 또는 산 불용성 재일 수 있다. 소화율은 사료 내 영양분의 백분율 또는 사료 내 영양분의 질량 단위당 소화 가능한 영양분의 질량 단위로서 표현될 수 있다. 본원에 사용되는 영양분 소화율은 전분 소화율, 지방 소화율, 단백질 소화율, 미네랄 소화율 및 아미노산 소화율을 포괄한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물 기능 파라미터를 개선하는 방법에 관한 것으로:
i) 체중 증가 (WG) 상승,
ii) 사료 전환율 (FCR) 감소,
iii) 괴사성 장염 병변 점수 감소,
iv) 괴사성 장염 빈도 감소,
v) 괴사성 장염 사망률 감소,
vi) 유럽 생산 효능 인자 (EPEF) 증가, 및
vii) 낮은 사망률,
상기 방법은 본 발명에 따른 균주 또는 본 발명에 따른 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 유동적 사료 제제 (flexible feed formulation, FFF)에 이용될 수 있는데, 여기서 동물은 대사 가능한 에너지가 감소된 사료 및 본 발명의 조성물로 급여되고, 그로 인하여 사료의 대사 가능한 에너지 감소에도 불구하고 허용 가능한 동물 기능 및/또는 사료 전환율이 얻어진다. 감소된 대사 가능한 에너지는 문제의 동물에 대한 표준 사료의 97% 내지 99%, 예를 들어 97% 내지 98% 또는 98% 내지 99%의 수준일 수 있다.
기탁 및 전문가 솔루션
바실러스 리체니포르미스 균주 DSM17236은 2005년 4월 7일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 서브틸리스 균주 DSM19489는 2007년 6월 27일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 모자벤시스 균주 DSM25839는 2012년 4월 3일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 DSM25840은 2012년 4월 3일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 서브틸리스 균주 DSM25841은 2012년 4월 3일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 DSM27032는 2013년 3월 21일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 서브틸리스 균주 DSM32324는 2016년 6월 8일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325는 2016년 6월 8일에 Chr. Hansen A/S, Denmark에 의하여 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig)에 기탁되었다. 상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다.
상기 기탁된 미생물들 모두에 대하여, 하기의 추가 사항을 적용한다:
각 지정국의 각 특허청에 대하여, 출원인은 상기 진술된 기탁 미생물의 샘플을 특허가 허여되는 날 또는 출원이 거절 또는 철회되었거나 철회된 것으로 간주되는 날까지 신청자가 지정한 전문가에게만 제공하도록 요청한다.
시험관 내 실시예
실시예 1
병원체 억제 및 항생제 민감도에 대한 스크리닝
재료:
빌 인퓨전 브로쓰 (VIB) (Difco, 234420)
빌 인퓨전 브로쓰 (VIB) 아가 (VIB + 1.5% 박토 아가 (Agar no. 1), Oxoid LP0011)
뮬러 힌튼 브로쓰 2, 양이온-조정 (Fluka)
T3 아가 플레이트 (리터당: 3 g 트립톤, 2 g 트립토오스, 1.5 g 효모 추출물, 0.05 M 소듐 디하이드로젠 포스페이트 및 0.005 g MnCl2 [pH 6.8], 및 15 g 아가)
로라-베르타니 (LB) 브로쓰 (g/L: 박토 트립톤 10 (Difco 0123), 효모 추출물 5 (Oxoid L21), NaCl 10 (Merck nr. 106404))
브레인 하트 인퓨전 (BHI) 아가 (Oxoid CM375)
담즙 염 (담즙 추출물, 돼지 유래; Sigma B8631)
바이오분석 디쉬 (Nunc 240845)
페트리 디쉬 (Procudan 140096, 립 페트리디쉬)
펩톤 함유 생리 식염수 (0.9% 소듐 클로라이드, 1% 펩톤) FKP
ISO-SENSITEST 브로쓰 (Oxoid CM0473)
마이크로타이터 플레이트 (MTP) NUNC, Denmark
옴니 트레이/싱글 웰 플레이트 N 242811 Thermo Scientific/NUNC Denmark
깊은 웰 마이크로타이터 96 웰 트레이 (DW) Rnase/ DNase 무함유 (Thermo Fisher Science)
앰피실린 (Sigma, A9518-5G)
반코마이신 (Sigma, V1764-250MG)
젠타마이신 (Sigma, G1264-50MG)
카나마이신 (Sigma, K1377-1G)
스트렙토마이신 (Sigma, S6501-5G)
에리쓰로마이신 (Sigma E-5389)
클린다마이신 (Sigma, C2569-10MG)
테트라사이클린 (Sigma T-7660)
클로람페니콜 (Sigma, C0378-5G)
대장균 O101 H-, K99 F5 (State Serum Institute, Copenhagen, Denmark)
대장균 O147:K89 F4 H19 (State Serum Institute, Copenhagen, Denmark)
대장균 O149:k91,k88a,c,h10 NCTC10650, (National Collection of Type Cultures, England)
대장균 ATCC11775 (American type culture collection)
대장균 Cp6salp3 (Copenhagen Veterinary University)
클로스트리디움 퍼프린젠스 타입 A, DSM756, Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
클로스트리디움 퍼프린젠스 타입 C, NCTC3180, National Collection of Type Cultures (England)
클로스트리디움 퍼프린젠스 CCUG2036(Culture Collection, University of Gothenburg, Sweden)
클로스트리디움 퍼프린젠스 CCUG2037(Culture Collection, University of Gothenburg, Sweden)
클로스트리디움 퍼프린젠스 CCUG44727(Culture Collection, University of Gothenburg, Sweden)
상기 언급된 모든 병원체 균주들은 -80℃에서 BHI 내 20% 글리세롤을 함유하는 LB에 유지되었다.
바실러스
배양체:
대변, 토양, 식품 공급원으로부터 단리되고 균주 은행 콜렉션으로부터 수집 된 바실러스 균주들은 -80℃의 MTP 마스터 플레이트에서 20% 글리세롤을 함유하는 VIB에서 유지되었다.
박테리아 포자-형성 호기성 단리물은 16S 리보솜 서열 및 gyrB (Wang et al., 2007)에 의해 확인되었고, 하기 기재되는 바와 같이 문헌 ["Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to inhibitorys of human and veterinary importance." EFSA Journal 2012;10(6):2740]에 따라 항생제 감수성에 대하여 스크리닝하고, WO2013/153159에 기재되는 바와 같이 낮은 pH, 효소 활성, 여러 가지 배지에서의 성장, 내열성 및 포자형성에 대한 담즙 저항성 및 민감도에 대하여 스크리닝하였다.
MIC로
측정되는 항생제 감수성
다수의 항생제에 대한 최소 억제 농도 (MIC)를 측정함으로써 바실러스 균주들을 항생제 감수성에 대하여 분석하였다. 사용된 방법은 CLSI 표준 (Clinical and Laboratory Standards Institute M07-A8 및 M45-A2)에 개요된 바와 같은 브로쓰 마이크로희석 방법이었다.
시험될 항생제의 2-배 연속 희석으로 (총부피 100 ㎕/웰), 밤새 배양한 시험될 균주의 현탁액을 대략 105 CFU/ml (콜로니-형성 단위/ml)의 농도로 마이크로타이터 플레이트에서 ISO-SENSITEST 브로쓰 (Oxoid CM0473)에 접종하고 37℃에서 20-24 시간 동안 호기성 배양하였다. 가시적 성장을 억제하는 항생제의 최저 농도로서 20 시간 배양한 결과가 기록되었다. 시험은 2 개의 독립적인 생물학적 반복시험으로서 2 회 수행되었다.
EFSA 지침에 따라 억제에 감수성이 있는 바실러스 균주들만이 병원성 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스의 억제에 대한 스크리닝에 포함되었다.
병원성 대장균의
억제를위한
바실러스
균주의 스크리닝
바실러스 균주들은 MTP 마스터 플레이트의 50 ㎕ 부피로 DW 플레이트 내 VIB 700 ㎕에 첨가되었고 37℃ 및 175 rpm으로 밤새 배양되었다. 대장균 균주들을 30℃에서 밤새 LB에서 성장시켰다. 밤새 배양한 2 ml의 대장균 배양물을 50℃의 200 ml 액체 VIB 아가와 혼합하고, 각각의 바이오 어세이 디쉬에 부었다. 디쉬를 멸균 벤치에서 건조시켰다. 밤새 배양한 바실러스 배양물 각 2 ㎕를 바이오 어세이 디쉬에서 대장균과 혼합된 VIB 아가의 표면에 스팟팅하고 37℃에서 1 일 동안 배양하였다.
바실러스 주변의 명확한 억제 구역의 반경을 측정하였고,
"3 = 높음" - 2 mm 이상,
"2 = 중간" - 0.5 내지 2 mm 및
"1 = 낮음" - 0.5 mm 미만 및
0 = 억제 없음으로 기록하였다.
아가
스팟
시험에 의한
클로스트리디움
퍼프린젠스
억제
VIB 아가를 바이오어세이 디쉬 (디쉬당 200 ml)에 붓고 멸균 벤치에서 완전히 건조시켰다. 밤새 배양된 바실러스 배양체 각 2 ㎕를 VIB 아가 디쉬의 표면에 스팟팅하고 밤새 37℃에서 배양하였다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주들을 37℃의 BHI 아가 상에서 밤새 혐기 성장시켰다. 밤새 배양된 클로스트리디움 퍼프린젠스의 배양물을 2 ml 내지 200 ml의 액체 BHI 아가의 부피로 첨가하고, 바실러스 스팟을 갖는 바이오어세이 디쉬로 부드럽게 혼합 및 오버레이하였다. 디쉬를 37℃에서 1 일 동안 혐기성 배양하였다.
바실러스 주변의 명확한 억제 구역의 반경을 측정하였고,
"3 = 높음" - 2 mm 이상,
"2 = 중간" - 0.5 내지 2 mm 및
"1 = 낮음" - 0.5 mm 미만 및
0 = 억제 없음으로 기록하였다.
모든 데이터는 별도의 날에 반복시험되었다.
결과
표 1
대장균에 대한, 선택된 바실러스 균주들의 억제 결과
표 2
클로스트리디움에 대한, 선택된 바실러스 균주들의 억제 결과
표 1 및 표 2의 대장균 및 클로스트리디움에 대한 억제 결과는 시험된 바실러스 리체니포르미스 균주들 및 다수의 바실러스 서브틸리스 균주들이 대장균에 대한 어떠한 억제를 입증하지 못하였고 열악한 클로스트리디움 억제를 나타내었다는 것을 보여준다.
실시예 2
바실러스 조성물로 배양된 사료에서 환원당의 양 측정
이 실험의 목적은, 여러 가지 바실러스 균주들의, 시판 가금류 스타터 사료에서 NSP를 분해하고 이용 가능한 당의 양을 증가시키는 능력을 조사하기 위한 것이었다.
표 3
분석에 이용된 화합물 사료의 조성
멸균을 위하여 밀-옥수수-대두계 화합물 사료 (표 3)를 121℃에서 15 분 동안 오토클레이브하였다. 그 후, 전체 실험에 걸쳐 약 6 내지 6.5의 pH를 보장하기 위해 사료 샘플을 소듐 포스페이트 완충액으로 20 배 희석하였다. 바실러스 산물은 빌 인퓨전 브로쓰 (VIB) (Difco, 234420)에서 성장시킨, 밤샘 배양 2% 바실러스 균주 배양물로 접종시켜 얻었다. 환원당 분석을 위하여 (DNS) 샘플을 채취하였다 (T = 0). 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후, CFU 측정을 위해 샘플을 취하였다. 다른 샘플을 원심 분리하고 상층액을 사용하여 DNS를 결정하였다.
환원당을 하기와 같이 3,5-디니트로살리실산 (DNS) 분석으로 분석하였다:
Na-아세테이트 완충액 (100 mM, pH 6)을 멸균 여과된 바실러스 샘플 상층액과 혼합하고 40℃에서 10 분 동안 배양하였다. DNS 시약을 시험관에 첨가하고, 혼합하여 비등 수조에서 5 분 동안 배양하였다. 냉각 후, 분광광도계의 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
환원당 또는 효소 단위 (시간 단위당 1 ml 중의 1 μmol 환원 글루코스 당량을 방출하는데 필요한 효소의 양)의 결과를 제시하기 위하여 글루코오스 스톡 용액으로 표준 곡선을 그렸다.
결과를 표 4에 나타냈다.
결과
표 4
표 4는 다수의 여러 가지 바실러스 균주들의 결과를 보여 주며, 시험된 모든 바실러스 균주들이 대조군에 비하여 더 많은 환원당을 전달함으로써 동물에 더 많은 영양분을 공급한다는 것을 보여주지만, 또한 각 균주들 간에 상당한 차이가 있다는 것을 보여준다.
증량된 환원당을 제공하는 능력의 결과와 조합한 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 억제의 결과에 기초하여, 2 종의 가장 우수한 균주인 B. 서브틸리스 균주들 DSM32324 및 DSM32325를 생체 내 연구를 위해 선택하였다.
생체 내 실시예
실시예 3
클로스트리디움 퍼프린젠스 챌린지 생체 내 시험에서 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32324의 효능
표 5
식이
브리더의 권고에 따라 메티오닌 MHA, L-리신, 미량 미네랄, 비타민 프리믹스 및 L-트레오닌이 포함되었다.
무-약물 옥수수/대두박 기반 식이 (표 5)를 이용하였다. 바실러스 서브틸리 스 DSM32324 1.2 x 106 CFU/g을 그룹 중 하나의 사료에 첨가하였다. 모든 시험에서 사료와 물은 임의량이었다 (ad libitum available). 모든 사료는 축사 (pen)에 의하였다. 스타터 사료는 0 일 내지 21 일에 급여되었다. 21 일째에, 소비되지 않은 스타터 식이는 칭량되어 폐기되었다. 그로워 (grower) 사료는 35 일까지 급여되었고, 소비되지 않은 그로워 사료는 칭량되어 폐기되었다. 마찬가지로, 피니셔 사료는 소비되지 않은 피니셔 식이의 무게를 재고 폐기한 42 일까지 급여되었다.
표 6
실험은 축사당 40 마리의 수컷 Ross 308 육계로 시작되었다. 처리는 8 개의 블록으로 반복되었고, 각각 6 개 축사의 블록 내에서 무작위화되었다.
19 일, 20 일 및 21 일에, 비-의약 비감염 처리 1 그룹을 제외한 모든 축사가 C. 퍼프린젠스 CP-6의 브로쓰 배양체로 챌린지되었다 (Knap I, et al., 2010). 이 균주는 시판 육계 업체로부터 유리하는 NE를 유발하는 것으로 알려진 C. 퍼프린젠스의 필드 단리체이고, 본 연구에서 챌린지 유기체로서 이용된다. 신선한 접종원이 매일 사용되었다. 각각의 축사는 대략 1 x 108 내지 1 x 109 CFU의 C. 퍼프린젠스 CP-6에 상응하는 동일한 양의 접종원을 받았다. 접종원은 튜브 피더의 베이스에서 사료 내로 혼합함으로써 투여되었다.
21 일째에, 각 축사로부터 3 마리의 조류를 선택하고, 희생시키고, 그룹 중량을 측정하고, 괴사성 장염 병변의 존재 정도를 검사하였다. 점수는 0에서 3까지의 점수를 기준으로 하며 0은 정상이고 3은 가장 심한 것이다. 점수는 다음과 같다: 정상 소장은 0, 경미한 점액이 덮고 있고 톤이 상실된 경우는 1, 심한 괴사성 장염은 2, 및 내강에 혈액이 있는 극심한 괴사성 장염은 3.
31, 35 및 42 일에 모든 조류를 칭량하여, 기능 파라미터에 대한 괴사성 장염의 영향을 확인하였다: 생존 질량, 평균 체중 증가 (AWG), 사료 소비, 사료 전환율 (FCR), 괴사성 장염 병변 점수 및 사망률 (총 및 NE)에 대한 평균이 모든 축사에 대하여 산술되었다.
통계 데이터 분석은 처리 그룹 사이의 차이를 확립하기 위하여 완전한 무작위 설계로 ANOVA 분석을 사용하여 SAS Stat Version 9.2에서 수행되었다. 축사는 식이를 고정 효과로 사용하는 통계 실험 단위로 간주되었다. 결과는 최소 제곱 평균으로 보고되었고 P <0.05에서 다른 것으로 가정되었다.
결과
표 7
결과에 붙어있는 문자들은 비-의약 대조군과 (P ≤ 0.05), 또는 서로 간에 통계적으로 현저히 상이한 처리 그룹들을 나타낸다.
표 8
결과에 붙어있는 문자들은 비-의약 대조군과 (P ≤ 0.05), 또는 서로 간에 통계적으로 현저히 상이한 처리 그룹들을 나타낸다.
결론:
21 일, 35 일 및 42 일에 측정된 기능 파라미터인 사료 전환율 (FCR) 및 평균 체중 증가 (AWG)에 대하여, 미처리 감염 대조 그룹에 비하여, 사료 첨가제로서 바실러스 서브틸리스 DSM3234를 고려할 때 모든 데이터 지점에서 유의미한 개선이 관찰되었다. 놀랍게도, 바실러스 처리 그룹은, 후자 그룹이 챌런지를 받지 않았고 건강하다고 간주되었음에도 불구하고, 비-감염, 비-의약 대조 그룹과 어떠한 유의미한 차이를 보이지 않았다 (표 7).
생체 내 챌린지 시험에서 유도된 준임상적 장염과 관련하여, 결과는 바실러스 서브틸리스 DSM3234가 닭의 괴사성 장염 병변 점수를 감소시키고, 괴사성 장염 사망률을 현저하게 감소시켰음을 보여준다 (표 8).
실시예 4
클로스트리디움 퍼프린젠스 챌린지 생체 내 시험에서 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325의 효능
닭에서 괴사성 장염 빈도 및 괴사성 장염 병변 점수에 대한 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325의 효과를 평가하기 위해 연구를 수행하였다.
수컷 Ross 308 육계는 그룹당 48 마리 조류의 3 개의 그룹으로 분배되었다:
감염, 미처리 대조군;
감염, 항생제 처리 그룹 20 mg 아목시실린/체중kg; 및
감염, 바실러스 서브틸리스 DSM32325 1.2 x 106 CFU/사료g 처리 그룹.
모든 동물들은 모든 단계에서 임의량으로 급여되었고, 연구 시설에 도달시 (D1) 감염성 기관지염 및 뉴캐슬병에 대하여 분무 백신 접종되었다. D9까지 조류들은 시판 사료 공장 (Cais, Kaaistraat 49; 8800 Roeselare, Belgium)에서 구입한 스타터 사료 "Kip 1-3"로 급여되었다. 스타터 사료의 정량적 조성은, 각 그룹에서 상응하는 산물의 포함을 제외하고는 모든 동물에서 동일하였다. D9에서 D26까지, 조류들은 높은 단백질 함량을 갖고 40%로 어분을 포함하는 그로워 사료를 급여받았다. 상기 그로워 사료 "Teler2"는 시판 사료 공장 (Cibus, Kaaistraat 49; 8800 Roeselare, Belgium)에서 구입하였다. 상이한 처리 그룹에 대한 그로워 사료의 조성은 각 그룹에서 상응하는 산물을 포함하는 것을 제외하고는 정확히 동일하였다. 사료들은 그룹 코드를 받았고, 이어서 처리 프리믹스는 각각의 사료 뱃치에 대한 사료량과 혼합되었다.
19, 20, 21 및 22 일에, Timbermont et al.에 기술된 바와 같이, 대략 109 CFU 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 56 (Timbermont et al. 2009)이 모든 조류들에 일일 3 회 경구 투여되었다. 괴사성 장염 병변은 25 일 및 26 일에 측정되었다 (0-6 점수)(Johnson & Reid 1970). NE 빈도 및 NE 점수는 각각 로지스틱 및 선형 회귀 모델을 사용하여 분석되었습니다. 통계적 유의성은 P ≤ 0.05로 평가되었다.
결과
각 표본 추출일에 육안으로 확인되는 괴사성 장염 병변 (병변 점수 ≥ 2)에 양성인 조류들의 백분율이 하기 표에 제시된다. 각 날짜에, 치료 그룹과 IUC 간의 차이를 분석하기 위하여 선형 회귀 모델이 적용되었다. 추가적인 모델은 25 일 및 26 일의 조합된 데이터를 이용하여 적용되었다. 이 모델에서는 25 일 및 26 일, 그룹이 고정 효과로 추가되었다.
표 9
** 표시된 숫자는 미처리 대조군 IUC와 통계적으로 유의하게 상이한 처리 그룹을 나타낸다 (P ≤ 0.05).
그룹 및 날짜별 평균 NE 점수는 비슷한 방식으로 계산되었다.
표 10
** 표시된 숫자는 미처리 대조군 IUC와 통계적으로 유의하게 상이한 처리 그룹을 나타낸다 (P ≤ 0.05).
결과는, 감염된 비처리 대조군에 비하여, 바실러스 서브틸리스 DSM32325는 25 일 및 26 일의 데이터가 조합될 때 통계적으로 유의미한 방식으로 닭에서 괴사성 장염 빈도를 감소시켰음을 보여준다. 놀랍게도, 상기 괴사성 장염 빈도는 아목시실린 처리 그룹에서보다 바실러스 처리 그룹에서 훨씬 낮았다 (표 9).
또한, 감염된 비처리 대조군에 비하여, 바실러스 서브틸리스 DSM32325는 25 일 및 26 일의 데이터가 조합될 때 통계적으로 유의미한 방식으로 괴사성 장염의 중증도 (평균 점수)를 감소시켰다. 놀랍게도, 상기 평균 점수는 아목시실린 처리 그룹에서보다 바실러스 처리 그룹에서 훨씬 낮았다 (표 10).
실시예 5
기능 급여 시험
동물:
1 일령 Ross 308 수컷 육계가 72 개 플로어-축사에 무작위로 할당되었으며, 각각의 축사에는 각 25 마리의 닭이 포함되어 각 처리는 12 회 반복되었다. 실험 그룹은 음성 대조군 (NC), 바실러스 서브틸리스 DSM19489, 바실러스 서브틸리스 DSM32324 및 바실러스 서브틸리스 DSM32325였다.
식이:
어떠한 항생제 화합물, 억제제, 기능 인핸서, 기타 프로바이오틱스, 효소 또는 산성화제를 함유하지 않는 3 단계의 매쉬 사료 (1 내지 14 일, 15 내지 28 일 및 29 내지 42 일)을 임의량으로 제공하였다. 식이는 메이즈, 밀, 보리, 호밀 및 대두 박에 기반하였다.
표 11
기본 식이의 조성 함량
시험 품목:
시험 품목인 바실러스 서브틸리스 DSM19489, 바실러스 서브틸리스 DSM32324 및 바실러스 서브틸리스 DSM32325는 42-일 시험 기간 동안 1.2 x 106 CFU/사료g의 투여량으로 급여되었다.
관찰:
평균 일일 증가 (ADG), 체중 (BW), 평균 일일 사료 섭취량 (ADFI)으로서의 사료 섭취량 및 사료 효율; 1, 14, 28, 35 및 42 일령에 사료 전환율 (FCR)이 측정되었다. 일반적인 건강, 의학적 치료 및 사망률은 매일 평가되었다. 유럽 생산 효능 인자 (EPEF)는 [(생존율, % x BW 증가, kg) / (일 단위의 연구 기간 x FCR)] x 100으로 계산되었다.
통계 분석 및 해석:
분산 분석이 적용된 기본 통계 기술이었다. 데이터는 SPSS v. 19.0의 GLM 이후 Tukey 평균 테스트에 의한 완전 무작위 설계로 분석되었다. P < 0.05가 통계적으로 유의미한 차이로 간주되었고, 0.05 < P < 0.10은 거의 유의미한 경향으로 간주되었다.
결과
연구 내내 동물들의 건강은 정상적인 것으로 간주되었으며, 부작용은 관찰되지 않았다. 0 일에서 14 일 사이에 23 건의 사망/도태 (death/cull)(1.27%)가, 14 일에서 28 일 사이에 19 건의 사망/도태 (1.07%)가, 28 일과 42 일 사이에 16 건의 사망/도태 (0.91%)가 있었으며, 이들은 처리와 관련되어 있지 않았다. 42 일에 58/1800 조류 마리 수 (3.22%)의 총 사망률/도태 비는 정상으로 간주되었다.
표 12
동물의 기능은 시험 조건 (수컷 육계에 매쉬 식이를 급여하였고 플로어 축사에서 키움)에 따랐다. 28 일령에 DMS32324를받은 육계는 대조군 조류보다 3.77% 더 무거웠다 (P <0.05). 35 일 및 42 일령에, 바실리 균주 DSM32324 또는 DSM32325로 보충된 육계는 대조군 동물보다 유의하게 무거웠고, DSM19489 육계 그룹은 중간 정도의 체중을 갖는 것으로 나타났다. 스타터 기간 동안 (0 내지 14 일령), 성장, 사료 섭취 또는 사료 전환에 있어서 처리들 간 어떠한 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그로워 기간 동안 (15 내지 28 일령) DSM32324를 투여 받은 닭은 대조군 육계보다 훨씬 더 많이 성장하였다. 프로바이오틱으로 보충된 모든 육계의 사료 전환은 대조군 동물과 비교할 때 유의하게 향상되었다. 시험의 마지막 주 동안 (35 내지 42 일령) 성장, 사료 섭취 또는 사료 전환에 있어서 처리들 간에는 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다.
일반적인 비육 기간 동안 (0-42 일령), 바실리 균주 DSM32324 또는 DSM32325로 보충된 육계는 대조군 동물보다 유의하게 더 많이 성장하였다. 프로바이오틱으로 보충된 모든 육계의 사료 전환 (FCR) 및 EPEF는 대조군 동물의 것들과 비교할 때 유의하게 향상되었다.
실시예 6
기능 급여 시험
이 연구의 목적은 육계 식이에 있어서 바실러스 서브틸리스 DSM32324와 시판 산물 바실러스 서브틸리스 DSM19489의 첨가를 평가하는 것이었다. 목표는 항콕시듐제제 및 급여 효소를 포함하는 밀-기반 식이에서 생산 파라미터에 대한 산물들의 영향을 평가하는 것이었다.
각각의 처리에는 1300 일 된 병아리 (수컷) ROSS 308이 있었는데 - 130 마리 병아리로 이루어지는 10 개의 축사로 나누었다. 닭들은 모든 단계에서 펠렛 형태의 3-단계 사료를 임의량으로 급여 받았으며, 음용수는 니플 급수기에 의해 임의량으로 공급되었다. 식이 조성은 하기 표에 나타나 있다. 사료는 
사료 공장 Lysa nad Labem에 의해 공급되었다.
프로바이오틱 사료 첨가제들은 하기와 같이 분배되었다:
T1: 비-보충 대조 그룹;
T2: 바실러스 서브틸리스 DSM19489 1.2 x 106 CFU/사료g;
T3: 바실러스 서브틸리스 DSM32324 1.2 x 106 CFU/사료g.
표 13
식이 포뮬라
생존 질량을 1 일에 (각 축사의 모든 조류를 함께 칭량), 13 일 및 28 일에 (금식없이 모든 조류를 개별적으로 칭량) 및 42 일에 (12 시간 금식 후에 모든 조류를 개별적으로 칭량) 측정하였다.
13, 28 및 42 일에 축사당, 생존 질량 1 kg당 사료 소비를 기록하고, 사료 전환율을 계산하였다.
통계 분석:
13 일, 28 일 및 42 일에 체중의 기능 결과 및 사망률을, 처리 던넷 (Dunnett) 시험의 1-요인 ANOVA 모델 주요 효과를 이용하여 통계적으로 평가하였다 (비-보충 대조군 (T1)에 대하여 모든 보충 식이를 시험).
결과
사료 전환 및 사료 전환율의 변동 계수 (CV)는 평균 2.7%였다. 최종 체중 및 체중 증가에 대한 CV는 3.7% 였고, 최종 BW의 축사 변동 내에서의 처리 평균 (떼 (flock) 동질성에 대한 측정치로서)은 10.3 내지 15.3% 범위였다.
떼 (flock)에서의 사망률은 낮았으며 (비-보충 조류들에서 총 3.4%), 최초 13 일 동안은 놀랍게도 낮았다.
표 14
결론:
DSM19489는 사망률이 감소하는 경향이 있었으며 (p = 0.096) 바실러스 서브틸리스 DSM32324는 특히 피니셔 기간에 사망률이 현저하고 유의하게 감소하여 전체 시험에서 사망률의 통계적 유의성을 제공하였다.
실시예 7
육계에서 성장 기능, 소화율 및 장 건강에 대한 여러 가지 바실러스 균주의 영향
조류들은 D1부터 시험 종료시까지 (D42) 1.2 m x 0.8 m 단위의 축사에서 15 마리의 동물씩 수용되었다. 각 축사의 바닥을 약 5cm 두께의 나무 부스러기로 덮었다. 사료 저장소가 있는 시판 팬 피더를 축사의 내부에 매달고, 4 개의 급수 니플을 축사의 측면에 장착하였다.
비-전분 단백질의 공급원으로서 호밀을 포함하고 사료 효소는 포함하지 않는 차선 (suboptimal) 식이를 조류에게 급여하였다. D22까지, 조류들은 스타터 사료를 급여받았다. D22에서 D42까지, 조류들은 그로워 사료를 급여받았다. 상기 사료의 정량적 조성은 각 그룹에서 상응하는 균주를 포함한 것을 제외하고는 모든 동물에 대해 동일하였다. 사료 조성에 대한 세부 사항은 표 15에 나타나 있다. 시험될 균주들 (DSM32324, DSM25840 및 DSM32325)는 사료 내에 1.2 x 106 CFU/사료 그램의 비율로 혼합되었다.
표 15
기본 식이의 조성 함량
셋업시 (D1), 960 마리의 동물이 64 개 축사에 배당되었다 (즉, 축사당 15 마리 동물). 전술한 바와 같이, 스타터 사료를 D1에서 D22까지 모든 조류에게 투여하였다. D22부터 D42까지 모든 조류에게 그로워 사료를 투여하였다.
D12, D22 및 D42에, 축사당 1 마리의 십이지장, 공장 및 회장으로부터 조직 샘플을 채취하였다.
D1, D12, D22, D33 및 D42에, 여러 상이한 기간 동안 성장 기능 (체중 증가, 사료 섭취 및 사료 전환)에 대한 프로바이오틱의 효과를 분석하기 위하여 조류들과 사료의 무게를 달았다.
D22와 D42에, 축사당 6 마리의 조류가 안락사되었다. 축사당 회장 및 맹장 내용을 모았다. 회장 및 맹장 내용의 추가 샘플을 동결시키고 -80℃에서 보관하였다.
D19-D22 및 D40-42에 축사당 3 개의 대변 드롭 (faecal dropling)을 매일 수집하였다. 대변을 축사마다 모았다.
건강은 매일 기록되었다. D1에서 D42에 연구가 끝날 때까지, 숙련된 스톡 담당자가 매일 전반적인 건강 상태를 관찰하고 기록하였다. 동물이 질병의 징후를 보이면 전반적인 건강 상태 관찰은 매일 적어도 두 번 이루어졌다. 사망률은 매일 기록되었다.
체중 (BW)은 D1에 축사당 측정되었다. 동물 BW 무게는 D12, D22, D33 및 D42에 개별적으로 측정되었다. 일일 체중 증가 (DWG)는 D1 내지 D12, D1 내지 D22 및 D1 내지 D42 기간 동안 축사당 계산되었다. 일일 체중 증가 (DWG)는 D12 내지 D22, D22 내지 D33, D33 내지 D42 및 D22 내지 D42 기간 동안 동물당 계산되었다.
각 연구 기간의 시작과 종료 사이의 BW의 차이는 그 기간 동안의 체중 증가 (WG)였다. 일일 체중 증가 (DWG)는 WG를 해당 기간의 닐짜 수로 나눈 값으로서 계산되었다. 사망한 동물의 DWG는 각 그룹의 평균 DWG를 계산할 때 포함되었으며, 조류의 사망일을 그 조류에 대한 연구 기간의 끝으로 간주하였다.
일일 사료 소비 (FC) 및 사료 전환율 (FCR)은 D1 내지 D12, D12 내지 D22, D1 내지 D22, D22 내지 D33, D33 내지 D42, D22 내지 D42 및 D1 내지 D42 기간 동안 축사 수준에서 계산되었다.
동물에게 제공된 사료 ("피드 인 (Feed IN)")를 D1, D12, D22 및 D33에 칭량하였다. 다른 날에 축사에 사료가 부족하고 더 많은 사료가 제공되어야 할 필요가 있었을 경우, 추가된 사료 역시 칭량되어 "피드 인"으로 기록되었다. 각 축사의 남은 사료 ("피드 아웃 (Feed OUT)")는 D12, D22, D33 및 D42에 칭량되었다. 각 연구 기간의 시작과 끝에서 사료 무게의 차이는 축사당 사료 소비 (FC)를 정의하기 위하여 계산되었다. 각 연구 기간의 시작과 끝 사이의 사료 무게 차이 ("피드 인" - "피드 아웃")는 해당 기간 동안 해당 축사의 FC였다. 조류당 평균 일일 FC는, 해당 축사에서 그 기간 동안 사료를 먹은 동물의 수로 곱하여진, 해당 기간의 날짜 수로 나눈 FC로서 계산되었다.
D22 및 D42에 수집된 회장 및 맹장 내용물 모음 및 사료에 대하여 건조 물질, 조단백질, 조지방, Ca, P, 에너지 및 티타늄 다이옥사이드 함량을 측정하였다. 티타늄 옥사이드를 불활성 마커로서 사료에 첨가하였다 (0.3%). 겉보기 회장 소화율은 Waititu et al., 2014에 설명된 대로 계산되었다.
샘플은, Leon de Jonge의 감독하에, Wageningen University의 Department of Animal Sciences, Subdivision Animal Nutrition에서 분석되었다. 하기 방법이 사용되었다:
건조 물질: ISO 6496 (1999)을 기준으로 103℃에서 3 시간 건조
재: ISO 5984 (2002)를 기준으로 550℃에서 3 시간 가열
단백질: ISO 5983 (2005)를 기준으로 Kjeldahl 방법
지방: ISO 6492 (1999)를 기준으로 산 처리 후 석유 에테르로 추출
칼슘: ISO 6869 (2000)을 기준으로 흡수 분광법
인: ISO 6869 (2000)을 기준으로 분광 측정
에너지: ISO 9831 (1998)을 기준으로 봄 칼로리법 (bomb caloric method)
티타늄: Kjeldahl 파괴에 기반한 분광 측정 후 퍼옥사이드로 착색 및 408 nm에서 흡광도 측정
D19-D22 및 D40-D42에 수집된 대변 모음 및 사료에 대하여 건조 물질, 조단백질, 조지방, Ca, 에너지 및 티타늄 다이옥사이드 함량을 측정하였다. 티타늄 옥사이드를 불활성 마커로서 사료에 첨가하였다 (0.3%). 겉보기 총 관 정체 (total tract apparent retention)는 Waititu et al., 2014에 설명된 대로 계산되었다.
RStudio (Version 0.99.467, RStudio, Inc.)로 데이터를 분석하였다. 조류 수준에서 체중 및 일일 체중 증가를 제외한 모든 데이터는 고정 효과로서 처리 그룹을 이용한 선형 회귀 모델을 사용하여 분석되었다 (코어 패키지의 절차 lm). 조류 수준에서의 체중 및 일일 체중 증가는, 고정 효과로 처리 그룹을 이용하고 축사 내 조류의 군집을 교정하기 위한 랜덤 효과로서 축사를 이용하여 선형 혼합 회귀 모델을 사용하여 분석되었다 (패키지 nlme의 절차 lme)(프로토콜 편차 n°1). 통계적 유의성은 P ≤ 0.05로 평가되었다.
결과
연구 중에 8 마리의 조류가 사망하였었다 (0.8%).
하기 표는 연구일 및 처리당 평균 체중을 보여준다. 축사 내 조류의 군집을 설명하기 위해, 범주형 고정 효과로서 처리를 이용하고 축사를 랜덤 효과로서 이용한 선형 혼합 회귀 모델로 차이를 분석하였다.
표 16
평균 체중
표 17은 영양분 및 처리당 평균 겉보기 회장 소화율 (AID)을 보여준다. 범주형 고정 효과로서 처리를 이용하는 선형 회귀 모델로 차이를 분석하였다 (코어 패키지의 절차 lm).
표 17
평균 겉보기 회장 소화율 (AID)
결론:
이 연구의 목적은 육계의 성장 기능 및 소화율에 대한 여러 가지 바실러스 균주들의 효과를 평가하는 것이었다.
시험된 균주들은 기능 및 겉보기 회장 소화율에 대한 현저한 영향을 나타냈다:
DSM32324로 보충된 조류는 비-보충된 조류에 비하여 스타터 기간에 더 높은 일일 체중 증가 (표 16), 일일 사료 섭취 및 사료 전환율을 보였고 (데이터 미도시), D42에 더 높은 단백질 소화율을 보였다 (표 17).
DSM25840로 보충된 조류는 비-보충된 조류에 비하여 스타터 기간에 더 높은 일일 체중 증가 (표 16) 및 일일 사료 섭취를 보였고 (데이터 미도시), D42에 더 높은 재, 단백질 및 에너지 소화율을 보였다 (표 17).
DSM32325로 보충된 조류는 비-보충된 조류에 비하여 스타터 기간에 더 높은 일일 체중 증가 (표 16) 및 일일 사료 섭취를 보였고 (데이터 미도시), D42에 더 낮은 Ca 및 인 소화율을 보였다 (표 17).
결론적으로, 3 가지 균주 모두 놀랍게도 양호하고 유의하게 개선된 결과를 나타냈다.
실시예 8
육계 닭에서 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의하여 유발되는 괴사성 장염의 조절을 위한, 사료로 투여되는 4 가지 상이한 프로바이오틱의 효능 비교
본 연구의 목적은 NE에 걸린 Cobb 500 육계의 기능에 대한, DSM32324, DSM25840 및 DSM32325 뿐 아니라 8:3:5의 비로 이들 모두로 구성되는 조성물인 EPB5의 효과를 평가하고, 각 균주들의 효과와 상기 조성물의 효과를 비교하는 것이었다.
부화일에 Cobb 500 수컷 병아리들을 Cobb Vantress hatchery, Cleveland, GA으로부터 얻었다. 2250 마리의 병아리가 연구에 배정되었다. 모든 조류는 부화일에 레이블 권장량의 콕시듐 백신으로 분무 백신접종되었다.
실험 내내 표준 플로어 축사 관리 방법이 사용되었다. 축사는 사망률에 대하여 매일 점검되었다. 연구 개시시 및 DOT 21,35 및 42에 축사마다 조류 중량 (kg)이 기록되었다.
육계 식이는 크럼블 (스타터 사료) 또는 펠렛 (그로워 및 피니셔)으로서 급여되었다. 사료의 정량적 조성은 처리 그룹에 대하여 바실러스 균주 또는 조성물의 포함을 제외하고 모든 동물에 대하여 동일하였다. 식이 제형:
표 18
모든 사료는 축사에 의하였다. 스타터 사료는 DOT 0에서 21까지 지급 및 급여되었다. DOT 21에, 소비되지 않은 스타터는 칭량되어 폐기되었다. 그로워 사료는 DOT 35까지 지급 및 급여되었다. DOT 35에, 소비되지 않은 그로워는 칭량되어 폐기되었다. 피니셔 사료는 DOT 42까지 지급 및 급여되었다. DOT 42에 소비되지 않은 피니셔는 칭량되어 폐기되었다.
실험은 축사당 50 마리 수컷 육계 닭으로 시작한 45 개 축사로 구성되었다. 처리는 9 개의 블록으로 반복되었고, 각각 5 개 축사의 블록 내에서 무작위화되었다.
표 19
19 일, 20 일 및 21 일에 모든 축사는 C. 퍼프린젠스의 브로쓰 배양체로 챌린지되었다. NE를 유발하는 것으로 알려진 C. 퍼프린젠스의 필드 단리체를 챌린지 생물로 사용하였다. 신선한 접종원이 매일 사용되었다. 적정의 수준은 대략 108-9 CFU/축사였다. 각 축사는 동이한 양의 접종원을 받았다. 접종원은 튜브 피더의 바닥에서 사료 내로 혼합됨으로써 투여되었다.
21 일에, 각 축사로부터 5 마리의 조류를 선택하고, 희생시키고, 그룹 중량을 측정하고, 괴사성 장염 병변의 존재 정도를 검사하였다. 점수는 0에서 3까지의 점수를 기준으로 하였고, 0은 정상이고 3은 가장 중증이다. 점수는 다음과 같다: 정상 소장은 0, 경미한 점액이 덮고 있고 톤이 상실된 경우는 1, 심한 괴사성 장염은 2, 및 내강에 혈액이 있는 극심한 괴사성 장염은 3.
연구 중 동반 약물 요법은 사용되지 않았다. 통계 단위로는 축사가 사용되었다. 생존 질량, 체중 증가, 사료 소비, 사료 전환율 (FCR), NE 병변 점수 및 사망률 (총 및 NE)에 대한 평균을 계산하였다. 로 데이터는 Random Complete Block Design을 사용하여 통계적으로 분석되었다 (ANOVA). ANOVA F 값이 유의한 경우 (p≤0.05), Tukey의 HSD 검정 (p≤0.05)을 사용하여 평균을 분리하였다.
행 내의 상이한 위첨자는 P<0.05의 유의 수준을 나타낸다.
결과
표 20
표 21
표 22
표 23
토의 및 결론
21 일, 35 일 및 42 일에 측정된 기능 파라미터들인 사료 전환율 (FCR) 및 평균 중량 증가 (AWG)에 대해, 미처리 감염된 대조 그룹에 비하여 특히 단일 균주 프로바이오틱 사료 첨가제 및 EBP5를 고려시 모든 데이터 지점에서 현저한 개선이 관찰되었다.
놀랍게도, EBP5 처리 그룹은 바실러스 단일 균주 처리 그룹에 비하여 일부 기능 파라미터에 대한 현저한 개선을 보였으며, 후자는 다시 비-약물 감염된 대조 그룹에 대하여 기능 파라미터에 있어서 유의미한 차이를 보였다.
생체 내 시험 챌린지에서 유도된 준임상 장염과 관련하여, 결과는 단일 균주 바실러스 서브틸리스 DSM32234, 바실러스 서브틸리스 DSM32235 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 DSM25840 뿐만 아니라 EBP5 조합이 닭의 괴사성 장염 병변 점수를 감소시키고, 괴사성 장염 사망률을 현저하게 감소시켰다는 것을 보여준다.
실시예 9
수컷 칠면조에서 3 종의 바실러스 균주를 이용한 바실러스 조성물
시험은, 300 마리의 1 일령 건강한 수컷 칠면조 닭 (Kartzfehn Premium)으로 이루어졌으며, 축사당 5 마리의 조류로 60 개 축사로 무작위 할당되었다 (임의의 치료 그룹당 10 회 반복).
식이는 d 01 내지 d 63 령의 칠면조에 대하여 표 24에 개요된 바와 같이, 그리고 d 64 내지 d 147 령의 칠면조에 대하여는 표 25에 개요된 바와 같은 성분 조성을 갖는 비의약 시판-형 칠면조 식이로 구성되었다. 사료의 정량적 조성은 처리 그룹에 대한 바실러스 조성물의 포함을 제외하고는 모든 동물에 대해 동일하였다.
1.6 x 109 CFU/g의 DSM32324, 0.6 x 109CFU/g의 DSM25840 및 1.0 x 109 CFU/g의 DSM32325을 포함하는, 즉 8:3:5의 비로 포함하는 바실러스 조성물 EBP5를 사료에 혼합하였다.
표 24. 칠면조에 대한 식이 P1, P2, 및 P3에서의 성분 조성
표 25. 칠면조에 대한 식이 P4, P5, 및 P6에서의 성분 조성
결과
표 26. 전체 급여 기간 동안 수컷 칠면조의 기능에 대한 EBP5의 효과 (P1 내지P6)
체중 증가
칠면조 닭의 초기 체중은 약 61.2 g이었으며 모든 처리 그룹에서 거의 유사하였다. EBP5를 함유하지 않은 식이로 급여받은 칠면조의 전체 체중 증가는 (대조 그룹) 24.11 kg에 달하였고; 147-d의 급여 기간과 관련하여 일일 체중 증가는 평균 164 g에 달하였다. 전체 체중 증가는, 대조군에 비하여, EBP5의 250 이상의 용량 수준으로의 첨가에 의하여 유의한 향상을 보인 반면 (250 mg/kg: +2.3%; 500 mg/kg: +3.1%; 1,000 mg/kg: +4.8%; 2,000 mg/kg: +6.6%), 100 mg/kg의 용량 수준으로 EBP5를 함유한 식이로 급여받은 칠면조에서는 대조군과 비교할 때 유의미한 변화가 보이지 않았다 (+1.0%).
사료 전환율
EBP5를 이용하지 않은 식이로 급여받은 칠면조의 전체 사료 전환율 (사료:증가)은, 현저한 기능 수준을 나타내며 브리더에 의하여 주어진 목표 (2.540)보다도 기능이 뛰어난 2.138에 이르렀다. EBP5를 함유한 식이로 급여된 칠면조의 체중 증가에 대한 이점으로 인하여, 증가된 용량 수준은 대조군에 비하여 유의하게 감소된 총 사료 전환율 (250 mg/kg: 2.080; 500 mg/kg: 2.050; 1,000 mg/kg: 2.020; 2,000 mg/kg: 2.013)과 관련되어 있었다.
결론
전체 사망률 (도태 포함)은 2.7% 수준이었고, 이는 조류 떼의 건강 상태가 우수함을 나타낸다.
이 시험은 250 mg/kg 내지 2000 mg/kg의 바실러스 다-균주 프로바이오틱 EBP5를 함유하는 식이로 급여받은 조류의 생산 파라미터에 있어서 현저한 향상을 보여주었다. d 147 령까지의 체중 증가는 대조군과 비교할 때 EBP5에 의하여 6.6% (2,000 mg/kg)까지 유의하게 증가되었다.
바실러스 다-균주 프로바이오틱 EBP5를 함유하는 식이로 급여된 칠면조에서, 증가된 용량 수준은 대조군과 비교하여 5.8% (2,000 mg/kg)까지 현저히 향상된 전체 사료 전환율과 관련되어 있었다.
250 mg/kg 내지 2000 mg/kg의 용량 수준에서, 배설물 중의 평균 전체 건조 물질 함량이 대조군과 비교할 때 유의하게 증가되었다는 것이 주목할 만하다.
실시예 10
닭에서, 3종의 바실러스 균주들을 함유하는 바실러스 조성물과 생-약독화 살모넬라 백신의 조합
연구 개시시에, 성별 무관 부화일의 Ross x Ross 육계 병아리 120 마리를 각각 40 마리 육계 병아리를 포함하는 3 개의 상이한 격리실에 할당하였다. 임의량의 급여 및 급수를 위하여 각 축사는 대략 4 인치의 신선한 소나무 부스러기, 1 개의 튜브 피더 및 1 개의 벨 급수기를 포함하였다.
모든 조류는 1 일째에 콕시듐 백신 접종되었고 동시 약물 치료는 사용되지 않았다. 축사의 사망률은 매일 점검되었다.
스타터 식이 (크럼블) 및 22 일부터 최종 제제까지의 그로워 식이 (펠렛)은 비약물 시판-유형의 육계로 구성되었다. 사료의 정량적 조성은 처리 그룹에 대한 바실러스 조성물의 포함을 제외하고는 모든 동물에 대하여 동일하였다. DSM32324, DSM25840 및 DSM32325를 8:3:5의 비로 포함하는 바실러스 조성물을 사료 내로 1.6 x 106 CFU/사료 그램의 비로 혼합하였다.
Lohmann Animal Health, Maine, USA에서 생산된 살아있는 살모넬라 티피무리움 백신인 AviPro® Megan® Vac 1, 이하 "Megan Vac"을, 1 일령에, 그룹 T2 및 T3에, 조류당 1 투여량으로, 병아리당 0.25 ml의 부피로 코스 분무하였다 (coarse sprayed)
표 27
처리 그룹 (각 그룹에 40 마리 조류)
3 일에, 백신 콜로니화를 확인하기 위하여 각 처리로부터 4 개의 맹장과 4 개의 비장을 칭량하여 모았다. 모든 나머지 조류들은 4 일에 3 x 107 CFU 살모넬라 하이델베르크 (Alali et al., 2013)를 경구 투여받았다 (위관 영양).
도살 직전, 40 일에, 처리당 10 마리의 조류가 각각의 개별 축사로부터 취해져 안락사되었고 맹장은 무균 제거되었다. 맹장 샘플을 살모넬라에 대해 시험하였다.
결과
3 일에 4 마리의 조류로부터 수집된 맹장 및 간/비장 샘플에서 살모넬라 출현율의 결과 (표 28 참조)는 백신 콜로니화을 확인한다.
표 28
맹장 및 간/비장 샘플에서 살모넬라 출현율
의심 살모넬라 단리물은 Poly-O Salmonella Specific Antiserum (MiraVista, IN, Indianapolis, IN)에 의하여 확인되었다.
Megan Vac 단독 또는 바실러스 조성물과의 조합은 미처리 조류에 비하여 40 일에 맹장에서 가장 낮은 수의 살모넬라 수를 가졌다 (데이터 미도시).
하기 표 29로부터 명백한 바와 같이, Megan Vac + 바실러스 조성물 (T3)로 급여된 조류의 FCR은, 미처리 조류 (T1) 및 Megan Vac 단독-처리된 조류 (T2)에서보다 낮았다.
표 29
40일에 기능
결론
목표는, 살아있는 살모넬라 티피무리움 백신의 콜로니화에 대한 바실러스-계 프로바이오틱의 효과와 육계 닭에서 살모넬라 하이델베르크 챌린지에 대한 바실러스 조성물의 후속 방어 능력을 평가하는 것이었다.
3 일째 샘플은 바실러스 조성물이 백신의 초기 살모넬라 콜로니화에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타내었다.
또한, 이 연구는 백신과 바실러스 조성물 양자 모두를 포함하는데 대한 부가적인 효과가 있을 수 있음을 나타낸다.
참고 문헌
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수탁번호 : DSM17236
수탁일자 : 20050407
Claims (15)
- a) DSM32324로 기탁된 균주,
b) DSM32325로 기탁된 균주, 및
c) (i) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감도를 갖고; (ii) 대장균 (Escherichia coli) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에 대한 억제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 돌연변이 균주
로 이루어진 군으로부터 선택된 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균주. - 제1항에 기재된 바실러스 서브틸리스 균주 1종 이상을 포함하는 바실러스 조성물.
- 제2항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 균주는 DSM32324를 포함하는 것인 조성물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325를 포함하는 것인 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32324 및 바실러스 서브틸리스 균주 DSM32325를 포함하는 것인 조성물.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 바실러스 균주들 또는 균주들은 포자인 것인 바실러스 조성물.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 직접 공급 미생물 (Direct Fed Microbial, DFM), 프리믹스, 동물 사료 첨가제 또는 동물 사료인 것인 조성물.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 콜로니화 또는 감염의 예방 또는 제어에 사용하기 위한 조성물.
- 제8항에 있어서, 대장균 및/또는 클로스트리디움에 의한 박테리아 콜로니화 또는 감염의 예방 또는 제어에 사용하기 위한 조성물.
- 박테리아 콜로니화 또는 감염의 예방 또는 제어를 위한 방법으로서, 상기 방법은 제1항에 기재된 균주 또는 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 그를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 대장균 및/또는 클로스트리디움에 의한 콜로니화 또는 감염이 예방되거나 제어되는 것인 방법.
- 동물 사료의 소화율을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항에 기재된 균주 또는 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는 방법.
- i) 체중 증가 (WG) 상승,
ii) 사료 전환율 (FCR) 저감,
iii) 괴사성 장염 병변 점수 감소,
iv) 괴사성 장염 빈도 감소,
v) 괴사성 장염 사망률 감소,
vi) 유럽 생산 효능 인자 (EPEF) 증가, 및
vii) 사망률 감소
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물 기능 파라미터를 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항에 기재된 균주 또는 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 기재된 균주 또는 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에 급여하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 동물은 가금류, 예컨대, 육계, 종계, 산란계, 칠면조, 타조, 메추라기, 오리 및 거위, 초식 동물, 예컨대 말 및 반추 동물, 예컨대 낙타, 라마, 소 및 양, 송아지, 돼지, 예컨대 자돈, 이유돈, 육성돈, 피니셔, 호크, 폴트, 길트, 모돈, 임신 모돈, 설치류, 예컨대 토끼, 애완 동물, 예컨대 고양이 및 개, 물고기; 및 갑각류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동물인 것인 방법.
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