KR101106302B1

KR101106302B1 - 락토바실러스 플란타럼 배양 방법 및 그를 이용한 가축음용수 생균제제

Info

Publication number: KR101106302B1
Application number: KR1020110036286A
Authority: KR
Inventors: 김기훈
Original assignee: 충청북도 청원군(청원군농업기술센터장)
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2012-01-18

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타럼 배양 방법 및 그를 이용한 가축음용수 생균제제에 관한 것으로, 그의 주요 구성은, 김치로 부터 추출한 락토바실러스 플란타럼 종균을 당밀과 옥수수 침출액 비율을 70-82중량% : 18-30 중량% 로 혼합한 배지에서 배양하여, 대량 양산할 수 있도록 한 것을 특징으로 하며, 상기한 당밀과 옥수수 침출액 비율은 75중량% : 25 중량% 인 것을 특징으로 하며, 생균제제는 제 1 항에 의하여 배양된 김치에서 추출한 락토바실러스 플란타럼을 물에 희석하여 만들어진 가축음용수 생균제제이며, 상기한 희석 비율을 물에 400-1000 배 희석하는 것을 특징으로 한다

Description

락토바실러스 플란타럼 배양 방법 및 그를 이용한 가축음용수 생균제제{culturing method of Lactobacillus plantarum and probiotic drinking water for live-stock by using it}

본 발명은, 김치는 전통발효식품으로서 그 속에 들어있는 미생물은 안전성과 특이성이 인정되고 있는 점을 고려하여, 김치로부터 추출한 락토바실러스 플란타럼 종균을 대량 배양하는 방법과 이를 이용한 가축 음용수의 생균제제에 관한 것이다

사료첨가용 항생제는 1950년대부터 가축의 생장촉진제로 널리 사용되어 왔으나 가축내의 잔유문제와 내성문제로 인하여 전세계적으로 사용이 규제되고 있는 경향이다. 그러므로 항생제는 가축의 질병치료에만 사용하고 항생제를 대체할 수 있는 생육촉진제의 개발이 필요하게 되었다. 이러한 목적에서 개발된 것이 생균제(probiotics)이며, Probiotics는 번역어로 이는 "for life"를 뜻하며 항생제인 antibiotics의 "against life"와는 반대 의미를 가지고 있으며, 유산균, 효모, 누룩균, 고초균 등과 같은 유용미생물을 단순히 부형제와 섞는 형태로 제조되어, 국내에서는 1980년 후반부터 처음으로 보급되기 시작하였다. 이와 유사한 발효사료는 주변에서 손쉽게 구할 수 있는 각종 부산물과 유용미생물을 섞어 일정기간 발효 및 건조시켜 만든 사료를 의미하며, 생균제가 나오기 이전 국내에서 이미 1962년에 연구가 추진되었으나, 이후 1974년에 Parker에 의해 생균제라는 단어가 사용되면서 가축의 생산성 증대 목적으로 26년간 괄목할 만한 성장을 하였다. 발효사료 또한 생균제 못지않게 성장은 하였으나 일정기간 발효해야하고 부형제로 유기물을 이용 등의 문제가 있어 그리 널리 이용되지는 않았다. 하지만 최근 낙협, 축협, 공기관이 중심이 되어 발효사료를 제조하여 공급하는 추세로 특히 축종 중 한육우에 많이 공급되고 있다. 생균제와 달리 발효사료는 값싼 농산부산물인 밀기울, 버섯폐지, 쌀겨, 깻묵 등을 이용하여 발효과정을 거쳐 각종 효소, 유기산, 아미노산, 비타민 등 생균제와 같은 유용미생물의 효과와 더불어 위의 발효부산물도 이용할 수 있어 일석이조의 효과를 얻을 수 있다. 효모(Sacchromyces cerevisiae)는 가축의 사료분야에 널리 이용되고 있고, 효모를 투여하여 반추가축에 발효사료로 제조 급여하면 일당증체량, 육질, 사료효율, 근내지방도가 개선된 것으로 보고된 바 있으며 유산균(Lactobacilli sp.)은 생균제로 젖소육우 송아지에게 급여하였을 경우 사료효율 및 일당증체 향상, 대장균수 감소 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 바실러스(Bacillus subtilis, coagulans toyoi 등)는 토양미생물로 메주발효에 큰 역할을 하는 미생물로 최근 들어 돈분 슬러지 액화, 악취제거 효과, 단백질분해력 증가 등의 목적으로 사료 첨가제로 사용되고 있으며, 시험보고에 의하면 젖소 수송아지에 Bacillus subtilis를 첨가 급여하였을때 분 중 대장균감소와 이유일령이 단축된 바 있다. 황국균(Aspergillus oryzae)은 양조나 장류제조에 쓰이는 균으로 집락(colony)은 황록색이나 오래되면 갈색이 되며, 단백질 및 탄수화물 분해력이 뛰어나 발효사료의 영양적 가치와 기호성을 증진하는 효과가 있다.

이러한 여러 유용 균종은 여러 가지 분리원에서 추출이용되고 있는데 과거 분리원은 주로 축분이였으며 점차 발효식품 또는 토양에서 분리하여 이용하려는 시도가 이루어졌다. 김치는 전통발효식품으로서 그 속에 들어있는 미생물은 안전성과 특이성이 인정되고 있고, 특히, 김치유산균의 항 A.I. 효능에 대한 연구는 두 가지 기작으로 연구되고 있다. 하나는 김치유산균이 생성하는 천연항균물질인 박테리오신(Bacteriocin)에 의한 바이러스 억제효과에 대한 연구로, 이의 대표적인 예가 Leu. kimchii 배양액을 A.I.에 감염된 13마리의 닭에게 먹인 결과 11마리가 회복했다는 2005년 연구결과와, 쎌바이오텍에서 발표한 Pediococcus pentosaceus에서 생성된 박테리오신에 의한 항 A.I. 효과 등이다. 다른 기작은 김치유산균이 A.I.의 감염의 세포부착부위(virusreceptor)를 방해해서 A.I. 감염을 억제한다는 연구이다. 플라크억제시험법을 이용한 W. koreensis의 항 A.I. 효능실험은 균체의 표면 당단백질(확인 연구중)이 A.I.의 부착부위를 먼저 결합하거나 아니면 A.I.바이러스와 결합하여 세포내 A.I. 감염을 억제하는 것으로 추측할 수 있으며 이에 대한 연구가 진행되고 있다.

이와 같이 생균제를 가축의 사료에 혼합 사용할 경우 생육촉진제로서의 효과가 입증되어 왔으나, 생균제가 사용되기 위해서 갖출 조건으로는, 첫째 생균제의 효능, 유해균의 억제, 혈중 콜레스테롤의 감소, 유해균의 장정착 저해, 면역활성의 증강, 항암효과 등이 높아야한다. 둘째, 투여되는 가축이나 이 가축을 섭취하게 되는 사람에 안전성이 보장되어야한다. 셋째, 보존성이 높아야하므로, 식용균은 동결 건조 시 사멸하지 않아야하며, 사료용은 펠렛화등의 가공 시 생존해야한다. 넷째, 대장과 직장에 도달하여 장운동을 촉진시켜야하므로, 위산이나 담즙등의 효소에 분해되지 않아야한다.

예를 들어 유산균은 익히 알려진 바와 같이 정장작용으로 인한 직접 또는 간접적인 효능으로 가축의 면역력과 생산성을 향상시킨다. 그러나 항생제 대체물질로 주목받고 있는 생균제는 첨가제로 이용하기 위해 적절한 시험을 통해 검증되어야 한다.

본 발명은 이러한 조건을 특히 갖춘 특정 생균을 찾아내어 이를 배양하는 방법과 함께 생균제제로 이용하는 것을 발명하였다

본 발명의 주요 구성은, 김치로 부터 추출한 락토바실러스 플란타럼 종균을 당밀과 옥수수 침출액 비율을 70-82중량% : 18-30 중량% 로 혼합한 배지에서 배양하여, 대량 양산할 수 있도록 한 것을 특징으로 하며, 상기한 당밀과 옥수수 침출액 비율은 75중량% : 25 중량% 인 것을 특징으로 하며, 생균제제는 제 1 항에 의하여 배양된 김치에서 추출한 락토바실러스 플란타럼을 물에 희석하여 만들어진 가축음용수 생균제제이며, 상기한 희석 비율을 물에 400-1000 배 희석하는 것을 특징으로 한다

본 발명에 의하면, 사료와 함께 또는 음용수로 투여한 결과 돼지는 설사 예방 및 증체율이 22% 이상 증가하였고, 닭은 증체율이 7.3% 이상 증가하였다

도 1 은 유산균 분리를 예시하는 도면
도 2 는 PH 별 선별된 11종의 평균 생균 생존 범위를 나타내는 그래프
도 3 은 담즙산 농도별 선별균주의 생존수를 나타내는 그래프
도 4 는 항균력 테스트를 예시하는 도면
도 5 는 API 키트 성분표 및 락토바실러스 플란타럼의 발효 특성을 도시하는 표
도 6 은 옥수수침출액 6%에 당밀 농도에 따른 유산균 생균수를 나타내는 그래프
도 7 은 당밀 6%에 옥수수침출액 농도 변화에 따른 유산균 생균수를 나타내는 그래프

이하, 본 발명에 따른 김치에서의 종균 추출 및 선별과 배양 등에 관하여 순차 설명한다

1. 재료 및 방법

가. 재 료

분리원 : 관내에서 담근 김치를 수집하여 냉장보관 한 후 분리원으로 사용하였다.

배 지 : 본 실험에서 사용한 배지는 식품공전을 참조하여 0.002% 브롬크레졸 퍼플(bromcresol purlple, BCP)을 첨가한 MRS를 사용하였다.

시 약 : 인공위액(HCL + 펩신), 인공담즙(췌장효소 + 담즙산)

병원균 : 대장균(E.coli), 살모넬라(S. typhimurium), 황색포도상구균(S.aureus)

동 정 : 16s RNA검사, API kit

시험축 : 돼지, 닭

장 소 : 친환경축산관리실, 충북 청원군 미원면 수산리, 충북 청원군 가덕면 인차리.

시험사료 : 김치유산균 배양액

산업 배지이용 : 탄수화물원으로 당밀을 사용하고 단백질원으로 옥수수 침출액을 사용

나. 실시 내용

균주의 분리

숙성된 김치 1g을 생리식염수 0.9% 100ml에 현탁한 후, 지시약으로 bromocresol purple을 첨가한 MRS 고체배지에 희석도말하고 37에서 48시간 배양하여 산생성이(노랑) 강한 균주를 분리

분리 균주의 준비

2ml튜브에 1ml 유산균 담고 5,000*g 속도로 5분간 원심분리하고 상등액은 버리고 균주 펠렛 사용

pH 내성

HCL로 pH 1.5, 2.5, 3.5로 조절 한 MRS배지에 pepsin 1%(w/v)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 1ml를 유산균 회수튜브에 접종 후 37에서 2시간 처리 후 생육유무를 검토하였다.

담즙내성

MRS broth에 1% pancreatin를 첨가하고 멸균한 후 멸균 10% Oxagall를 배지의 1% 접종한 배지를 사용하였으며, 분리균주를 접종하여 37에서 24시간 배양 후 생육유무를 검토하였다.

항균력 측정

대장균, 살모넬라, 황색포도상구균에 대한 항균력 측정 Agar diffusion method로 penycilinder을 이용한 투명대

항생물질 내성 측정

paper disk을 이용하여lincomycin, tetracyclin, cephalo, kanamy cin, gentamycin, streptomycin, neomycin, ampicilin, gollistin erthyro 등 10가지 항생제 내성을 검사하였다.

미생물 동정

- 16s RNA(분자생물학적검사) : 염기서열

- API kit(생화학적검사) : 49가지 당의 발효특성 확인

현장시험

- 충북 청원군 미원면 수산리 돼지농가 : 자돈 36일간

- 충북 청원군 가덕면 인차리 양계농가 : 육계 33일간

- 측정항목 : 생육 및 분변 상태, 체중, 사료효율 등

산업 배지 이용

- 2L 배플이 달린 삼각 플라스크를 이용하였으며 온도와 RPM은 고정하였다. 온도는 섭씨 32도, RPM은 170으로 하였으며 1차 시험에서 당밀의 농도를 6%로 고정하고 옥수수침출액의 농도만을 변화하여 생균수를 측정하였다

2차 시험에서는 1차 시험에서 결정된 옥수수침출액의 최적 농도를 기준으로 하여 당밀의 농도를 변화시켰다

- 1,2차 시험은 2 반복 3 회 실시하였다

2. 결과 및 고찰

균주 분리 : 30개의 김치시료로부터 BCP가 첨가된 MRS에서 도 1 에서 보듯이, 노랑색을 띄는 125종의 유산균 분리

pH 내성

- 125종 중 114종은 pH 1.5 ~ 2.5에서는 생존할 수 없었으며, 11종이 pH 2.5~ 3.5 에서 생존하였다.(아래 표 1 참조)

- 축산생균제의 조건 중 pH 내성은 2.5범위에서 생존이 가능해야 하므로 125종 중 114종은 3.5범위에서만 일부 생존하여 선별에서 제외되었으며, 선별된 11종은 pH 1.5에서는 다소 생존이 낮았지만 2.5 ~ 3.5범위에서 90%이상의 생존율을 보여 축산생균제로서 1차 성적에 적합하여 선별되었다.(도 2 , 표 2 참조)

pH 1.5 ~ 3.5 범위에서 125종의 분리유산균 생존율

pH	생존균(종)	생존율(%)
3.5	96	76.8
2.5	11	8.8
1.5	11	8.8

pH별 선별된 11종의 평균 생균수(log)

pH 시간(분)	1.5	2.5	3.5
0	9.20	9.43	9.25
30	8.32	9.12	9.08
60	6.00	8.83	8.79
120	5.82	8.79	8.81
최종 생존율(%)	63.3	93.2	95.2

내담즙성

pH 2.5에서 90% 이상의 생존율을 보인 11종의 담즙내성은 도 3 과 같으며 5종(시료번호 :5-1,5-2,7,6,15)이 담즙산과 췌장효소에 내성이 있는 것으로 판단되었다. 현 보유하고 있는 L.casei 는 pH에서 내성은 보였으나 담즙산의 내성에서 성적이 저조하였다.

항균력 측정(도 4 참조)

pH, 담즙에 내성을 갖는 5종의 병원성균(대장균, 살모넬라, 황색포도상구균)에 대한 항균력을 측정한 결과 모두 우수한 항균력을 보였으며 이것은 장내에서 병원성균의 활력을 억제할 것으로 판단된다.

병원성균에 대한 항균력 측정결과 (단위 : mm)

구분	대장균	살포넬라	황색포도상	평균
5-1	11	10	8	9.7
5-2	13	7	7	9.0
7	8	10	7	8.3
6	10	7	7	8.0
15	10	7	7	8.0

미생물동정

- pH, 담즙산에 내성이 있고, 항균력이 우수한 5종의 분리동정결과 1종이 pediococcus pentosus, 1종이 Lactobacillus brevis, 3종이 Lactobacillus plantarum으로 나타났으며 이중 시료번호 5-1이 29가지의 다양한 당성분을 이용하는 L.plantarum 1으로 나타났으며 5-2와 15는 L.plantarum 2인 것으로 나타났다. 특히 5-1은 난해성 탄수화물인 inulin를 이용하는 비특이적 발효를 하는 균주로 판명되었다.

16sRNA 검사결과

구 분 시료번호	학명	16SrRNA상동성(%)
7	pediococcus.sp peidococcus.pentosaceu	100
15	L.plantarum	99
5-2	L.plantarum	100
6	L.brevis	100
5-1	L.plantarum	100~99

첨부도면 도 5 는 API kit(키트) 분석결과와 API 키트 시험을 보여 주고 있으며, 아래의 표 5 는 API kit 성분표 및 L.plantarum(락토바실러스 플란타럼)의 발효 특성을 나타낸다

최종 균주 선발

미생물동정에서 락토바실러스 플란타럼(이하, "L.plantarum" 로 표기 함)으로 판명된 시료번호 5-1은 인공위액에서 90%이상의 생존율을 보이고 담즙산에 의해 성장이 저하되지 않으며, 또한 대장균, 살모넬라, 황색포도상구균에 항균력이 우수하였다.

현장시험

자돈 생후 3일부터 36일간 관찰한 결과 설사빈도 50%에서 10%미만으로 되었으며 증체율이 22% 향상되었다.

자돈 L.plantarum 급여효과

구 분	대조구	처리구(500배 음수)
시험두수	20	20
시험일수	36	36
평균증체량(kg)	10.6	13
증 체 율(%)	100	122
설 사 율	36일간 50%내외	36일간 10%내외

아래 표 7 에서 보듯이, 육계 출하체중이 대조구에 비해 수당 100g 향상되었으며 증체율 7.3% 증가하였다. 조수입은 대조구에 비해 1,100천원 많았으며 소득을 조수입의 22%인 것을 가정한다면 242,000원 소득이 올랐을 것으로 추측된다.

육계 L.plantarum 급여효과

구 분	대조구	처리구(500배 음수)
시험수수	5,500	5,500
시험일수	33	33
출 하 체 중(kg)	1.373	1.473
증 체 율(%)	100	107.3
조수입(천원)	15,103	16,203(1,100)

상기한 표 6 및 표 7 에서 처리구의 음수를 500배 희석으로 음수 처리하였으나 이는 400배 매지 1000배 처리까지 변화시켜 희석하여 음수 시험하여도 거의 동일한 효과가 있음을 확인하였다. 참고로 유산균의 리터당 균수는 약 10⁹ 정도이다. 가축당 생균 급여 기준은 그램당 10⁶ 을 충족하면 되므로, 상기 희석 범위는 생균 급여 기준에 합당하다. 음수 투여 방법은 예를 들어 돼지 경우 음용수 및 대용유 첨가로 급여하고 닭은 음용수 및 사료제조시 혼합 급여하고, 소의 경우 발효사료를 제조하여 사료에 혼합하여 급여한다

산업 배지 이용

유산균은 표 8 과 표 9 처럼 옥수수침출액을 6% 고정하고 당밀의 농도를 변화한 결과 당밀 6%에서 최적 균수를 유지하였으며, 당밀 6%에서 옥수수침출액 농도를 변화시킨 결과 옥수수침출액 2%에서 최적균수를 유지 하였다. 결과적으로 당밀과 옥수수침출액의 비율은(w/v, %) 6 : 2 이며 옥수수침출액 2%이상에서는 약간씩 감소하는 경향을 보였다. 당밀과 옥수수 침출액 비율을 중량 %로 환산하면 70-82중량% : 18-30 중량% 정도 까지는 저렴한 비용으로 대량 양산할 수 있는 효과가 있다. 그러나 최적의 당밀과 옥수수 침출액 비율은 75중량% : 25 중량% 이다

옥수수침출액 6% 에 당밀 농도 변화에 따른 유산균의 생균수

옥수수침출액	당밀	생균수(10⁷/l)	log 값
6%	1%	28	8.45
	3%	50	8.70
	6%	115	9.06
	9%	120	9.08

도 6 은 표 8 을 도표로 작성한 도면이다

도시한 바와 같이, 당밀농도 6%에서 생균수가 급격하게 늘어 났으며 9%정도의 그 이상의 당밀 농도에서는 생균수의 늘어남이 미미하였다. 따라서 당밀농도 6%가 최적임을 알 수 있다.

당밀 6%에 옥수수침출액 농도 변화에 따른 유산균의 생균수

당밀	옥수수침출액	생균수(10⁷/l)	log 값
6%	2%	250	8.45
	4%	230	8.70
	6%	211	9.06
	8%	205	9.08

도 7 에서는 표 9 를 도표로 나타내었다

도시한 바와 같이, 옥수수침출액 2% 에서 최대 생균수를 나타내었다

이상, 실험 결과를 정리하면, 분리원인 김치로부터 125종의 유사균을 분리하였고 이중 내산성, 내담즙성, 항균력이 우수한 종균(시료번호 5-1)선발되었으며 학명은 L.plantarum으로 판정되었다.

특히 김치를 채택하여 유산균을 분리한 이유는 김치는 한국에서 이미 여랫동안 먹고 있어 이미 충분히 안전성이 검증된 것이며, 조류독감 예방균인 뉴코노스톡속 종이 김치에서 발견되고 특히 김치의 복용으로 장내 정장작용 면역력 증강 효과가 충분히 입증된 것이기 때문이다

본 실험에서 분리된 유산균은 대량생산을 위해 당밀 6%, 옥수수침출액 2%로 10⁹이상 배양할 수 있다.

이에 김치에서 추출한 균주를 배양하여 돼지와 닭에 시험한 결과, 돼지에서는 설사예방과 증체율이 22% 향상되었고, 닭에서는 증체율이 7.3% 향상되었다.

그리하여 결론적으로, 축산생균제로서의 조건을 충족하는 본 발명에서 찾아낸 종균을 농가 공급하여 생균제 이용에 따른 노동력 감소, 가축 생산성 향상, 대사성 질병예방 등이 기대된다

없음

Claims

김치로부터 추출한 락토바실러스 플란타럼 종균을 당밀과 옥수수 침출액 만으로 70-82중량% : 18-30 중량% 비율로 혼합한 배지에서 배양하여, 대량 양산할 수 있는 것을 특징으로 하는 김치에서 추출한 락토바실러스 플란타럼 배양방법
제 1 항에 있어서,
상기한 당밀과 옥수수 침출액 비율은 75중량% : 25 중량% 인 것을 특징으로 하는 김치에서 추출한 락토바실러스 플란타럼 배양 방법
제1항에 의하여 배양된 김치로부터 추출한 락토바실러스 플란타럼을 물에 희석하되, 희석비율을 물에 400∼1,000배 비율로 희석하는 것을 특징으로 하는 김치에서 추출한 락토바실러스 플란타럼 배양방법
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