CN117757831A - 一种高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体及其应用。重组载体，载体中插入SEQ ID NO：1所示的麦芽四糖淀粉酶编码基因的核苷酸序列，或，与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；其中，SEQ ID NO：1所述碱基序列编码的氨基酸为SEQ ID NO：2所示。利用所述重组载体获得高产麦芽四糖淀粉酶的工程菌。株本发明毕赤酵母工程菌株可广泛应用于麦芽四糖淀粉酶的生产，有利于降低麦芽四糖淀粉酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。
Description
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体及其应用。
背景技术：
麦芽四糖是一种直链麦芽低聚糖，其是由4个α-D-葡萄糖分子以α-1,4糖苷键连接而成的寡糖。麦芽四糖是一种重要的功能性低聚糖，其甜度为蔗糖的20％，黏度为蔗糖的2-5倍，目前已经在食品、日化、医药等领域中得到了应用。如麦芽四糖能抑制肠道内腐败菌的生长并且促进肠道健康，增强人体免疫力。麦芽四糖对酸和热具有较好的稳定性，在食品加工中不容易引起美拉德反应，并且能抑制食品中的蛋白质变性。麦芽四糖还具有抗菌活性，对皮肤具有较好的保湿性和抗炎性，其添加于日化用品中不仅有利于产品的稳定性，而且能显著提升产品品质。
麦芽四糖淀粉酶是一种淀粉水解酶，属于糖苷水解酶13家族，能够从淀粉或麦芽糊精的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键，生成以麦芽四糖为主的麦芽低聚糖。目前工业上主要利用麦芽四糖淀粉酶单独或将其与普鲁兰酶复配用于麦芽四糖的生产。已报道产麦芽四糖淀粉酶的野生菌株主要是假单胞菌，如嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)。由于野生菌株的产酶量低，遗传背景不清晰，因此为促进其规模化制备和应用，目前研究工作主要致力于开发产麦芽四糖淀粉酶的异源表达系统。早期工作主要以大肠杆菌为表达宿主对其进行表达和结构功能研究，发现其主要以包涵体形式表达。然而，大肠杆菌作为表达宿主，异源蛋白主要以胞内形式表达，不仅细胞内蛋白质种类多，成分复杂，而且从胞外提取特定蛋白还需要进行细胞破碎处理，不利于工业中对目的蛋白的分离纯化。此外，大肠杆菌自身会产内毒素，不利于其在食品和医疗等领域的应用。除大肠杆菌外，已报道工作主要利用枯草芽孢杆菌为宿主对麦芽四糖淀粉酶进行异源表达，与异源表达相关的主要工作包括：韦云萍等将源自Pseudomonas saccharophila的麦芽四糖淀粉酶编码基因首次在枯草芽孢杆菌中实现了重组表达并且得到了具有活性的蛋白。Duan等将源自Pseudomonas saccharophila STB07的麦芽四糖淀粉酶及缺失和融合不同碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，CBM)的突变体蛋白在枯草芽孢杆菌WB600中进行了重组表达，胞外酶活达到160-310U/mL。
目前对于麦芽四糖淀粉酶的研究工作大多聚焦于利用分子改造和融合表达技术提高其热稳定性和产物特异性，对于利用微生物表达宿主高效制备麦芽四糖淀粉酶的研究较少，亟需通过拓展其表达宿主的种类构建出高效异源表达系统，以最终实现麦芽四糖淀粉酶的高效制备和分离纯化，从而更好的满足工业化需求。
发明内容：
本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体，载体中插入SEQ ID NO：1所示的麦芽四糖淀粉酶编码基因的核苷酸序列，或，与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；其中，SEQ IDNO：1所述碱基序列编码的氨基酸为SEQ ID NO：2所示。
于pPICZαA载体的α-Factor信号肽序列之后插入SEQ ID NO：1所示的麦芽四糖淀粉酶编码基因的核苷酸序列，或，与其同源性达到90％以上的核苷酸序列，即获得重组载体。
一种高产麦芽四糖淀粉酶的工程菌株，含所述的重组载体。
所述工程菌株为毕赤酵母工程菌株基因组上整合所述的重组载体。
将SEQ ID NO：1所示碱基序列，或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列插入至pPICZαA载体α-Factor信号肽序列之后获得重组质粒，再将重组质粒用限制性核酸内切酶SacⅠ进行线性化，纯化后转入毕赤酵母X-33感受态细胞，进行诱导即获得毕赤酵母工程菌株。
一种所述重组载体或工程菌的应用，所述重组载体或工程菌在麦芽四糖淀粉酶生产中的应用。
一种所述重组载体或工程菌的应用：所述重组载体或工程菌在麦芽四糖生产中的应用。
一种麦芽四糖淀粉酶的生产方法，利用所述工程菌进行诱导发酵培养，培养液离心纯化即获得超产量、无杂质的麦芽四糖淀粉酶。
一种麦芽四糖的生产方法，以麦芽糊精(DE 7-9)作为底物，添加所述工程菌获得麦芽四糖淀粉酶，培养即可获得高产量麦芽四糖。
本发明所具有的优点：
本发明获得高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体，同时由其进一步获得高产麦芽四糖淀粉酶的毕赤酵母菌株，与文献中报道的利用不同微生物表达系统(枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)获得的麦芽四糖淀粉酶产量相比，本发明提供的毕赤酵母工程菌株对麦芽四糖淀粉酶的产酶量显著提高，在摇瓶水平发酵上清液中的麦芽四糖淀粉酶酶活达到367.9U/mL。而且胞外上清液中绝大部分组分为分泌到胞外的麦芽四糖淀粉酶，杂蛋白含量极低，从而得到了较好的技术效果。
所述毕赤酵母菌株可广泛应用于麦芽四糖淀粉酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在不同工业领域中的大规模应用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pPICZαA-mta载体示意图。
图2为本发明实施例提供的毕赤酵母工程菌株的菌落PCR鉴定结果；M：DNAMarker；1：构建的毕赤酵母工程菌株；2：对照。
图3为本发明实施例提供的毕赤酵母工程菌株发酵的胞外酶活图。
图4为本发明实施例提供的毕赤酵母工程菌株发酵的胞外上清液的SDS-PAGE检测；1-9：毕赤酵母工程菌株发酵1-9天的胞外上清液；M：蛋白质Marker
图5为本发明实施例提供的毕赤酵母表达的Mta蛋白的糖基化鉴定；1：纯化后的麦芽四糖淀粉酶；2：经EndoH去糖基化处理的麦芽四糖淀粉酶；M：蛋白质Marker。
图6为本发明实施例提供的温度对重组麦芽四糖淀粉酶酶活力的影响效果图。
图7为本发明实施例提供的pH对重组麦芽四糖淀粉酶酶活力的影响效果图。
图8为本发明实施例提供的麦芽四糖淀粉酶转化高浓度麦芽糊精生成麦芽四糖的转化进程曲线。
具体实施方式：
本发明使用了分子生物学领域常规技术方法，例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual,Fourth Ed.(Sambrook，2012)所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案基础上，利用本领域的其他常规技术方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
本发明将麦芽四糖淀粉酶编码基因根据毕赤酵母的密码子偏好性进行密码子优化，之后整合到毕赤酵母的基因组上进行重组表达，得到了麦芽四糖淀粉酶产量得到显著提高的工程菌株，进一步的说，将麦芽四糖淀粉酶编码基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达宿主中进行分泌表达。该重组毕赤酵母菌株经发酵培养后，得到的胞外上清液中绝大部分为分泌到胞外的重组麦芽四糖淀粉酶，杂蛋白水平极低，有利于高效纯化重组麦芽四糖淀粉酶。本发明毕赤酵母工程菌株在摇瓶水平的胞外酶活达到367.9U/mL，可广泛应用于麦芽四糖淀粉酶的生产，有利于降低麦芽四糖淀粉酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。
下述实施例采用的培养基和所用缓冲液配方：
YPD液体培养基：10g/L酵母浸粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，pH 6.0YPD固体培养基：10g/L酵母浸粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂粉，pH 6.0BMGY培养基：10g/L酵母浸粉、20g/L蛋白胨、13.4g/L YNB、4×10-4g/LBiotin、10mL/L甘油、0.1mmol/LKPB缓冲液，pH 6.0BMMY培养基：10g/L酵母浸粉、20g/L蛋白胨、13.4g/L YNB、4×10-4g/LBiotin、5mL/L甲醇、0.1mmol/LKPB缓冲液，pH 6.0Binding缓冲液：50mmol/L NaH2PO4-NaOH，0.5mmol/LNaCl，pH 8.0下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
实施例1表达麦芽四糖淀粉酶的毕赤酵母工程菌株的构建
以Pseudomonas saccharophila的麦芽四糖淀粉酶(Uniprot号为P22963)的氨基酸序列为基础，去除自身的天然信号肽和C末端的碳水化合物结合模块，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，进行密码子优化，插入pPICZαA载体上的α-Factor信号肽序列之后，该质粒由苏州泓迅生物科技股份有限公司进行合成，命名为pPICZαA-mta(图1)。密码子优化后的麦芽四糖淀粉酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，该基因命名为mta，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
将重组质粒pPICZαA-mta用限制性核酸内切酶SacⅠ进行线性化，纯化后转入毕赤酵母X-33感受态细胞，涂布于含有Zeocin抗性的YPD固体培养基。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，经扩增电泳鉴定正确(参见图2)，即为毕赤酵母工程菌株。其中，菌落PCR鉴定用引物序列为：
上游引物(5’-3’)：CACAGGTCCATTCTCACACATAAG
下游引物(5’-3’)：CAATGATGATGATGATGATGCA
将上述获得毕赤酵母工程菌株在YPD固体培养基上划线，在30℃倒置培养3天。挑取单菌落接入10mL的YPD液体培养基中，在30℃、200rpm震荡培养24h。之后取1mL过夜活化的种子液转入100mL的BMGY培养基中，在30℃、200rpm培养18h。之后离心收集菌体，将菌体重悬于200mL的BMMY培养基中，在30℃、200rpm震荡培养，每24h添加甲醇至终浓度0.5％。诱导表达，不同诱导天数下取少量菌液，离心得到胞外上清液，之后检测胞外上清液中的麦芽四糖淀粉酶酶活力(图3)，并且用SDS-PAGE检测胞外上清液以确认目的蛋白的表达量的变化(图4)。通过这个实验，确定了7天是最佳的表达时间(胞外酶活力最高，而且SDS-PAGE显示目的蛋白条带最粗)，后续纯化酶的工作，将工程菌诱导表达7天。
麦芽四糖淀粉酶酶活力测定方法
1.酶活力单位定义：每分钟催化底物可溶性淀粉水解生成1μmol还原糖的酶量为一个酶活力单位(U)。
2.酶活力测定步骤：取0.05mL酶液与0.5mL 1％可溶性淀粉底物溶液和0.45mL pH7.5的10mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液充分混匀。在55℃水浴反应10min。之后将反应混合物用100℃沸水处理15min进行灭酶，10000g离心10min后取上清液利用二硝基水杨酸法(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS法)测定反应产物中的还原糖生成量用于计算酶活力。
如图3结果显示，在摇瓶培养条件下，上述获得表达重组麦芽四糖淀粉酶的毕赤酵母工程菌株，在诱导表达7天达到最高胞外酶活，为367.9U/mL，高于文献中已报道的利用微生物工程菌株表达麦芽四糖淀粉酶的胞外酶活。如图4所示，进一步对诱导表达1-9天的胞外上清液进行SDS-PAGE检测，结果显示胞外上清液中麦芽四糖淀粉酶的含量与胞外酶活检测结果一致，并且胞外上清液中的杂蛋白含量极低。因此，本发明所述工程菌株可用于麦芽四糖淀粉酶的发酵生产，有利于得到高产量、高纯度的酶制剂，从而降低该酶的生产成本，促进其在不同工业领域中的广泛应用。
实施例2重组麦芽四糖淀粉酶的纯化和糖基化鉴定
利用金属离子螯合层析法对上述实施例获得毕赤酵母工程菌株发酵胞外上清液中的麦芽四糖淀粉酶进行纯化。
将上述实施例获得毕赤酵母工程菌株诱导发酵7天的发酵液在10000g、4℃下离心20min。将胞外上清液利用截留分子量为10kDa的滤膜进行超滤浓缩，同时进行缓冲液(Binding缓冲液)置换，使目的蛋白最终存在于Binding缓冲液中；Binding缓冲液：50mmol/L NaH2PO4-NaOH，0.5mmol/LNaCl，pH 8.0，使含有麦芽四糖淀粉酶的胞外蛋白质保存于Binding缓冲液中。之后利用Ni-NTA琼脂糖纯化填料对麦芽四糖淀粉酶进行纯化。首先将Ni-NTA纯化填料用Binding缓冲液进行平衡，之后将经过超滤浓缩和缓冲液置换的胞外蛋白质样品进行上样，之后用含有50mmol/L咪唑的Binding缓冲液进行洗杂，最后用含有150mmol/L咪唑的Binding缓冲液进行洗脱。纯化过程中的流速为1mL/min。将洗脱得到的含有目的蛋白的样品用10mmol/L pH 7.5的Tris-HCl缓冲液进行透析以去除咪唑，从而得到纯化后的麦芽四糖淀粉酶，之后利用BCA法测定蛋白质浓度。
将纯化后的麦芽四糖淀粉酶利用纽英伦生物技术(北京)有限公司的糖苷内切酶H(Endo H)进行糖基化检测。取9μL纯化后的麦芽四糖淀粉酶与1μL GlycoproteinDenaturing Buffer混匀，在100℃沸水处理10min。待冷却到室温后，将10μL的变性后蛋白溶液与2μL GlycoBuffer 3和1μLEndoH混匀，用灭菌水将总体积补充至20μL，之后在37℃反应2h。将EndoH处理后的蛋白质样品与未经EndoH处理的蛋白质样品进行SDS-PAGE检测，如图5所示，结果显示毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶存在糖基化修饰。
实施例3重组麦芽四糖淀粉酶的酶学性质表征
将上述实施例2毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶纯化后，进行酶学性质表征。首先测定麦芽四糖淀粉酶的最适反应温度。将纯化后的麦芽四糖淀粉酶酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH7.0 Na2HPO4-NaH2PO4下反应10min，之后检测反应产物中的还原糖生成量计算酶活力，以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图6所示，本发明提供的毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶的最适反应温度为55℃。
继续测定麦芽四糖淀粉酶的最适反应pH。将纯化后的麦芽四糖淀粉酶酶液分别在不同pH下(pH 4.0-6.0Na2HPO4-C6H8O7；pH 6.0-8.0Na2HPO4-NaH2PO4；pH 8.0-9.0Tris-HCl；pH 9.0-10.0Na2CO3-NaHCO3)在55℃反应10min，之后检测反应产物中的还原糖生成量计算酶活力，以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图7所示，本发明提供的毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶的最适反应pH为7.0。
实施例4毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶在转化高浓度底物制备麦芽四糖中的应用
以50U/g干基底物的加酶量加入上述实施例纯化获得的酶，在pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中分别转化浓度为80g/L、120g/L和200g/L的麦芽糊精(DE 7-9)，分别在50℃，200rpm反应24h。在不同时间点取样，利用100℃沸水灭酶处理后，离心得到上清液，稀释后进行HPLC检测。HPLC检测条件为：Agilent 1200HPLC液相色谱仪，色谱柱为HypersilAPS-2氨基柱(4.6×250mm，5μm)，示差检测器，流动相为乙腈：水＝70：30(v/v)，流速为0.8mL/min，柱温35℃。以不同浓度的麦芽四糖标准品与对应峰面积的线性关系拟合标准曲线，之后根据标准曲线计算转化反应产物中的麦芽四糖含量并计算麦芽四糖得率。结果如图8所示，毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶对80g/L、120g/L和200g/L的麦芽糊精(DE 7-9)底物进行转化，最高麦芽四糖得率分别达到52.7％、54.6％和57.1％。由此可见，本发明所述毕赤酵母工程菌株表达的麦芽四糖淀粉酶具有较高的麦芽四糖得率，可广泛应用于麦芽四糖的制备。
麦芽四糖得率＝(产物中的麦芽四糖质量/进行转化反应的底物麦芽糊精的质量)×100％
SEQ ID NO：1
GATCAAGCAGGTAAGTCTCCAGCAGGAGTTAGATACCACGGAGGAGACGAAATCATCCTGCAGGGTTTCCATTGGAACGTCGTTAGAGAGGCCCCAAACGATTGGTACAACATCCTGAGACAACAGGCTTCTACTATTGCAGCAGACGGTTTCTCCGCTATTTGGATGCCAGTTCCTTGGAGAGACTTCTCTTCTTGGACAGACGGAGGTAAGTCAGGAGGAGGAGAGGGTTACTTTTGGCACGACTTCAACAAGAACGGTAGATACGGTTCTGACGCTCAATTGAGACAAGCAGCAGGAGCTTTGGGAGGAGCAGGAGTTAAGGTTTTGTACGACGTCGTCCCAAACCACATGAACAGAGGTTACCCAGACAAGGAGATCAACTTGCCAGCAGGTCAGGGTTTTTGGAGAAACGATTGCGCCGATCCAGGTAATTACCCAAACGATTGCGACGACGGAGATAGATTCATCGGAGGAGAGTCCGATTTGAACACCGGTCATCCACAGATCTACGGTATGTTCAGAGACGAGCTGGCTAACTTGAGATCAGGATACGGAGCAGGAGGTTTCAGATTCGACTTCGTCAGAGGTTACGCTCCAGAGAGAGTCGATTCTTGGATGTCCGATTCCGCCGATTCCTCTTTTTGCGTTGGAGAGTTGTGGAAGGGTCCATCAGAATACCCATCTTGGGATTGGAGAAATACCGCCTCTTGGCAACAGATCATCAAGGATTGGTCCGACAGAGCCAAGTGTCCAGTTTTCGACTTCGCTCTGAAGGAGAGAATGCAGAACGGTTCCGTTGCAGATTGGAAGCACGGATTGAACGGTAACCCAGATCCTAGATGGAGAGAAGTTGCCGTTACCTTCGTCGATAACCACGATACCGGTTACTCTCCAGGTCAAAACGGAGGTCAACACCATTGGGCATTGCAAGACGGTTTGATCAGACAGGCTTACGCTTACATCCTGACCTCTCCAGGTACTCCAGTTGTCTATTGGTCCCACATGTACGATTGGGGATACGGAGACTTCATCAGACAGCTGATCCAGGTCAGAAGAACAGCAGGAGTTAGAGCAGACTCCGCTATTTCCTTCCATTCCGGTTACTCCGGTTTGGTTGCTACAGTTTCCGGTTCTCAGCAAACCTTGGTCGTTGCTTTGAACTCCGACTTGGCTAACCCAGGACAAGTTGCTTCAGGTTCTTTCTCCGAGGCAGTTAACGCTTCCAACGGTCAAGTCAGAGTTTGGAGATCCGGTTCAGGAGACGGAGGAGGTAACGACGGAGGAGAAGGAGGTTTG
SEQ ID NO：2
DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPDKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFIGGESDLNTGHPQIYGMFRDELANLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGGEGGL
Claims (9)
1.一种高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体，其特征在于：载体中插入SEQ ID NO：1所示的麦芽四糖淀粉酶编码基因的核苷酸序列，或，与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；其中，SEQ ID NO：1所述碱基序列编码的氨基酸为SEQ ID NO：2所示。
2.按权利要求1所述的高产麦芽四糖淀粉酶的重组载体，其特征在于：于pPICZαA载体的α-Factor信号肽序列之后插入SEQ ID NO：1所示的麦芽四糖淀粉酶编码基因的核苷酸序列，或，与其同源性达到90％以上的核苷酸序列，即获得重组载体。
3.一种高产麦芽四糖淀粉酶的工程菌株，其特征在于，含权利要求1所述的重组载体。
4.按权利要求3所述的高产麦芽四糖淀粉酶的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为毕赤酵母工程菌株基因组上整合所述的重组载体。
5.按权利要求4所述的工程菌株，其特征在于：将SEQ ID NO：1所示碱基序列，或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列插入至pPICZαA载体α-Factor信号肽序列之后获得重组质粒，再将重组质粒用限制性核酸内切酶SacⅠ进行线性化，纯化后转入毕赤酵母X-33感受态细胞，进行诱导即获得毕赤酵母工程菌株。
6.一种权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述重组载体或工程菌在麦芽四糖淀粉酶生产中的应用。
7.一种权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述重组载体或工程菌在麦芽四糖生产中的应用。
8.一种麦芽四糖淀粉酶的生产方法，其特征在于，利用权利要求3所述工程菌进行诱导发酵培养，培养液离心纯化即获得超产量、无杂质的麦芽四糖淀粉酶。
9.一种麦芽四糖的生产方法，其特征在于：以麦芽糊精(DE 7-9)作为底物，添加权利要求3所述工程菌获得麦芽四糖淀粉酶，培养即可获得高产量麦芽四糖。
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