JP2009055859A - タンパク質生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ペプチドグリカン糖鎖を脱アセチル化するデアセチラーゼをコードするDNA及び/又は溶菌酵素阻害作用を有するタンパク質をコードするDNAを宿主に導入した形質転換体を用いてタンパク質を生産する工程を含み、前記宿主は野生株と比較して溶菌速度が速い細菌株であることを特徴とする、タンパク質生産方法。
【選択図】なし
Description
本発明に係る方法は、ペプチドグリカン糖鎖を脱アセチル化するデアセチラーゼ(以下、単にデアセチラーゼと称す。)をコードするDNA(以下、デアセチラーゼ遺伝子と称す。)及び/又は溶菌酵素阻害タンパク質をコードするDNA(以下、溶菌酵素阻害遺伝子と称す。)を宿主に導入した形質転換体を用いてタンパク質を生産することを含む、タンパク質生産方法である。なお、本発明において、宿主は野生株と比較して溶菌速度が速い細菌株である。本発明における形質転換体は、デアセチラーゼ遺伝子及び/又は溶菌酵素阻害遺伝子を高発現することで、宿主(すなわち、野生株と比較して溶菌速度が速い細菌株)と比較して溶菌速度が遅い。さらに、宿主と比較して、本発明における形質転換体では、タンパク質の生産量が向上する。
本実施例では、YjeAタンパク質又はYoeBタンパク質を高発現するspo0A遺伝子欠失変異株において、アミラーゼ生産性を評価した。なお、当該アミラーゼは、spo0A遺伝子欠失変異株のゲノムDNAに存在するアミラーゼ遺伝子によってコードされるものである。
図2は、YjeAタンパク質高発現用組換えプラスミドDNA(pDG-YjeA)(以下では、「プラスミドDNA(pDG-YjeA)」という)を示す。
表1に示すプライマーyjeA-22FとプライマーyjeA+1401Rとのプライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、yjeA遺伝子のシャイン・ダルガーノ配列(SD配列)からストップコドンまでを含むyjeA遺伝子のDNA断片をPCRにより増幅し、調製した。なお、プライマーyjeA-22Fの5'末端側には、SalIの制限酵素認識配列(表1において、下線を引いた塩基配列)を含む10 bpが付加されている。一方、プライマーyjeA+1401Rの5'末端側には、SphIの制限酵素認識配列(表1において、下線を引いた塩基配列)を含む10 bpが付加されている。そこで、得られたDNA断片をSalI及びSphIで処理した。
図3は、YoeBタンパク質高発現用組換えプラスミドDNA(pDG148YB)(以下では、「プラスミドDNA(pDG148YB)」という)を示す。
表1に示すプライマーYoeBSalF2とプライマーyoeBSph-Rとのプライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、yoeB遺伝子のSD配列からストップコドンまでを含むyoeB遺伝子のDNA断片をPCRにより増幅し、調製した。なお、プライマーYoeBSalF2の5'末端側には、SalIの制限酵素認識配列(表1において、下線を引いた塩基配列)を含む10 bpが付加されている。一方、プライマーyoeBSph-Rの5'末端側には、SphIの制限酵素認識配列(表1において、下線を引いた塩基配列)を含む10 bpが付加されている。そこで、得られたDNA断片をSalI及びSphIで処理した。
spo0A遺伝子破壊用プラスミド及び該遺伝子破壊用プラスミドを用いたspo0A遺伝子欠失変異株の構築方法を図4に示す。図4に示す(A)、(B)及び(C)は、それぞれ下記の断片(A)、断片(B)及び断片(C)を示す。
表1に示すプライマーspo0A-260FとプライマーSPO-1-RXとのプライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、spo0A遺伝子の上流を含む5'末端側の699bp断片(A)をPCRにて増幅し、調製した。なお、プライマーspo0A-260Fの5'末端側には、ApaIの制限酵素認識配列(表1において、下線を引いた塩基配列)を含む10bpが付加されている。一方、プライマーSPO-1-RXの5'末端側には、XhoIの制限酵素認識配列(表1において、下線を引いた塩基配列)を含む10bpが付加されている。
プラスミドDNA(pDG-YjeA)をSpo0Add株に、コンピテント法によって形質転換した。形質転換後、菌株をカナマイシン(20μg/mL)含有LB寒天培地上で生育させた。生育後、コロニーを形成した菌株を形質転換体として分離した。以下では、得られた形質転換体を「Spo0Add(pDG-YjeA)」という。
同様の方法により、プラスミドDNA(pDG148YB)をSpo0Add株に形質転換し、菌株を生育させ、形質転換体を分離した。以下では、得られた形質転換体を「Spo0Add(pDG148YB)」という。
本比較例では、YjeAタンパク質を高発現する枯草菌168株において、アミラーゼ生産性を評価した。なお、当該アミラーゼは、枯草菌168株のゲノムDNAに存在するアミラーゼ遺伝子によってコードされるものである。
YjeAタンパク質(アミノ酸配列:配列番号2)は、467アミノ酸残基で構成されている。YjeAタンパク質の機能を類推するため、FASTAプログラムにてYjeAタンパク質の相同性検索を行った。相同性検索の結果を表2に示す。
「initn」:下記のinit1で選んだ領域について、ギャップを考慮して付けたスコア。
「init1」:ある一定の連続したマッチ領域についてだけ調べ、ギャップをいれないで付けたスコア。
「opt」:optimization, 最適化を行ったスコア。initnの段階でスコアの高かった領域付近について省力のない完全な比較を行って付けたスコア。
「Z-score」:Z-スコア=スコア−平均/標準偏差。
「bits」:見つかった局所配列の長さを示す値で、この値が大きい場合には、相同性の高い領域が長いことを示す。
「E()」:E値。E値は、局所配列と検索配列の組み合わせが偶然に見つかる個数で、E値がゼロであれば、完全一致しており、一方、1e-9から1e-10以下ならば機能的に類似の配列の可能性が高い。
「Smith-Waterman score」:配列相同検索法の1つであるSmith-Waterman法により得られた相同性を表すスコア。
「CDA1_YEAST」:YjeAタンパク質の第280番目〜第447番目のアミノ酸配列に対するCDA1_YEAST(アミノ酸配列:配列番号21)の第110番目〜第284番目のアミノ酸配列(オーバーラップするアミノ酸数:179アミノ酸)
「CDA2_YEAST」:YjeAタンパク質の第280番目〜第446番目のアミノ酸配列に対するCDA2_YEAST(アミノ酸配列:配列番号22)の第120番目〜第292番目のアミノ酸配列(オーバーラップするアミノ酸数:178アミノ酸)
「CDA_MUCRO」:YjeAタンパク質の第275番目〜第455番目のアミノ酸配列に対するCDA_MUCRO(アミノ酸配列:配列番号23)の第154番目〜第347番目のアミノ酸配列(オーバーラップするアミノ酸数:196アミノ酸)
「PDAA_BACSU」:YjeAタンパク質の第237番目〜第464番目のアミノ酸配列に対するPDAA_BACSU(アミノ酸配列:配列番号24)の第33番目〜第259番目のアミノ酸配列(オーバーラップするアミノ酸数:235アミノ酸)
本参考例では、YjeAタンパク質のペプチドグリカン糖鎖に対するデアセチラーゼ活性について検討した。
(1) His-ΔYjeAタンパク質(Hisタグと膜貫通ドメインを欠くYjeAタンパク質との融合タンパク質)の精製
膜貫通ドメイン(配列番号2において、第1番目〜第29番目のアミノ酸配列)に相当する5'末端DNA配列を欠損したyjeA遺伝子を、表1に示すプライマーyjeA+87F及びyjeA+1383R(表1において、下線の塩基配列はそれぞれSphI及びSalI制限酵素認識配列を示す)を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにより増幅した。増幅後、得られたPCR産物を制限酵素SphI及びSalIで処理し、インサートを得た。
枯草菌168株をLB培地(5ml)にて一夜30℃で振盪培養した。振盪培養後、得られた培養液(0.6 mL)を、2×L-マルトース培地(150 mL;2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物)に接種し、37℃で菌体の増殖が定常期に入るまで培養した。
図8は、枯草菌ペプチドグリカンの構造及びデアセチラーゼの作用部位を示す。図8に示すように、ペプチドグリカン糖鎖を構成するGlcNAc及びMurNAcのアセチル基がデアセチラーゼにより脱アセチル化されると酢酸を遊離する。本参考例では、この酢酸の遊離を指標にYjeAタンパク質のデアセチラーゼ活性を検討した。なお、本参考例では、YjeAタンパク質としてHis-ΔYjeAタンパク質を使用した。
図10は、リゾチームのペプチドグリカンへの作用部位を示す。
肺炎双球菌のペプチドグリカンN-アセチルグルコサミンデアセチラーゼ遺伝子(pgdA)を破壊した株では、リゾチーム感受性を示すことが報告されている(非特許文献1)。これはペプチドグリカン糖鎖のアセチル基がリゾチームの基質認識に関わっているためと考えられる(図10)。
Claims (6)
- 以下の(a)〜(c)のいずれか1記載のDNA及び/又は以下の(d)若しくは(e)記載のDNAを宿主に導入した形質転換体を用いてタンパク質を生産する工程を含み、前記宿主は野生株と比較して溶菌速度が速い細菌株であることを特徴とする、タンパク質生産方法。
(a)配列番号2記載のアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号2記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つペプチドグリカン糖鎖を脱アセチル化するデアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号2記載のアミノ酸配列において、第1番目〜第29番目のアミノ酸配列から成る膜貫通ドメインを欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号4記載のアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA
(e)配列番号4記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質をコードするDNA - 上記宿主が溶菌酵素を分解するプロテアーゼ欠失株である、請求項1記載のタンパク質生産方法。
- 上記溶菌酵素がリゾチーム又はグルコサミニダーゼである、請求項2記載のタンパク質生産方法。
- 上記プロテアーゼ欠失株が、野生株と比較してspo0A遺伝子又はその相同遺伝子が発現低下された細菌株である、請求項2又は3記載のタンパク質生産方法。
- 上記宿主が枯草菌である、請求項1〜4のいずれか1項記載のタンパク質生産方法。
- 上記(d)又は(e)記載のDNAによりコードされるタンパク質により溶菌活性が抑制される溶菌酵素がCwlEタンパク質若しくはCwlFタンパク質又はそれらの相同タンパク質である、請求項1〜5のいずれか1項記載のタンパク質生産方法。
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