JPH05292961A - バチルス由来の精製パラ−ニトロベンジルエステラーゼ - Google Patents
バチルス由来の精製パラ−ニトロベンジルエステラーゼInfo
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- JPH05292961A JPH05292961A JP4338706A JP33870692A JPH05292961A JP H05292961 A JPH05292961 A JP H05292961A JP 4338706 A JP4338706 A JP 4338706A JP 33870692 A JP33870692 A JP 33870692A JP H05292961 A JPH05292961 A JP H05292961A
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 バチルス属由来の精製パラ-ニトロベンジル
エステラーゼ(ＰＮＢエステラーゼ)とその精製法を提供
する。 【効果】 本発明のＰＮＢエステラーゼはセファロスポ
リン化合物および１-カルバセファロスポリン化合物の
ＰＮＢエステルを脱エステル化して対応する遊離酸に変
換する反応を触媒する。
エステラーゼ(ＰＮＢエステラーゼ)とその精製法を提供
する。 【効果】 本発明のＰＮＢエステラーゼはセファロスポ
リン化合物および１-カルバセファロスポリン化合物の
ＰＮＢエステルを脱エステル化して対応する遊離酸に変
換する反応を触媒する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素技術の分野に関す
る。具体的には、本発明は、バチルス属由来の酵素ｐ-
ニトロベンジルエステラーゼ(ＰＮＢエステラーゼ)およ
びこの酵素を精製型として調製する方法に関する。
る。具体的には、本発明は、バチルス属由来の酵素ｐ-
ニトロベンジルエステラーゼ(ＰＮＢエステラーゼ)およ
びこの酵素を精製型として調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セファロスポリンおよび１-カルバセフ
ァロスポリンのエステルはこれら抗生物質の遊離酸型の
合成に際して中間体として一般に使用されている。セフ
ァロスポリン類の製造についてはシャウベット(Chauvet
te),米国特許第４０６４３４３号によって広く教示され
ている。１−カルバセファロスポリン類の製造について
はクリステンセン(Christensen)ら,米国特許第４２２６
８６６号、ムンロー(Munroe),米国特許第４７９１１０
６号、およびヒラタ(Hirata)ら,米国特許第４７０８９
５６号によって広く教示されている。
ァロスポリンのエステルはこれら抗生物質の遊離酸型の
合成に際して中間体として一般に使用されている。セフ
ァロスポリン類の製造についてはシャウベット(Chauvet
te),米国特許第４０６４３４３号によって広く教示され
ている。１−カルバセファロスポリン類の製造について
はクリステンセン(Christensen)ら,米国特許第４２２６
８６６号、ムンロー(Munroe),米国特許第４７９１１０
６号、およびヒラタ(Hirata)ら,米国特許第４７０８９
５６号によって広く教示されている。
【０００３】ＰＮＢエステル官能基は、セファロスポリ
ンおよび１−カルバセファロスポリンの酸性カルボン酸
官能基を、その分子の他の部位での反応を行う間、遮断
または保護するために一般に使用されている。例えばガ
ルブレヒト(Garbrecht),米国特許第３６３２８５０号
は、セファレキシン合成におけるｐ-ニトロベンジルエ
ステル基の使用について記述している。この合成の第１
段階では、このエステルを酸性条件下での水素化分解に
よって切断する。米国特許第３７８１２８２号において
ガルブレヒトは、ジメチルホルムアミドなどのアミド型
溶媒中の亜鉛および酸によるセファロスポリンのｐ-ニ
トロベンジルエステルの脱エステル化について記述して
いる。ジャクソン(Jackson),米国特許第３７９９９２４
号は、約７以上のｐＨにおいて亜ジチオン酸ナトリウム
または亜ジチオン酸カリウムで処理することによるセフ
ァロスポリンエステルのｐ-ニトロベンジルエステル基
の除去について記述している。ハットフィールド(Hatfi
eld),米国特許第４０９１２１４号は、亜鉛とα-ヒドロ
キシカルボン酸を含有する不活性溶媒を用いて還元的に
切断することからなるセファロスポリン化合物のエステ
ルの脱エステル化法について記述している。ヒラタら,
米国特許第４７０８９５６号は、１-カルボセファロス
ポリン化合物からパラ-ニトロベンジル保護基を除去す
る方法について記述している。これらの脱エステル化法
には、溶媒の再利用コストが高いこと並びに有機溶媒が
汚染を引き起こすという潜在的な問題が伴う。
ンおよび１−カルバセファロスポリンの酸性カルボン酸
官能基を、その分子の他の部位での反応を行う間、遮断
または保護するために一般に使用されている。例えばガ
ルブレヒト(Garbrecht),米国特許第３６３２８５０号
は、セファレキシン合成におけるｐ-ニトロベンジルエ
ステル基の使用について記述している。この合成の第１
段階では、このエステルを酸性条件下での水素化分解に
よって切断する。米国特許第３７８１２８２号において
ガルブレヒトは、ジメチルホルムアミドなどのアミド型
溶媒中の亜鉛および酸によるセファロスポリンのｐ-ニ
トロベンジルエステルの脱エステル化について記述して
いる。ジャクソン(Jackson),米国特許第３７９９９２４
号は、約７以上のｐＨにおいて亜ジチオン酸ナトリウム
または亜ジチオン酸カリウムで処理することによるセフ
ァロスポリンエステルのｐ-ニトロベンジルエステル基
の除去について記述している。ハットフィールド(Hatfi
eld),米国特許第４０９１２１４号は、亜鉛とα-ヒドロ
キシカルボン酸を含有する不活性溶媒を用いて還元的に
切断することからなるセファロスポリン化合物のエステ
ルの脱エステル化法について記述している。ヒラタら,
米国特許第４７０８９５６号は、１-カルボセファロス
ポリン化合物からパラ-ニトロベンジル保護基を除去す
る方法について記述している。これらの脱エステル化法
には、溶媒の再利用コストが高いこと並びに有機溶媒が
汚染を引き起こすという潜在的な問題が伴う。
【０００４】上記方法の代替法である、セファロスポリ
ンおよびカルバセファロスポリン抗生物質の合成におい
て使用されるＰＮＢ遮断基を除去するための酵素法には
明瞭な利点があろう。温和な条件下で進行するこのよう
な反応は有機溶媒と金属触媒を使用することなく水性反
応混合物中で完結し得る。ブラノン(Brannon),米国特許
第３９７２７７４号は、セファロスポリンエステルをバ
チルス属の微生物から得られる粗調製物と反応させるこ
とからなる、セファロスポリンエステルからのＰＮＢエ
ステルの除去法について記述している。しかし、この切
断に寄与する酵素は単離されておらず、またその切断が
単一の酵素によって起こるのかどうかも決定されなかっ
た。
ンおよびカルバセファロスポリン抗生物質の合成におい
て使用されるＰＮＢ遮断基を除去するための酵素法には
明瞭な利点があろう。温和な条件下で進行するこのよう
な反応は有機溶媒と金属触媒を使用することなく水性反
応混合物中で完結し得る。ブラノン(Brannon),米国特許
第３９７２７７４号は、セファロスポリンエステルをバ
チルス属の微生物から得られる粗調製物と反応させるこ
とからなる、セファロスポリンエステルからのＰＮＢエ
ステルの除去法について記述している。しかし、この切
断に寄与する酵素は単離されておらず、またその切断が
単一の酵素によって起こるのかどうかも決定されなかっ
た。
【０００５】セファロスポリンおよび１-カルバセファ
ロスポリンのｐ-ニトロベンジルエステルはこれら抗生
物質の遊離酸型の合成において重要であるから、このエ
ステル基の改善された除去法は常に研究の対象となって
いる。
ロスポリンのｐ-ニトロベンジルエステルはこれら抗生
物質の遊離酸型の合成において重要であるから、このエ
ステル基の改善された除去法は常に研究の対象となって
いる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明はバチルス属の
微生物由来の精製ＰＮＢエステラーゼを提供する。本酵
素は約５４０００ダルトンの分子量を有する単量体であ
る。このＰＮＢエステラーゼは、セファロスポリン化合
物および１-カルバセファロスポリン化合物のＰＮＢエ
ステルの対応する遊離酸型への脱エステル化を触媒す
る。また本発明はバチルス種から本酵素を精製する方法
をも提供する。この方法は硫酸アンモニウム分画、ｐＨ
処理、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸
着-脱着クロマトグラフィー、およびアフィニティーク
ロマトグラフィーの組合わせからなる。
微生物由来の精製ＰＮＢエステラーゼを提供する。本酵
素は約５４０００ダルトンの分子量を有する単量体であ
る。このＰＮＢエステラーゼは、セファロスポリン化合
物および１-カルバセファロスポリン化合物のＰＮＢエ
ステルの対応する遊離酸型への脱エステル化を触媒す
る。また本発明はバチルス種から本酵素を精製する方法
をも提供する。この方法は硫酸アンモニウム分画、ｐＨ
処理、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸
着-脱着クロマトグラフィー、およびアフィニティーク
ロマトグラフィーの組合わせからなる。
【０００７】
【課題を解決する方法】本発明はバチルス属の微生物由
来の酵素ＰＮＢエステラーゼを実質的に精製された形態
で提供する。本明細書で使用する場合、実質的に精製さ
れた形態とはバチルス細胞抽出物より１０倍以上高い比
活性を意味する。さらに本発明は、セファロスポリンま
たは１-カルバセファロスポリンの遊離酸型をそのＰＮ
Ｂエステル型から製造する方法において有用な精製酵素
の単離法をも提供する。本酵素は、ＳＤＳ-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)によって決定
した場合約５４０００ダルトンの分子量を有する単量体
型タンパク質である。本酵素のアミノ酸組成を表１に示
す。このアミノ酸組成は、後述のように高性能液体クロ
マトグラフィー並びに従来法によって決定した。本発明
が提供するＰＮＢエステラーゼは約４〜５０℃および約
５.５〜８.５のｐＨで安定である。
来の酵素ＰＮＢエステラーゼを実質的に精製された形態
で提供する。本明細書で使用する場合、実質的に精製さ
れた形態とはバチルス細胞抽出物より１０倍以上高い比
活性を意味する。さらに本発明は、セファロスポリンま
たは１-カルバセファロスポリンの遊離酸型をそのＰＮ
Ｂエステル型から製造する方法において有用な精製酵素
の単離法をも提供する。本酵素は、ＳＤＳ-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)によって決定
した場合約５４０００ダルトンの分子量を有する単量体
型タンパク質である。本酵素のアミノ酸組成を表１に示
す。このアミノ酸組成は、後述のように高性能液体クロ
マトグラフィー並びに従来法によって決定した。本発明
が提供するＰＮＢエステラーゼは約４〜５０℃および約
５.５〜８.５のｐＨで安定である。
【表１】
【０００８】また本発明は、セファロスポリンエステル
および１-カルバセファロスポリンエステルからｐ-ニト
ロベンジル基を除去して対応するセファロスポリン酸お
よび１-カルバセファロスポリン酸を製造するための酵
素的切断法をも提供する。この方法は、セファロスポリ
ンエステルまたは１-カルバセファロスポリンエステル
を好ましくは水性媒質中２５〜４０℃で本発明の実質的
に精製されたＰＮＢエステラーゼと反応させ、得られる
セファロスポリン酸または１-カルバセファロスポリン
酸を回収することからなる。
および１-カルバセファロスポリンエステルからｐ-ニト
ロベンジル基を除去して対応するセファロスポリン酸お
よび１-カルバセファロスポリン酸を製造するための酵
素的切断法をも提供する。この方法は、セファロスポリ
ンエステルまたは１-カルバセファロスポリンエステル
を好ましくは水性媒質中２５〜４０℃で本発明の実質的
に精製されたＰＮＢエステラーゼと反応させ、得られる
セファロスポリン酸または１-カルバセファロスポリン
酸を回収することからなる。
【０００９】本方法は、セファクロルおよびロラカルベ
フを製造するにあたって、その合成中これらの抗生物質
の４-カルボキシル基がパラ-ニトロベンジル基で保護さ
れている場合にとりわけ価値がある。
フを製造するにあたって、その合成中これらの抗生物質
の４-カルボキシル基がパラ-ニトロベンジル基で保護さ
れている場合にとりわけ価値がある。
【００１０】ロラカルベフ核遊離酸は、フェニルグリシ
ンメチルエステルがこの化合物と反応してロラカルベフ
とメタノールを生成する反応において、ペニシリンＧア
ミダーゼの基質である。同様に、ペニシリンＧアミダー
ゼは、セファクロル核遊離酸またはセファレキシン核遊
離酸がフェニルグリシンメチルエステルと反応してセフ
ァクロルまたはセファレキシンとメタノールを与える変
換を触媒する。
ンメチルエステルがこの化合物と反応してロラカルベフ
とメタノールを生成する反応において、ペニシリンＧア
ミダーゼの基質である。同様に、ペニシリンＧアミダー
ゼは、セファクロル核遊離酸またはセファレキシン核遊
離酸がフェニルグリシンメチルエステルと反応してセフ
ァクロルまたはセファレキシンとメタノールを与える変
換を触媒する。
【００１１】ＰＮＢエステラーゼのアミノ末端２２残基
のアミノ酸配列を気相シークエンサーを伴う自動エドマ
ン分解によって決定した。得られた配列は次の通りであ
る：Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Ly
s Val Lys Gly Thr Thr GluAsn Gly Val His（配列番号
１）。
のアミノ酸配列を気相シークエンサーを伴う自動エドマ
ン分解によって決定した。得られた配列は次の通りであ
る：Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Ly
s Val Lys Gly Thr Thr GluAsn Gly Val His（配列番号
１）。
【００１２】プロテアーゼで消化したＰＮＢエステラー
ゼから次の内部アミノ酸配列が得られた：Glu Asn Ile
Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp（配列番号
２)；Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe G
ly Asn Leu Asp Gly Leu GluXaa Met Ala Lys（配列番
号３)；Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Gly Gln
Trp Trp Phe Lys（配列番号４)。
ゼから次の内部アミノ酸配列が得られた：Glu Asn Ile
Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp（配列番号
２)；Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe G
ly Asn Leu Asp Gly Leu GluXaa Met Ala Lys（配列番
号３)；Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Gly Gln
Trp Trp Phe Lys（配列番号４)。
【００１３】後述の実施例１Ｄの方法に従って、他の酵
素の阻害剤として知られている種々の化合物がＰＮＢエ
ステラーゼのＰＮＢエステラーゼ活性に与える効果を測
定した。その結果を表２に示す。ＰＮＢエステラーゼ活
性は３つのセリン特異的化合物(フッ化フェニルメチル
スルホニル、ｐ-ニトロフェニルリン酸ジエチルおよび
フルオロリン酸ジイソプロピル)と１つのヒスチジン特
異的化合物(ピロ炭酸ジエチル)によって強く阻害され
る。本酵素はアルギニン特異的化合物(フェニルグリオ
キサール)、カルボキシル指向性化合物(ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド)および２つのスルフヒドリル指向性
化合物[５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)および
塩化水銀]によって中程度に阻害された。ＰＮＢエステ
ラーゼはトリプシンの基質であるＮ-ベンゾイルフェニ
ルアラニンナプチルアミドによって中程度に阻害され
た。
素の阻害剤として知られている種々の化合物がＰＮＢエ
ステラーゼのＰＮＢエステラーゼ活性に与える効果を測
定した。その結果を表２に示す。ＰＮＢエステラーゼ活
性は３つのセリン特異的化合物(フッ化フェニルメチル
スルホニル、ｐ-ニトロフェニルリン酸ジエチルおよび
フルオロリン酸ジイソプロピル)と１つのヒスチジン特
異的化合物(ピロ炭酸ジエチル)によって強く阻害され
る。本酵素はアルギニン特異的化合物(フェニルグリオ
キサール)、カルボキシル指向性化合物(ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド)および２つのスルフヒドリル指向性
化合物[５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)および
塩化水銀]によって中程度に阻害された。ＰＮＢエステ
ラーゼはトリプシンの基質であるＮ-ベンゾイルフェニ
ルアラニンナプチルアミドによって中程度に阻害され
た。
【表２】 ＰＮＢエステラーゼに対する阻害剤の効果 化合物(１mM) 阻害率（％） 無添加 ０ フッ化フェニルメチルスルホニル １００ ｐ-ニトロフェニルリン酸ジエチル １００ フルオロリン酸ジイソプロピル １００ ピロ炭酸ジエチル １００ ジシクロヘキシルカルボジイミド ７８ フェニルグリオキサール ９１ ５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸) ６９ Ｎ-ベンゾイルフェニルアラニンナプチルアミド ６６ ＨｇＣｌ2 １００ ＦｅＳＯ4 １００ Ｚｎ(ＯＣＯＣＨ3)2 ９７ ２-メルカプトエタノール ０ ＥＤＴＡ ０
【００１４】表３にＰＮＢエステラーゼの基質特異性を
示す。
示す。
【表３】 ＰＮＢエステラーゼの基質特異性 基質 濃度 相対活性 Ｋm Ｖmax (nＭ) (％) (mＭ) (単位／mg) ロラカルベフ-ＰＮＢ ０.５ １００ １.１ １２.８ （オキサレート） ロラカルベフ-ＰＮＢ ０.５ ４１ １.０ ４.４ （トシレート） ロラカルベフ核-ＰＮＢ １.０ ５２ １.１ ６.８ ０.５ ３５ セファクロル核-ＰＮＢ ０.５ １６ １.１ ２.０ セファレキシン-ＰＮＢ ０.５ １２ １.３ １.７ （トシレート) 酢酸ｐ-ニトロフェニル １.６ ６３００ ０.５６ ３８１.７ 酢酸ｐ-ニトロベンジル ５.０ ２６８ 酢酸ベンジル ２.０ ５７ 酢酸α-ナフチル ２.０ ５７ Ｎ-ベンゾイル-ＤＬ- ０.５ ４３ フェニルアラニン-β-ナプチルエステル
【００１５】本発明が提供する酵素はバチルス属の微生
物から得ることができる。これらの生物の多くは公知で
あり、入手可能である。これらの生物には例えばバチル
ス・ズプチリス(枯草菌)ＮＲＲＬ Ｂ５５８、バチルス
・シルクロンスＡＴＣＣ ９６６、バチルス・セレウス
ＮＲＲＬ Ｂ５６９、バチルス・リシェホルミスＡＴＣ
Ｃ ７０７２、バチルス・セレウスＡＴＣＣ ９６３４、
バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ １４７１、バチルス・
ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７およびバチルス・ズプ
チリスＡＴＣＣ ６６３３などが含まれる。ＰＮＢエス
テラーゼを単離する際の供給源として使用した特定の生
物はバチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７であ
る。この微生物の培養はノーザン・リジョナル・リサー
チ・ラボラトリー(米国農務省、イリノイ州６１６０４
ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号Ｂ-
８０９７の下で入手することができる。
物から得ることができる。これらの生物の多くは公知で
あり、入手可能である。これらの生物には例えばバチル
ス・ズプチリス(枯草菌)ＮＲＲＬ Ｂ５５８、バチルス
・シルクロンスＡＴＣＣ ９６６、バチルス・セレウス
ＮＲＲＬ Ｂ５６９、バチルス・リシェホルミスＡＴＣ
Ｃ ７０７２、バチルス・セレウスＡＴＣＣ ９６３４、
バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ １４７１、バチルス・
ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７およびバチルス・ズプ
チリスＡＴＣＣ ６６３３などが含まれる。ＰＮＢエス
テラーゼを単離する際の供給源として使用した特定の生
物はバチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７であ
る。この微生物の培養はノーザン・リジョナル・リサー
チ・ラボラトリー(米国農務省、イリノイ州６１６０４
ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号Ｂ-
８０９７の下で入手することができる。
【００１６】後述するＰＮＢエステラーゼ精製法は、本
酵素を様々な濃度で含有するバチルス属の生物に適用す
ることができる。本酵素が妥当な量で存在するのであれ
ば、出発微生物中の酵素量は制約とならない。
酵素を様々な濃度で含有するバチルス属の生物に適用す
ることができる。本酵素が妥当な量で存在するのであれ
ば、出発微生物中の酵素量は制約とならない。
【００１７】上記生産生物の細胞を培養培地から従来法
で収集することによって、その全細胞から粗酵素調製物
が得られる。この細胞を緩衝液Ａ[１０mMリン酸カリウ
ム(ｐＨ７.０)、１mM ２-メルカプトエタノール(２-Ｍ
Ｅ)、０.５mM ＥＤＴＡ]に懸濁する。その懸濁液を０℃
で超音波処理し、遠心分離し、無細胞抽出物を集める。
で収集することによって、その全細胞から粗酵素調製物
が得られる。この細胞を緩衝液Ａ[１０mMリン酸カリウ
ム(ｐＨ７.０)、１mM ２-メルカプトエタノール(２-Ｍ
Ｅ)、０.５mM ＥＤＴＡ]に懸濁する。その懸濁液を０℃
で超音波処理し、遠心分離し、無細胞抽出物を集める。
【００１８】実質的に純粋なＰＮＢエステラーゼの調製
法は次の工程からなる。 ａ）ＰＮＢエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約ｐＨ７で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約４５％〜８０％飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 ｂ）約ｐＨ７に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 ｃ）その透析物を約ｐＨ５に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約ｐＨ８.５に調節する。 ｄ）該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐＨ７の緩衝液中の
０.０５Mから０.３Mへの直線的なＮａＣｌ勾配を用いて
該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出させる。 ｅ）工程ｄのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 ｆ）工程ｅの濃縮物を、還元剤の存在下で約ｐＨ８.０
の多糖型ゲルを通して濾過する。 ｇ）工程ｆのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、ｐＨ８.５に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 ｈ）工程ｇの濃縮物を約ｐＨ８.５のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐ
Ｈ６の緩衝液中の０.１Mから０.３Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いて該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出さ
せる。 ｉ）工程ｈのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ５.０に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 ｊ）上記透析物を約ｐＨ６のリン酸カルシウム-セルロ
ースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で
約ｐＨ７の０.０１Mから０.１０Mへの直線的なリン酸カ
リウム勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出
させる。 ｋ）工程ｊのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ８に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の存
在下で透析し、その透析物を集める。 ｌ）上記透析物を約ｐＨ８のｐ-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約ｐＨ８の０Mから０.３０Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出させ
る。 ｍ）工程ｌのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 この際、上記ａ〜ｍの工程を約０℃〜４℃の温度で行
う。
法は次の工程からなる。 ａ）ＰＮＢエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約ｐＨ７で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約４５％〜８０％飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 ｂ）約ｐＨ７に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 ｃ）その透析物を約ｐＨ５に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約ｐＨ８.５に調節する。 ｄ）該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐＨ７の緩衝液中の
０.０５Mから０.３Mへの直線的なＮａＣｌ勾配を用いて
該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出させる。 ｅ）工程ｄのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 ｆ）工程ｅの濃縮物を、還元剤の存在下で約ｐＨ８.０
の多糖型ゲルを通して濾過する。 ｇ）工程ｆのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、ｐＨ８.５に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 ｈ）工程ｇの濃縮物を約ｐＨ８.５のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐ
Ｈ６の緩衝液中の０.１Mから０.３Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いて該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出さ
せる。 ｉ）工程ｈのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ５.０に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 ｊ）上記透析物を約ｐＨ６のリン酸カルシウム-セルロ
ースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で
約ｐＨ７の０.０１Mから０.１０Mへの直線的なリン酸カ
リウム勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出
させる。 ｋ）工程ｊのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ８に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の存
在下で透析し、その透析物を集める。 ｌ）上記透析物を約ｐＨ８のｐ-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約ｐＨ８の０Mから０.３０Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出させ
る。 ｍ）工程ｌのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 この際、上記ａ〜ｍの工程を約０℃〜４℃の温度で行
う。
【００１９】本方法の鍵となる特徴は、ＰＮＢエステラ
ーゼの活性を維持しつつこの酵素の他のタンパク質から
の分離を可能にする一連の緩衝液とクロマトグラフィー
用樹脂の使用にある。
ーゼの活性を維持しつつこの酵素の他のタンパク質から
の分離を可能にする一連の緩衝液とクロマトグラフィー
用樹脂の使用にある。
【００２０】上記精製法では、２-ＭＥ以外の還元剤も
緩衝液中で使用することができる。例えばジチオスレイ
トール、Ｎ-アセチル-Ｌ-システイン、および類似のス
ルフヒドリル試薬を使用することができる。２-ＭＥが
好ましい。
緩衝液中で使用することができる。例えばジチオスレイ
トール、Ｎ-アセチル-Ｌ-システイン、および類似のス
ルフヒドリル試薬を使用することができる。２-ＭＥが
好ましい。
【００２１】本法の以降の工程のためにクロマトグラフ
ィー溶出液の体積を減じるべく、溶出液の限外濾過を従
来法で行う。
ィー溶出液の体積を減じるべく、溶出液の限外濾過を従
来法で行う。
【００２２】本明細書に記載するＰＮＢエステラーゼの
アミノ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列は、Ｐ
ＮＢエステラーゼをコード化する遺伝子のクローニング
にとって有用である。組換えＤＮＡ技術を用いるＰＮＢ
エステラーゼ遺伝子のクローニングと発現は、より多量
の本酵素を提供する潜在能力を有する。
アミノ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列は、Ｐ
ＮＢエステラーゼをコード化する遺伝子のクローニング
にとって有用である。組換えＤＮＡ技術を用いるＰＮＢ
エステラーゼ遺伝子のクローニングと発現は、より多量
の本酵素を提供する潜在能力を有する。
【００２３】本発明は、ＰＮＢエステラーゼを発現する
ことができる組換え宿主細胞から実質的に精製された形
態のＰＮＢエステラーゼを調製する方法であって、次の
工程からなる方法を提供する。 ａ）ＰＮＢエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約ｐＨ７で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約４５％〜８５％飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 ｂ）約ｐＨ７に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 ｃ）その透析物を約ｐＨ５に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約ｐＨ８.５に調節する。 ｄ）該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐＨ７の緩衝液中の
０.０５Mから０.３Mへの直線的なＮａＣｌ勾配を用いて
該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出させる。 ｅ）工程ｄのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 ｆ）その透析物を約ｐＨ８のｐ-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約ｐＨ８の０Mから０.３０Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出させ
る。 ｇ）工程ｆのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、ｐＨ８.５に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 ｈ）工程ｇの濃縮物を約ｐＨ８.５のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐ
Ｈ６の緩衝液中の０.１Mから０.３Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼを該樹脂から溶出さ
せる。 ｉ）工程ｈのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ５.０に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。この際、上記
ａ〜ｉの工程を約０℃〜４℃の温度で行う。
ことができる組換え宿主細胞から実質的に精製された形
態のＰＮＢエステラーゼを調製する方法であって、次の
工程からなる方法を提供する。 ａ）ＰＮＢエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約ｐＨ７で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約４５％〜８５％飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 ｂ）約ｐＨ７に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 ｃ）その透析物を約ｐＨ５に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約ｐＨ８.５に調節する。 ｄ）該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐＨ７の緩衝液中の
０.０５Mから０.３Mへの直線的なＮａＣｌ勾配を用いて
該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出させる。 ｅ）工程ｄのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 ｆ）その透析物を約ｐＨ８のｐ-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約ｐＨ８の０Mから０.３０Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出させ
る。 ｇ）工程ｆのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、ｐＨ８.５に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 ｈ）工程ｇの濃縮物を約ｐＨ８.５のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐ
Ｈ６の緩衝液中の０.１Mから０.３Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼを該樹脂から溶出さ
せる。 ｉ）工程ｈのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ５.０に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。この際、上記
ａ〜ｉの工程を約０℃〜４℃の温度で行う。
【００２４】本発明のさらなる理解を助けるべく以下に
実施例を記載する。使用した特定の材料、種および条件
は本発明をさらに例示するためのものであって、本発明
の妥当な範囲を制限しようとするものではない。
実施例を記載する。使用した特定の材料、種および条件
は本発明をさらに例示するためのものであって、本発明
の妥当な範囲を制限しようとするものではない。
【００２５】実施例１：バチルス・ズプチリスからのＰ
ＮＢエステラーゼの単離と精製 Ａ．無細胞抽出物の調製 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９の培養を従
来法で収集し、凍結した。凍結バチルス・ズプチリス
(７６０g)を融解し、２リットルの緩衝液Ａ中でホモジ
ナイズ(均質化)した。２４０００×ｇで３０分間遠心分
離することにより無細胞抽出物を得た。この抽出物に最
終濃度２.０mg／mlで硫酸プロタミンを加え、その混合
物を１時間撹拌した。生成した沈殿を遠心分離によって
除去した。以下の単離操作ではその上清を無細胞抽出物
として使用した。
ＮＢエステラーゼの単離と精製 Ａ．無細胞抽出物の調製 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９の培養を従
来法で収集し、凍結した。凍結バチルス・ズプチリス
(７６０g)を融解し、２リットルの緩衝液Ａ中でホモジ
ナイズ(均質化)した。２４０００×ｇで３０分間遠心分
離することにより無細胞抽出物を得た。この抽出物に最
終濃度２.０mg／mlで硫酸プロタミンを加え、その混合
物を１時間撹拌した。生成した沈殿を遠心分離によって
除去した。以下の単離操作ではその上清を無細胞抽出物
として使用した。
【００２６】Ｂ．粗ＰＮＢエステラーゼの単離 上記抽出物の硫酸アンモニウム分画を行った。４５〜８
０％硫酸アンモニウム飽和度で生成した沈殿を遠心分離
によって集め、緩衝液Ａに溶解した後、同緩衝液に対し
て終夜透析した。透析した試料を１Ｎ酢酸でｐＨ５.０
に酸性化し、１０分間インキュベートし、これを遠心分
離にかけることによって沈殿物を除去した。その上清に
は粗ＰＮＢエステラーゼが含まれていた。
０％硫酸アンモニウム飽和度で生成した沈殿を遠心分離
によって集め、緩衝液Ａに溶解した後、同緩衝液に対し
て終夜透析した。透析した試料を１Ｎ酢酸でｐＨ５.０
に酸性化し、１０分間インキュベートし、これを遠心分
離にかけることによって沈殿物を除去した。その上清に
は粗ＰＮＢエステラーゼが含まれていた。
【００２７】Ｃ．ＰＮＢエステラーゼの精製 上記上清を２Ｎ ＮＨ4ＯＨでｐＨ８.５に調節し、緩衝
液Ｂ[１０mM トリス塩酸(ｐＨ８.５)、５０mM ＮａＣ
ｌ、１mM ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で平衡化した弱
アニオン性樹脂[ＤＥ５２カラム、３.７×３５cm、ファ
ルマシア,インコーポレイテッド製(ニュージャージー州
０８８５４ピスカタウェイ)]に充填した。このカラムを
３５０mlの緩衝液Ｂで洗浄し、１７５０mlの緩衝液Ｃ
[１０mMトリス塩酸(ｐＨ７.０)、５０mM ＮａＣｌ、１m
M ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で再度洗浄した。緩衝液
Ｃ中のＮａＣｌ勾配(５０〜３００mM、３５００ml)を用
いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。ＰＮＢエステラ
ーゼの分画を合し、アミコンＰＭ-１０膜[アミコン製
(マサチューセッツ州０１９２３ダンバース)]での限外
濾過によって濃縮した。濃縮した粗ＰＮＢエステラーゼ
溶液を、緩衝液Ｄ[１０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、１mM
２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で平衡化した多糖型ゲル
(セファクリルＳ-２００ＨＲカラム、５.０×９５cm、
ファルマシア,インコーポレイテッド製)を用いるゲル濾
過にかけた。酵素活性を含有する分画を合わせ、限外濾
過によって濃縮し、緩衝液Ｂに対して終夜透析した。透
析した溶液を、緩衝液Ｂで平衡化したアニオン交換樹脂
(Ｑ-セファロースカラム、２.６×２０cm、ファルマシ
ア,インコーポレイテッド製)に充填した。このカラムを
１００mlの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで５００mlの緩衝液
Ｅ[１０mM ＭＥＳ-ＮａＯＨ(ｐＨ６.０)、１００mM Ｎ
ａＣｌ、１mM ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で洗浄し
た。緩衝液Ｅ中の直線的ＮａＣｌ勾配(１００〜３００m
M、１５００ml)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させ
た。ＰＮＢエステラーゼを含有する分画を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、１mM ２-ＭＥと０.５mMエチレン
ジアミンテトラ酢酸を含む１０mM 酢酸ナトリウム(ｐＨ
５.０)に対して終夜透析した。
液Ｂ[１０mM トリス塩酸(ｐＨ８.５)、５０mM ＮａＣ
ｌ、１mM ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で平衡化した弱
アニオン性樹脂[ＤＥ５２カラム、３.７×３５cm、ファ
ルマシア,インコーポレイテッド製(ニュージャージー州
０８８５４ピスカタウェイ)]に充填した。このカラムを
３５０mlの緩衝液Ｂで洗浄し、１７５０mlの緩衝液Ｃ
[１０mMトリス塩酸(ｐＨ７.０)、５０mM ＮａＣｌ、１m
M ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で再度洗浄した。緩衝液
Ｃ中のＮａＣｌ勾配(５０〜３００mM、３５００ml)を用
いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。ＰＮＢエステラ
ーゼの分画を合し、アミコンＰＭ-１０膜[アミコン製
(マサチューセッツ州０１９２３ダンバース)]での限外
濾過によって濃縮した。濃縮した粗ＰＮＢエステラーゼ
溶液を、緩衝液Ｄ[１０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、１mM
２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で平衡化した多糖型ゲル
(セファクリルＳ-２００ＨＲカラム、５.０×９５cm、
ファルマシア,インコーポレイテッド製)を用いるゲル濾
過にかけた。酵素活性を含有する分画を合わせ、限外濾
過によって濃縮し、緩衝液Ｂに対して終夜透析した。透
析した溶液を、緩衝液Ｂで平衡化したアニオン交換樹脂
(Ｑ-セファロースカラム、２.６×２０cm、ファルマシ
ア,インコーポレイテッド製)に充填した。このカラムを
１００mlの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで５００mlの緩衝液
Ｅ[１０mM ＭＥＳ-ＮａＯＨ(ｐＨ６.０)、１００mM Ｎ
ａＣｌ、１mM ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で洗浄し
た。緩衝液Ｅ中の直線的ＮａＣｌ勾配(１００〜３００m
M、１５００ml)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させ
た。ＰＮＢエステラーゼを含有する分画を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、１mM ２-ＭＥと０.５mMエチレン
ジアミンテトラ酢酸を含む１０mM 酢酸ナトリウム(ｐＨ
５.０)に対して終夜透析した。
【００２８】沈殿物を遠心分離によって除去した後、そ
の酵素溶液を、１mM ２-ＭＥと０.５mM ＥＤＴＡを含む
１０mM酢酸ナトリウム(ｐＨ５.０)で平衡化したリン酸
カルシウム-セルロールカラム(１.６×２０cm)に充填し
た。ここで使用する細かく粉砕されたリン酸カルシウム
はイェナー(Jenner),米国特許第３７３７５１６号に従
って調製することができる。このカラムを２５０mlの同
緩衝液で洗浄した後、１mM ２-ＭＥと０.５mM ＥＤＴＡ
を含む１０〜５０mMの直線的リン酸カリウム(ｐＨ７.
０)勾配(２５０ml)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出
させた。ＰＮＢエステラーゼ活性を含有する分画を合
し、限外濾過によって濃縮した後、緩衝液Ｄに対して終
夜透析した。
の酵素溶液を、１mM ２-ＭＥと０.５mM ＥＤＴＡを含む
１０mM酢酸ナトリウム(ｐＨ５.０)で平衡化したリン酸
カルシウム-セルロールカラム(１.６×２０cm)に充填し
た。ここで使用する細かく粉砕されたリン酸カルシウム
はイェナー(Jenner),米国特許第３７３７５１６号に従
って調製することができる。このカラムを２５０mlの同
緩衝液で洗浄した後、１mM ２-ＭＥと０.５mM ＥＤＴＡ
を含む１０〜５０mMの直線的リン酸カリウム(ｐＨ７.
０)勾配(２５０ml)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出
させた。ＰＮＢエステラーゼ活性を含有する分画を合
し、限外濾過によって濃縮した後、緩衝液Ｄに対して終
夜透析した。
【００２９】透析した酵素溶液を、緩衝液Ｄで平衡化し
たｐ-アミノベンズアミジン-アガロースカラム(１.０×
２０cm、ファルマシア,インコーポレイテッド製)に充填
した。このカラムを５０mlの緩衝液Ｄで洗浄した後、緩
衝液Ｄ中の直線的ＮａＣｌ勾配(０〜３００mM、１００m
l)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。緩衝液Ｄ
中のほぼ１６０〜２２０mM ＮａＣｌで溶出したＰＮＢ
エステラーゼ活性を伴う分画を合し、限外濾過によって
濃縮したところ、これは精製酵素であった。
たｐ-アミノベンズアミジン-アガロースカラム(１.０×
２０cm、ファルマシア,インコーポレイテッド製)に充填
した。このカラムを５０mlの緩衝液Ｄで洗浄した後、緩
衝液Ｄ中の直線的ＮａＣｌ勾配(０〜３００mM、１００m
l)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。緩衝液Ｄ
中のほぼ１６０〜２２０mM ＮａＣｌで溶出したＰＮＢ
エステラーゼ活性を伴う分画を合し、限外濾過によって
濃縮したところ、これは精製酵素であった。
【００３０】上述の精製におけるすべての工程を０〜４
℃の温度で行った。この単離および精製の各工程で得ら
れたＰＮＢエステラーゼ活性について試料を検定するこ
とにより、精製の進行を追跡した。表４は各工程後に得
られた結果を表す。
℃の温度で行った。この単離および精製の各工程で得ら
れたＰＮＢエステラーゼ活性について試料を検定するこ
とにより、精製の進行を追跡した。表４は各工程後に得
られた結果を表す。
【表４】 バチルス・ズプチリス培養基からのＰＮＢエステラーゼの精製 ロラカルベフ セファレキシン 工程 タンパク質1 活性 比活性 活性 比活性 (mg) （Ｕ) (Ｕ／mg) (Ｕ) (Ｕ／mg) 無細胞抽出物 41400 95.2 2.3 9.81 0.24 45-80％ＡmＳＯ4分画 18400 49.6 2.7 5.64 0.31 ｐＨ処理 11000 44.2 4.0 5.18 0.47 ＤＥ５２溶出液 2300 52.0 22.6 6.15 2.67 セファクリルS-200溶出液 985 47.5 48.2 5.98 6.07 Q-セファロース溶出液 16 20.5 1280 1.72 108リン 酸カルシウム-セルロース溶出液 6.9 11.7 1690 1.04 150 p-アミノヘ゛ンス゛アミシ゛ン- 4.0 8.0 2030 0.87 220 アカ゛ロース溶出液 １ 総タンパク質量はローリー(Lowery,O.H.)らの方法[J.
Biol.Chem.193:265(1951)]で決定した。
Biol.Chem.193:265(1951)]で決定した。
【００３１】Ｄ．ＰＮＢエステラーゼ活性の検定法 ５μmolのビストリスプロパン塩酸(ｐＨ６.５)、０.５
μmolの基質(ロラカルベフＰＮＢエステルまたはセファ
クロルＰＮＢエステル)および適量の酵素溶液を含有す
る１mlの反応混合物を恒温振盪機中３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。等体積ののアセトニトリルを添加す
ることによって反応を停止させた。次に、この混合物を
遠心分離することによってタンパク質を除去し、その上
清溶液を、生成物の生成と基質の消失について高性能液
体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で分析した。８０％の
１mMトリエチルアミン塩酸(ｐＨ２.５)と２０％のメタ
ノールを含有する緩衝液Ａおよびメタノールを含有する
緩衝液Ｂによって形成される直線的勾配を１ml／分の流
速で用いて、Ｃ-１８逆相カラム[ノバ-パックＣ18ラジ
アルパックカートリッジ(８×１００mm)、ミリポア・ベ
ッドフォード製(マサチューセッツ州)]でＨＰＬＣを行
った。
μmolの基質(ロラカルベフＰＮＢエステルまたはセファ
クロルＰＮＢエステル)および適量の酵素溶液を含有す
る１mlの反応混合物を恒温振盪機中３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。等体積ののアセトニトリルを添加す
ることによって反応を停止させた。次に、この混合物を
遠心分離することによってタンパク質を除去し、その上
清溶液を、生成物の生成と基質の消失について高性能液
体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で分析した。８０％の
１mMトリエチルアミン塩酸(ｐＨ２.５)と２０％のメタ
ノールを含有する緩衝液Ａおよびメタノールを含有する
緩衝液Ｂによって形成される直線的勾配を１ml／分の流
速で用いて、Ｃ-１８逆相カラム[ノバ-パックＣ18ラジ
アルパックカートリッジ(８×１００mm)、ミリポア・ベ
ッドフォード製(マサチューセッツ州)]でＨＰＬＣを行
った。
【００３２】使用したＨＰＬＣ系はビスタ５５６０ユニ
ット[バリアン・アソシエーツ製(テキサス州シュガーラ
ンド)]とモデル２３０-４０１自動試料採取注入器[ギル
ソン・メディカル・エレクトロニクス製(ウィスコンシ
ン州ミドルトン)]を含むバリアンＨＰＬＣシステムであ
った。生成物の形成を２５４nmで監視することによって
ＰＮＢエステラーゼ活性を決定した。
ット[バリアン・アソシエーツ製(テキサス州シュガーラ
ンド)]とモデル２３０-４０１自動試料採取注入器[ギル
ソン・メディカル・エレクトロニクス製(ウィスコンシ
ン州ミドルトン)]を含むバリアンＨＰＬＣシステムであ
った。生成物の形成を２５４nmで監視することによって
ＰＮＢエステラーゼ活性を決定した。
【００３３】酢酸ｐ-ニトロフェニルが加水分解してｐ-
ニトロフェニルアルコールとアセテートに変化する際の
吸収変化を利用して、ＰＮＢエステラーゼの分光光度測
定検定法を開発した。この検定法で活性を示す酵素分画
は必ずしもＰＮＢエステラーゼ活性を有するわけではな
いが、ＰＮＢエステラーゼはこの検定法で活性を示すで
あろう。精製ＰＮＢエステラーゼに関するこの検定法の
結果は、ＨＰＬＣ検定法の結果と十分な相関関係にあっ
た。したがってこの検定法は、一般に多数の検定を伴う
本酵素の精製に有益である。この検定を、１００μMト
リス塩酸(ｐＨ７.０)、１.６μM酢酸ｐ-ニトロフェニル
および１〜２０μｌの酵素溶液を含有する１mlの検定混
合物中室温で行った。カリー(Cary)分光光度計モデル２
１９もしくはベックマンＤＵ-５０で４０５nmの吸収変
化を測定することにより活性を追跡した。
ニトロフェニルアルコールとアセテートに変化する際の
吸収変化を利用して、ＰＮＢエステラーゼの分光光度測
定検定法を開発した。この検定法で活性を示す酵素分画
は必ずしもＰＮＢエステラーゼ活性を有するわけではな
いが、ＰＮＢエステラーゼはこの検定法で活性を示すで
あろう。精製ＰＮＢエステラーゼに関するこの検定法の
結果は、ＨＰＬＣ検定法の結果と十分な相関関係にあっ
た。したがってこの検定法は、一般に多数の検定を伴う
本酵素の精製に有益である。この検定を、１００μMト
リス塩酸(ｐＨ７.０)、１.６μM酢酸ｐ-ニトロフェニル
および１〜２０μｌの酵素溶液を含有する１mlの検定混
合物中室温で行った。カリー(Cary)分光光度計モデル２
１９もしくはベックマンＤＵ-５０で４０５nmの吸収変
化を測定することにより活性を追跡した。
【００３４】Ｅ．分子量決定 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)によるＰＮＢエステラーゼの分
子量決定を次のように行った。２％ＳＤＳおよび５％
２-ＭＥで処理した精製ＰＮＢエステラーゼ ２μgをゲ
ルに乗せた。ラエムリのタンパク質標品(Laemmli,U.K.,
1970,Nature 227:680-682)と共に電気泳動を行った。使
用したタンパク質標品は(１)ホスホリラーゼＢ(分子量
(Ｍ.Ｗ.)＝９２５００)、(２)ウシ血清アルブミン(Ｍ.
Ｗ.＝６６２００)、(３)卵白アルブミン(Ｍ.Ｗ.＝４５
０００)、(４)炭酸脱水酵素(Ｍ.Ｗ.＝３１０００)、
(５)大豆トリプシンインヒビター(Ｍ.Ｗ.＝２１５０
０)、および(６)リゾチーム(Ｍ.Ｗ.＝１４４００)であ
った。
泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)によるＰＮＢエステラーゼの分
子量決定を次のように行った。２％ＳＤＳおよび５％
２-ＭＥで処理した精製ＰＮＢエステラーゼ ２μgをゲ
ルに乗せた。ラエムリのタンパク質標品(Laemmli,U.K.,
1970,Nature 227:680-682)と共に電気泳動を行った。使
用したタンパク質標品は(１)ホスホリラーゼＢ(分子量
(Ｍ.Ｗ.)＝９２５００)、(２)ウシ血清アルブミン(Ｍ.
Ｗ.＝６６２００)、(３)卵白アルブミン(Ｍ.Ｗ.＝４５
０００)、(４)炭酸脱水酵素(Ｍ.Ｗ.＝３１０００)、
(５)大豆トリプシンインヒビター(Ｍ.Ｗ.＝２１５０
０)、および(６)リゾチーム(Ｍ.Ｗ.＝１４４００)であ
った。
【００３５】図１は、ゲル上での移動度に対する分子量
の片対数プロットである。プロット中の数字は使用した
上記タンパク質標品の括弧内の番号を表す。ＥはＰＮＢ
エステラーゼを表す。
の片対数プロットである。プロット中の数字は使用した
上記タンパク質標品の括弧内の番号を表す。ＥはＰＮＢ
エステラーゼを表す。
【００３６】Ｆ．アミノ酸配列およびアミノ酸組成 ハインリクソン(Heinrikson)とメレディス(Meredith)の
方法(1984,Anal.Biochem.136,65-74)およびビドリング
マイヤー(Bidlingmeyer)らの方法(1984,J.Chromatog.33
6:93-104)に従い、フェニルイソチオシアネート(ＰＩＴ
Ｃ)を用いてフェニルチオカルバモイルアミノ酸(ＰＴＣ
-アミノ酸)に誘導体化した後、ＨＰＬＣ逆相によってア
ミノ酸を分析した。
方法(1984,Anal.Biochem.136,65-74)およびビドリング
マイヤー(Bidlingmeyer)らの方法(1984,J.Chromatog.33
6:93-104)に従い、フェニルイソチオシアネート(ＰＩＴ
Ｃ)を用いてフェニルチオカルバモイルアミノ酸(ＰＴＣ
-アミノ酸)に誘導体化した後、ＨＰＬＣ逆相によってア
ミノ酸を分析した。
【００３７】精製ＰＮＢエステラーゼを水に対して充分
に透析し、酸洗浄したチューブ中で凍結乾燥した後、６
Ｎ ＨＣｌを用いて１１０℃で２４時間加水分解した。
加水分解物をＰＩＴＣと反応させ、生成したＰＴＣ-ア
ミノ酸を、外部アミノ酸標準とウルトロスフェアー-Ｏ
ＤＳカラム(０.４６cm×２５cm)(ベックマン製)を用い
るＨＰＬＣによって定量した。(Ａ)５０mM酢酸アンモニ
ウム(ｐＨ６.０)および(Ｂ)アセトニトリル／メタノー
ル／０.２２M酢酸アンモニウム(ｐＨ６.０)混合液(４
４:１０:４６)からなる溶媒勾配を用いてＰＴＣ-アミノ
酸を溶出させた。さらに、ＰＮＢエステラーゼのアミノ
酸組成を従来のニンヒドリン法でも分析した。
に透析し、酸洗浄したチューブ中で凍結乾燥した後、６
Ｎ ＨＣｌを用いて１１０℃で２４時間加水分解した。
加水分解物をＰＩＴＣと反応させ、生成したＰＴＣ-ア
ミノ酸を、外部アミノ酸標準とウルトロスフェアー-Ｏ
ＤＳカラム(０.４６cm×２５cm)(ベックマン製)を用い
るＨＰＬＣによって定量した。(Ａ)５０mM酢酸アンモニ
ウム(ｐＨ６.０)および(Ｂ)アセトニトリル／メタノー
ル／０.２２M酢酸アンモニウム(ｐＨ６.０)混合液(４
４:１０:４６)からなる溶媒勾配を用いてＰＴＣ-アミノ
酸を溶出させた。さらに、ＰＮＢエステラーゼのアミノ
酸組成を従来のニンヒドリン法でも分析した。
【００３８】放出されるアミノ酸フェニルチオヒダント
イン誘導体(ＰＴＨ-アミノ酸)のオンライン検出を伴う
モデル４７０Ａ気相タンパク質シークエンサーを用い
て、アミノ酸配列分析をエドマン分解によって行った。
上記誘導体を、アプライド・バイオシステムズ(カリフ
ォルニア州フォスターシティー)のモデル１２０Ａ ＰＴ
Ｈ-アミノ酸分析装置で検出した[アプライド・バイオシ
ステムズ・プロテイン・シークエンサー・ブレティンＮ
ｏ.１２(１９８５)]。水に対して充分に透析して凍結乾
燥した精製ＰＮＢエステラーゼを０.１％トリフルオロ
酢酸の入った５％アセトニトリルに溶解した後、ポリブ
レン塗被ガラス製ミクロ繊維フィルター中に吸着させ
た。
イン誘導体(ＰＴＨ-アミノ酸)のオンライン検出を伴う
モデル４７０Ａ気相タンパク質シークエンサーを用い
て、アミノ酸配列分析をエドマン分解によって行った。
上記誘導体を、アプライド・バイオシステムズ(カリフ
ォルニア州フォスターシティー)のモデル１２０Ａ ＰＴ
Ｈ-アミノ酸分析装置で検出した[アプライド・バイオシ
ステムズ・プロテイン・シークエンサー・ブレティンＮ
ｏ.１２(１９８５)]。水に対して充分に透析して凍結乾
燥した精製ＰＮＢエステラーゼを０.１％トリフルオロ
酢酸の入った５％アセトニトリルに溶解した後、ポリブ
レン塗被ガラス製ミクロ繊維フィルター中に吸着させ
た。
【００３９】実施例２：バチルス・ズプチリス(ＮＲＲ
Ｌ Ｂ-８０７９)ＤＮＡのゲノムライブラリーからのＰ
ＮＢエステラーゼ遺伝子(ｐｎｂＡ)の単離 Ａ．菌株の説明と遺伝子型 バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ-８０７９を、セフ
ァロスポリンからパラ-ニトロベンジルエステルを除去
することができる微生物を同定するべく設計されたスク
リーニング法で単離した(Brannonら,J.Antibiotics XXI
X No.2:121-124,1976)。バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ
Ｂ-８０９７はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボ
ラトリー(ＮＲＲＬ)(米国農務省，イリノイ州６１６０
４ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号
Ｂ-８０７９の下で入手可能である。エシェリシア・コ
リ(大腸菌)Ｋ１２ ＤＨ５αTM[マックス・エフィシェン
シーＤＨ５αTMコンピテント・セル；ギブコ ＢＲＬ製
(メリーランド州ガイサースブルク)]は、高い形質転換
能と大腸菌プラスミドの維持にとって安定な環境を提供
するために開発されたｒｅｃＡ-株である。この大腸菌
株を、バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ-８０７９ゲ
ノムライブラリー用の宿主細胞として使用した(実施例
２Ｊを参照のこと)。クローン化したＰＮＢエステラー
ゼ遺伝子の高レベル発現にはｒｅｃＡ+大腸菌Ｋ１２ Ｒ
Ｖ３０８を使用した。この大腸菌株は、大腸菌中で異種
タンパク質を工業的規模で発現させる際の宿主として好
ましい。大腸菌Ｋ１２／ＲＶ３０８はＮＲＲＬに寄託さ
れており、受託番号Ｂ-１５６２４の下で入手可能であ
る。
Ｌ Ｂ-８０７９)ＤＮＡのゲノムライブラリーからのＰ
ＮＢエステラーゼ遺伝子(ｐｎｂＡ)の単離 Ａ．菌株の説明と遺伝子型 バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ-８０７９を、セフ
ァロスポリンからパラ-ニトロベンジルエステルを除去
することができる微生物を同定するべく設計されたスク
リーニング法で単離した(Brannonら,J.Antibiotics XXI
X No.2:121-124,1976)。バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ
Ｂ-８０９７はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボ
ラトリー(ＮＲＲＬ)(米国農務省，イリノイ州６１６０
４ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号
Ｂ-８０７９の下で入手可能である。エシェリシア・コ
リ(大腸菌)Ｋ１２ ＤＨ５αTM[マックス・エフィシェン
シーＤＨ５αTMコンピテント・セル；ギブコ ＢＲＬ製
(メリーランド州ガイサースブルク)]は、高い形質転換
能と大腸菌プラスミドの維持にとって安定な環境を提供
するために開発されたｒｅｃＡ-株である。この大腸菌
株を、バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ-８０７９ゲ
ノムライブラリー用の宿主細胞として使用した(実施例
２Ｊを参照のこと)。クローン化したＰＮＢエステラー
ゼ遺伝子の高レベル発現にはｒｅｃＡ+大腸菌Ｋ１２ Ｒ
Ｖ３０８を使用した。この大腸菌株は、大腸菌中で異種
タンパク質を工業的規模で発現させる際の宿主として好
ましい。大腸菌Ｋ１２／ＲＶ３０８はＮＲＲＬに寄託さ
れており、受託番号Ｂ-１５６２４の下で入手可能であ
る。
【００４０】Ｂ．菌株の培養 トリプチカーゼR-ソイ・ブロス(ＴＳＢ；ベクトン・デ
ィッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ製)
およびルリア・ブロス(Ｌ-ブロス；１リットルあたり１
０g ディフコ・バクト-トリプトンR、１０g ＮａＣｌお
よび５g 酵母エキス)を液体培養用の生育培地として使
用した。固体培地上での培養は２％(ｗ／ｖ)寒天を補足
したＬ-ブロス(Ｌ-寒天)上で生育させた。必要な場合に
は次の濃度で抗生物質を培地に添加した：アンピシリン
(５０μg／ml)、テトラサイクリン(５μg／ml)。β-ガ
ラクトシダーゼ活性を検出するために、５-ブロモ-４-
クロロ-３-インドリル-Ｄ-ガラクトシド[Ｘ-ｇａｌ；シ
グマ・ケミカル・カンパニー製(ミズーリ州６３１７８
セントルイス)]を２０μg／mlの濃度で培地に添加し
た。
ィッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ製)
およびルリア・ブロス(Ｌ-ブロス；１リットルあたり１
０g ディフコ・バクト-トリプトンR、１０g ＮａＣｌお
よび５g 酵母エキス)を液体培養用の生育培地として使
用した。固体培地上での培養は２％(ｗ／ｖ)寒天を補足
したＬ-ブロス(Ｌ-寒天)上で生育させた。必要な場合に
は次の濃度で抗生物質を培地に添加した：アンピシリン
(５０μg／ml)、テトラサイクリン(５μg／ml)。β-ガ
ラクトシダーゼ活性を検出するために、５-ブロモ-４-
クロロ-３-インドリル-Ｄ-ガラクトシド[Ｘ-ｇａｌ；シ
グマ・ケミカル・カンパニー製(ミズーリ州６３１７８
セントルイス)]を２０μg／mlの濃度で培地に添加し
た。
【００４１】Ｃ．大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１
２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ ＡＴＴＣ １１１０５の
形質転換 大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α感応細胞をＢＲＬから入手し、
製造者の実験案を用いてこれを形質転換した。別法とし
て、大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８
または大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ １１１０５の培養５０mlをＬ
-ブロス中でＯＤ590が約０.５吸光度単位になるまで生
育させ、その細胞を遠心分離によって集めた。細胞ペレ
ットを冷たい１００mM ＣａＣｌ2 ２５mlに再懸濁し、
氷上で２５分間インキュベートした。その細胞を遠心分
離によって集め、冷たい１００mMＣａＣｌ2 ２.５ml中
に再懸濁し、氷上で終夜インキュベートした。感応細胞
を直接使用するか、もしくは形質転換に使用する準備が
調うまで−７０℃で保存した。
２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ ＡＴＴＣ １１１０５の
形質転換 大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α感応細胞をＢＲＬから入手し、
製造者の実験案を用いてこれを形質転換した。別法とし
て、大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８
または大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ １１１０５の培養５０mlをＬ
-ブロス中でＯＤ590が約０.５吸光度単位になるまで生
育させ、その細胞を遠心分離によって集めた。細胞ペレ
ットを冷たい１００mM ＣａＣｌ2 ２５mlに再懸濁し、
氷上で２５分間インキュベートした。その細胞を遠心分
離によって集め、冷たい１００mMＣａＣｌ2 ２.５ml中
に再懸濁し、氷上で終夜インキュベートした。感応細胞
を直接使用するか、もしくは形質転換に使用する準備が
調うまで−７０℃で保存した。
【００４２】感応性大腸菌細胞を形質転換するために、
感応細胞懸濁液１００μｌを−７０℃の貯蔵庫から取り
出し、氷上で融解させる。ポリプロピレン製チューブ中
で細胞をプラスミドＤＮＡの溶液(１ng／ml)５μlと穏
やかに混合し、得られた溶液を氷上で３０分間インキュ
ベートした。このチューブを４２℃の水槽に移し、振盪
せずに４５秒間インキュベートした。この熱ショック処
理後、チューブを氷上に２分間静置した。次に、チュー
ブを氷から取り出し、予め室温にインキュベートしてお
いたＳ.Ｏ.Ｃ.培地(２％バクト-トリプトンR、０.５％
酵母エキス、１０mM ＮａＣｌ、２.５mM ＫＣｌ、１０m
M ＭｇＣｌ2、１０mM ＭｇＳＯ4、２０mMグルコース)
０.９mlを加えた。次に、その細胞懸濁液を３７℃２２
５rpmで１時間振盪し、その一部をアンピシリンの入っ
たＬ-寒天上に植菌した。３７℃でインキュベートした
後、形質転換体と推定される菌をプレートから選び取っ
た。形質転換体と推定される菌の帰属を、水平ゲル電気
泳動を用いてプラスミドＤＮＡのサイズを測定すること
によって確認した(Sambrookら,1989)。選択したクロー
ンから得たプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって特
徴づけた。
感応細胞懸濁液１００μｌを−７０℃の貯蔵庫から取り
出し、氷上で融解させる。ポリプロピレン製チューブ中
で細胞をプラスミドＤＮＡの溶液(１ng／ml)５μlと穏
やかに混合し、得られた溶液を氷上で３０分間インキュ
ベートした。このチューブを４２℃の水槽に移し、振盪
せずに４５秒間インキュベートした。この熱ショック処
理後、チューブを氷上に２分間静置した。次に、チュー
ブを氷から取り出し、予め室温にインキュベートしてお
いたＳ.Ｏ.Ｃ.培地(２％バクト-トリプトンR、０.５％
酵母エキス、１０mM ＮａＣｌ、２.５mM ＫＣｌ、１０m
M ＭｇＣｌ2、１０mM ＭｇＳＯ4、２０mMグルコース)
０.９mlを加えた。次に、その細胞懸濁液を３７℃２２
５rpmで１時間振盪し、その一部をアンピシリンの入っ
たＬ-寒天上に植菌した。３７℃でインキュベートした
後、形質転換体と推定される菌をプレートから選び取っ
た。形質転換体と推定される菌の帰属を、水平ゲル電気
泳動を用いてプラスミドＤＮＡのサイズを測定すること
によって確認した(Sambrookら,1989)。選択したクロー
ンから得たプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって特
徴づけた。
【００４３】Ｄ．プラスミドＤＮＡの単離 標準的なアルカリ-ＳＤＳ法(Sambrookら,1989)を用いて
大腸菌株からプラスミドＤＮＡを単離した。別法とし
て、プラスミドＤＮＡを次のように単離した。５０mg／
mlのアンピシリンを含有するＬ-寒天上で生育する形質
転換体コロニーの一部を５０mg／mlのアンピシリンを含
むＬ-ブロス １リットルに移し、これを空気振盪機中３
７℃で約１６時間インキュベートした。ベックマンＪＡ
-１０ローターを用いる４℃,８０００rpm,１０分間の遠
心分離によって５００mlチューブ中に細胞を収集した。
細胞ペレットをｐＨ８.０のＴＥ(１０mMトリス塩酸、１
mMＥＤＴＡ)で洗浄し、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、
２５％ショ糖中に再懸濁して全量を１０mlとした。２５
mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)中の２０mg／mlリゾチーム[シ
グマ・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州セントルイ
ス)]１mlを撹拌しながら加え、その混合物を氷上で３０
分間インキュベートした。２００mM ＥＤＴＡ ４mlを加
えた後、氷上で１０分間インキュベートし、次いでブリ
ージ／ＤＯＣ溶菌溶液[１％ブリージ５８、０.４％デオ
キシコレート、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、６０mM
ＥＤＴＡ]１５mlを添加した。混合するためにチューブ
を穏やかに反転させ、氷上で１５〜３０分間インキュベ
ートした。ベックマンＪＡ-２０ローター中１８０００r
pmで１時間遠心分離することにより細胞残渣を除去し
た。上清を静かに移すことにより約３０mlを得、これに
１０mg／mlのＲＮＡｓｅ Ａ(シグマ・ケミカル・カンパ
ニー製)１５０mlを加えた。３７℃で１時間インキュベ
ートした後、１０mg／mlのプロテイナーゼＫ(ベーリン
ガー・マンハイム製)１５０mlを加え、次いで３７℃で
さらに１時間インキュベートした。１／１０体積の３M
酢酸ナトリウム(ｐＨ７.０)を添加し、次いで３体積の
氷冷無水エタノールを添加することによってＤＮＡを沈
殿させた。ベックマンＪＡ-１４ローター[ベックマン・
インストルメンツ,インコーポレイテッド製(カリフォル
ニア州９２６３４フラートン)]中８０００rpmで３０分
間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。風乾したペレ
ットをＴＥ(ｐＨ８.０)に再懸濁して全量を９mlにし、
これに塩化セシウム(ベーリンガー・マンハイム製)９g
および１０mg／ml臭化エチジウム ０.５mlを加えた。得
られた溶液を２つの５.１mlチューブ,クイック-シール
(Quik-Seal)(ベックマン・インストルメンツ,インコーポ
レイテッド)に移し、ベックマンＶＴｉ６５.２超遠心ロ
ーター中６５０００rpmで６時間遠心分離した。紫外光
下でプラスミドバンドを可視化し、これを注射器で取り
出した。臭化エチジウムを除去するために得られたＤＮ
Ａ溶液を塩飽和イソプロパノールで抽出し、１０００倍
体積のＴＥ(ｐＨ８.０)に対して１６時間透析した。必
要になるまで、ＤＮＡ溶液を−２０℃で保存した。
大腸菌株からプラスミドＤＮＡを単離した。別法とし
て、プラスミドＤＮＡを次のように単離した。５０mg／
mlのアンピシリンを含有するＬ-寒天上で生育する形質
転換体コロニーの一部を５０mg／mlのアンピシリンを含
むＬ-ブロス １リットルに移し、これを空気振盪機中３
７℃で約１６時間インキュベートした。ベックマンＪＡ
-１０ローターを用いる４℃,８０００rpm,１０分間の遠
心分離によって５００mlチューブ中に細胞を収集した。
細胞ペレットをｐＨ８.０のＴＥ(１０mMトリス塩酸、１
mMＥＤＴＡ)で洗浄し、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、
２５％ショ糖中に再懸濁して全量を１０mlとした。２５
mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)中の２０mg／mlリゾチーム[シ
グマ・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州セントルイ
ス)]１mlを撹拌しながら加え、その混合物を氷上で３０
分間インキュベートした。２００mM ＥＤＴＡ ４mlを加
えた後、氷上で１０分間インキュベートし、次いでブリ
ージ／ＤＯＣ溶菌溶液[１％ブリージ５８、０.４％デオ
キシコレート、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、６０mM
ＥＤＴＡ]１５mlを添加した。混合するためにチューブ
を穏やかに反転させ、氷上で１５〜３０分間インキュベ
ートした。ベックマンＪＡ-２０ローター中１８０００r
pmで１時間遠心分離することにより細胞残渣を除去し
た。上清を静かに移すことにより約３０mlを得、これに
１０mg／mlのＲＮＡｓｅ Ａ(シグマ・ケミカル・カンパ
ニー製)１５０mlを加えた。３７℃で１時間インキュベ
ートした後、１０mg／mlのプロテイナーゼＫ(ベーリン
ガー・マンハイム製)１５０mlを加え、次いで３７℃で
さらに１時間インキュベートした。１／１０体積の３M
酢酸ナトリウム(ｐＨ７.０)を添加し、次いで３体積の
氷冷無水エタノールを添加することによってＤＮＡを沈
殿させた。ベックマンＪＡ-１４ローター[ベックマン・
インストルメンツ,インコーポレイテッド製(カリフォル
ニア州９２６３４フラートン)]中８０００rpmで３０分
間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。風乾したペレ
ットをＴＥ(ｐＨ８.０)に再懸濁して全量を９mlにし、
これに塩化セシウム(ベーリンガー・マンハイム製)９g
および１０mg／ml臭化エチジウム ０.５mlを加えた。得
られた溶液を２つの５.１mlチューブ,クイック-シール
(Quik-Seal)(ベックマン・インストルメンツ,インコーポ
レイテッド)に移し、ベックマンＶＴｉ６５.２超遠心ロ
ーター中６５０００rpmで６時間遠心分離した。紫外光
下でプラスミドバンドを可視化し、これを注射器で取り
出した。臭化エチジウムを除去するために得られたＤＮ
Ａ溶液を塩飽和イソプロパノールで抽出し、１０００倍
体積のＴＥ(ｐＨ８.０)に対して１６時間透析した。必
要になるまで、ＤＮＡ溶液を−２０℃で保存した。
【００４４】Ｅ．ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅 ＤＮＡサーマルサイクラー(ＤＮＡ Thermal CyclerTM)
とジーン-アンプ(Gene-AmpTM)試薬キット[パーキン-エ
ルマー・シータス製(コネチカット州０６８５９ノルウ
ォーク)]を用い、製造者の指針に従ってポリメラーゼ連
鎖反応を行った。次のインキュベーションを１サイクル
として３０サイクルの増幅を行った：９３℃で１分、次
いで４０℃で２分、次いで７２℃で４分。７２℃で１０
分間インキュベートすることによって合成を完結させ
た。
とジーン-アンプ(Gene-AmpTM)試薬キット[パーキン-エ
ルマー・シータス製(コネチカット州０６８５９ノルウ
ォーク)]を用い、製造者の指針に従ってポリメラーゼ連
鎖反応を行った。次のインキュベーションを１サイクル
として３０サイクルの増幅を行った：９３℃で１分、次
いで４０℃で２分、次いで７２℃で４分。７２℃で１０
分間インキュベートすることによって合成を完結させ
た。
【００４５】Ｆ．ヌクレオチド配列の分析 キアゲン(Qiagen)ＤＮＡ結合カラム[キアゲン,インコー
ポレイテッド(カリフォルニア州チャトスワース)]を用
い、製造者が示す実験案に従って、大腸菌培養のアルカ
リ溶菌液から配列決定用の高次コイルプラスミドＤＮＡ
鋳型を精製した。蛍光性色素標識ジデオキシヌクレチ
ド、高次コインプラスミド鋳型および配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、サイクル配列決定法
[アプライド・バイオシステム,インコーポレイテッド
(ＡＢＩ)(カリフォルニア州９４４０４フォスターシテ
ィー)]に従って、ジデオキシヌクレオチド鎖終結(チェ
ーン・ターミネーション)配列決定反応を行った。配列
決定反応液をＡＢＩモデル３７３Ａ自動ＤＮＡシークエ
ンサーで分析した。ヌクレオチド配列を集め、編集し、
デベルックス(Devereux)らのＧＣＧコンピュータープロ
グラム(1985,Nucleic Acids Res.12:387-395)を用いて
分析した。
ポレイテッド(カリフォルニア州チャトスワース)]を用
い、製造者が示す実験案に従って、大腸菌培養のアルカ
リ溶菌液から配列決定用の高次コイルプラスミドＤＮＡ
鋳型を精製した。蛍光性色素標識ジデオキシヌクレチ
ド、高次コインプラスミド鋳型および配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、サイクル配列決定法
[アプライド・バイオシステム,インコーポレイテッド
(ＡＢＩ)(カリフォルニア州９４４０４フォスターシテ
ィー)]に従って、ジデオキシヌクレオチド鎖終結(チェ
ーン・ターミネーション)配列決定反応を行った。配列
決定反応液をＡＢＩモデル３７３Ａ自動ＤＮＡシークエ
ンサーで分析した。ヌクレオチド配列を集め、編集し、
デベルックス(Devereux)らのＧＣＧコンピュータープロ
グラム(1985,Nucleic Acids Res.12:387-395)を用いて
分析した。
【００４６】 Ｇ．オリゴヌクレオチドプローブの合成と末端ラベル化 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９から精製し
たＰＮＢエステラーゼ[比活性約２.２Ｕ／mg（ロラカル
ベフＰＮＢエステルの対応する遊離酸への加水分解に基
づく)]２５ピコモルを自動気相シークエネーターでの分
析(Hewickら,1981,J.Biol.Chem.256:7990；Hunkapiller
およびHood,1978,Biochemistry 17:2124)にかけること
により、この酵素のアミノ末端配列を得た。ＰＮＢエス
テラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列は、Met Thr His
Gln Ile Val Thr Thr Tyr Gly Lys Lys Val Lys Gly Th
r Gln Glu Asn Gly Val His（配列番号１)であった。
たＰＮＢエステラーゼ[比活性約２.２Ｕ／mg（ロラカル
ベフＰＮＢエステルの対応する遊離酸への加水分解に基
づく)]２５ピコモルを自動気相シークエネーターでの分
析(Hewickら,1981,J.Biol.Chem.256:7990；Hunkapiller
およびHood,1978,Biochemistry 17:2124)にかけること
により、この酵素のアミノ末端配列を得た。ＰＮＢエス
テラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列は、Met Thr His
Gln Ile Val Thr Thr Tyr Gly Lys Lys Val Lys Gly Th
r Gln Glu Asn Gly Val His（配列番号１)であった。
【００４７】この配列と公知のバチルス・ズプチリスに
関するコドン使用則[Harwoodら,“Molecular Biologica
l Methods for Bacillus",ジョン・ウィリー・アンド・サ
ンズ・リミテッド,イングランド,ウエスト・サセックス
(１９９０)]に基づき、β-シアノエチルホスホルアミダ
イト化学を用いるアプライドバイオシステムズ,インコ
ーポレイテッド・モデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置で、
製造者の指針に従って、２つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成した。ＰＮＢ１およびＰＮＢ２と命名したこ
れらオリゴヌクレオチドプローブを次に示す。ここでは
左から右に５'から３'の方向で表す。 ＰＮＢ１：ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A（配列番号５） ＰＮＢ２：TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CACACAAGAA AATGGCGTCC A（配列番号６）
関するコドン使用則[Harwoodら,“Molecular Biologica
l Methods for Bacillus",ジョン・ウィリー・アンド・サ
ンズ・リミテッド,イングランド,ウエスト・サセックス
(１９９０)]に基づき、β-シアノエチルホスホルアミダ
イト化学を用いるアプライドバイオシステムズ,インコ
ーポレイテッド・モデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置で、
製造者の指針に従って、２つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成した。ＰＮＢ１およびＰＮＢ２と命名したこ
れらオリゴヌクレオチドプローブを次に示す。ここでは
左から右に５'から３'の方向で表す。 ＰＮＢ１：ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A（配列番号５） ＰＮＢ２：TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CACACAAGAA AATGGCGTCC A（配列番号６）
【００４８】上記一本鎖ＤＮＡセグメントをまずカラム
精製(オリゴヌクレオチド・ピュリフィケーション・カ
ートリッジ；アプライド・バイオシステムズ,インコー
ポレイテッド製)し、次に以下のように末端ラベル化し
た。キナーゼ緩衝液[５０mMトリス塩酸(ｐＨ７.６)、１
０mM ＭｇＣｌ2]中のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ８
単位および[γ-32Ｐ]アデノシン三リン酸(ＡＴＰ；５０
００Ci／ml)１２μlを含有する２０μｌの反応混合物
に、各プローブ１０ピコモルを添加した。３７℃で３５
分間反応させ、キナーゼを不活化するために７０℃で５
分間インキュベートした後、セファデックスＧ-５０ニ
ックカラム[ファルマシア,インコーポレイテッド製(ニ
ュージャージー州０８８５４ピスカタウェイ)]を用い
て、取り込まれなかった[γ-32Ｐ]ＡＴＰを反応混合物
から除去した。
精製(オリゴヌクレオチド・ピュリフィケーション・カ
ートリッジ；アプライド・バイオシステムズ,インコー
ポレイテッド製)し、次に以下のように末端ラベル化し
た。キナーゼ緩衝液[５０mMトリス塩酸(ｐＨ７.６)、１
０mM ＭｇＣｌ2]中のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ８
単位および[γ-32Ｐ]アデノシン三リン酸(ＡＴＰ；５０
００Ci／ml)１２μlを含有する２０μｌの反応混合物
に、各プローブ１０ピコモルを添加した。３７℃で３５
分間反応させ、キナーゼを不活化するために７０℃で５
分間インキュベートした後、セファデックスＧ-５０ニ
ックカラム[ファルマシア,インコーポレイテッド製(ニ
ュージャージー州０８８５４ピスカタウェイ)]を用い
て、取り込まれなかった[γ-32Ｐ]ＡＴＰを反応混合物
から除去した。
【００４９】Ｈ．バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８
０７９からのゲノムＤＮＡの単離 ＴＳＢ中２５℃で１６時間生育して対数増殖中期に達し
たバチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９の培養２
リットルから全ＤＮＡを単離した。遠心分離によって細
胞を収集し、緩衝液[５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、５
０mM ＥＤＴＡ]２０ml中に再懸濁した。細胞の溶解を次
の２工程で達成した：(ｉ)１mg／mlのリゾチーム[卵白
由来：カルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョ
ラ)]を添加し、その懸濁液を３７℃で２０分間インキュ
ベートし、次いで(ii)溶菌緩衝液[０.５％ドデシル硫酸
ナトリウム(ＳＤＳ)、５０mMトリス(ｐＨ７.５)、０.４
M ＥＤＴＡ、１mg／mlプロテイナーゼＫ]４mlを添加
し、５０℃で３０分間インキュベートする。２回フェノ
ール抽出し、次いで１回クロロホルム抽出することによ
ってＤＮＡを精製した後、エタノールで沈殿させ、これ
をガラス棒に巻き取ることによって回収した。１mM Ｅ
ＤＴＡと０.２mg／mlリボヌクレアーゼ(ウシ膵臓由来；
シグマ・ケミカル・カンパニー製)を含有する４０mMト
リス塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)中にＤＮＡを穏やかに再懸
濁し、その調製物を２５℃で３０分間インキュベートす
ることによって、上記調製物からＲＮＡを除去した。フ
ェノールとクロロホルムで再抽出し、これをＴＥ(ｐＨ
７.５)に再懸濁することによってさらなる精製を達成し
た。
０７９からのゲノムＤＮＡの単離 ＴＳＢ中２５℃で１６時間生育して対数増殖中期に達し
たバチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９の培養２
リットルから全ＤＮＡを単離した。遠心分離によって細
胞を収集し、緩衝液[５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、５
０mM ＥＤＴＡ]２０ml中に再懸濁した。細胞の溶解を次
の２工程で達成した：(ｉ)１mg／mlのリゾチーム[卵白
由来：カルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョ
ラ)]を添加し、その懸濁液を３７℃で２０分間インキュ
ベートし、次いで(ii)溶菌緩衝液[０.５％ドデシル硫酸
ナトリウム(ＳＤＳ)、５０mMトリス(ｐＨ７.５)、０.４
M ＥＤＴＡ、１mg／mlプロテイナーゼＫ]４mlを添加
し、５０℃で３０分間インキュベートする。２回フェノ
ール抽出し、次いで１回クロロホルム抽出することによ
ってＤＮＡを精製した後、エタノールで沈殿させ、これ
をガラス棒に巻き取ることによって回収した。１mM Ｅ
ＤＴＡと０.２mg／mlリボヌクレアーゼ(ウシ膵臓由来；
シグマ・ケミカル・カンパニー製)を含有する４０mMト
リス塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)中にＤＮＡを穏やかに再懸
濁し、その調製物を２５℃で３０分間インキュベートす
ることによって、上記調製物からＲＮＡを除去した。フ
ェノールとクロロホルムで再抽出し、これをＴＥ(ｐＨ
７.５)に再懸濁することによってさらなる精製を達成し
た。
【００５０】Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブを用いる
ＥcoＲＩ制限断片のサザンハイブリッド形成 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９から得たゲ
ノムＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、１％アガロス-ＴＢＥ
ゲル(Sambrookら,1989)での電気泳動にかけた。次に、
サイズ分画したＤＮＡをサザンブロッティング(Sambroo
kら,1989)によってハイボンド-Ｎ＋ ナイロン膜[アマシ
ャム製(米国イリノイ州アルリングトン・ハイツ)]に転
写し、紫外光で５分間処理することによって上記基盤に
架橋させた。そのＤＮＡを、６×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ(ｐ
Ｈ７.０)は０.１５M ＮａＣｌ、０.０１５Mクエン酸ナ
トリウムを含有する]、５×デンハルト溶液[１×デンハ
ルト溶液は０.２g／l フィコール４００、０.２g／l ポ
リビニルピロリドンおよび０.２g／ｌ ウシ血清アルブ
ミン(フラクションＶ)を含有する]、０.２５％ＳＤＳ、
および超音波処理によって断片化した２０μg／mlウシ
胸腺ＤＮＡを含有するハイブリッド形成緩衝液中７０℃
で１〜２時間予備ハイブリッド形成させた後、[32Ｐ]-
標識オリゴヌクレオチド(実施例２Ｇに記述したように
調製したもの)を含有する新鮮なハイブリッド形成緩衝
液を加えて最終プローブ濃度を０.５ピコモル／mlにし
た。このインキュベーション混合物の温度を終夜インキ
ュベーションの間に４５℃に低下させた。次に、各プロ
ーブについて最適化した厳密度条件を用いてこの膜を洗
浄した。ＰＮＢ１にハイブリッド形成させた膜は、４×
ＳＳＣ、０.２５％ＳＤＳ中４５℃で３回連続して２５
分間洗浄した。ＰＮＢ２にハイブリッド形成させた膜
は、０.５×ＳＳＣ、０.２５％ＳＤＳを用いて同様に洗
浄した。洗浄後、膜を室温で乾燥し、フィルムにさらし
た。
ＥcoＲＩ制限断片のサザンハイブリッド形成 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９から得たゲ
ノムＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、１％アガロス-ＴＢＥ
ゲル(Sambrookら,1989)での電気泳動にかけた。次に、
サイズ分画したＤＮＡをサザンブロッティング(Sambroo
kら,1989)によってハイボンド-Ｎ＋ ナイロン膜[アマシ
ャム製(米国イリノイ州アルリングトン・ハイツ)]に転
写し、紫外光で５分間処理することによって上記基盤に
架橋させた。そのＤＮＡを、６×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ(ｐ
Ｈ７.０)は０.１５M ＮａＣｌ、０.０１５Mクエン酸ナ
トリウムを含有する]、５×デンハルト溶液[１×デンハ
ルト溶液は０.２g／l フィコール４００、０.２g／l ポ
リビニルピロリドンおよび０.２g／ｌ ウシ血清アルブ
ミン(フラクションＶ)を含有する]、０.２５％ＳＤＳ、
および超音波処理によって断片化した２０μg／mlウシ
胸腺ＤＮＡを含有するハイブリッド形成緩衝液中７０℃
で１〜２時間予備ハイブリッド形成させた後、[32Ｐ]-
標識オリゴヌクレオチド(実施例２Ｇに記述したように
調製したもの)を含有する新鮮なハイブリッド形成緩衝
液を加えて最終プローブ濃度を０.５ピコモル／mlにし
た。このインキュベーション混合物の温度を終夜インキ
ュベーションの間に４５℃に低下させた。次に、各プロ
ーブについて最適化した厳密度条件を用いてこの膜を洗
浄した。ＰＮＢ１にハイブリッド形成させた膜は、４×
ＳＳＣ、０.２５％ＳＤＳ中４５℃で３回連続して２５
分間洗浄した。ＰＮＢ２にハイブリッド形成させた膜
は、０.５×ＳＳＣ、０.２５％ＳＤＳを用いて同様に洗
浄した。洗浄後、膜を室温で乾燥し、フィルムにさらし
た。
【００５１】上記の方法を用いることによって、約６kb
の大きさのＥcoＲＩ断片を示すバンドがプローブＰＮＢ
１およびＰＮＢ２とハイブリッド形成することがわかっ
た。
の大きさのＥcoＲＩ断片を示すバンドがプローブＰＮＢ
１およびＰＮＢ２とハイブリッド形成することがわかっ
た。
【００５２】Ｊ．ＥcoＲＩ断片の濃縮ライブラリーの構
築とｐＮＢＥ１の単離 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７ゲノムＤＮ
ＡをＥcoＲＩで完全に消化し、水平１.２％アガロース
ゲル(４０mMトリス酢酸および１mM ＥＤＴＡからなる１
×ＴＡＥ緩衝液中，２Ｖ／cm)中で１６時間電気泳動に
かけた。このゲルを臭化エチジウム希釈液(１mg／ml)中
で染色し、長波長紫外光下でＤＮＡバンドを可視化し
た。大きさが約６kbのＤＮＡに対応するゲルの領域であ
って、かつ、ＰＮＢ１およびＰＮＢ２とハイブリッド形
成することが既にわかっているバンドをまたぐゲルの領
域から切片を取り出した。サムブルックらの手法(Sambr
ook,1989)に従い、これにわずかな調整を加えて、ゲル
切片からＤＮＡ断片を溶出させた。簡単に述べると、ゲ
ル切片を０.２×ＴＡＥ緩衝液２００μlと共に透析袋中
に入れ、クリップで封印し、０.２×ＴＡＥ緩衝液中で
約３時間電気泳動した。透析袋の内容物を０.２×ＴＡ
Ｅによる洗浄液４００μlと共に低塩緩衝液[０.２M Ｎ
ａＣｌ、２０mMトリス塩酸(ｐＨ７.５)、１.０mM ＥＤ
ＴＡ]２.４mlと混合し、これを製造者の実験案に従って
調製したエルーチップ-ｄカラム[シュライシャー・アン
ド・シュネル製(ニューハンプシャー州キーン)]に充填
した。低塩緩衝液で洗浄した後、４００μlの高塩緩衝
液[１.０M ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸(ｐＨ７.５)、
１.０mM ＥＤＴＡ]を２回用いてＤＮＡを上記カラムか
ら溶出させ、そのＤＮＡを氷冷無水エタノール８００μ
lの添加によって沈殿させ、次いでエッペンドルフ５４
１５Ｃ微量遠心機中１４０００rpmで４０分間遠心分離
した。風乾した２つのペレットをＴＥ(ｐＨ７.５)２０m
lに溶解することによって合わせ、その溶液を連結操作
まで−２０℃で保存した。これらの断片を、ＥｃｏＲＩ
消化とそれに続くウシ腸アルカリ性ホスファターゼ［カ
ルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]での５'
リン酸基除去によって予備処理したベクターｐＵＣ１９
[ギブコ ＢＲＬ製(メリーランド州ガイサースブルク)]
中に連結した。
築とｐＮＢＥ１の単離 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７ゲノムＤＮ
ＡをＥcoＲＩで完全に消化し、水平１.２％アガロース
ゲル(４０mMトリス酢酸および１mM ＥＤＴＡからなる１
×ＴＡＥ緩衝液中，２Ｖ／cm)中で１６時間電気泳動に
かけた。このゲルを臭化エチジウム希釈液(１mg／ml)中
で染色し、長波長紫外光下でＤＮＡバンドを可視化し
た。大きさが約６kbのＤＮＡに対応するゲルの領域であ
って、かつ、ＰＮＢ１およびＰＮＢ２とハイブリッド形
成することが既にわかっているバンドをまたぐゲルの領
域から切片を取り出した。サムブルックらの手法(Sambr
ook,1989)に従い、これにわずかな調整を加えて、ゲル
切片からＤＮＡ断片を溶出させた。簡単に述べると、ゲ
ル切片を０.２×ＴＡＥ緩衝液２００μlと共に透析袋中
に入れ、クリップで封印し、０.２×ＴＡＥ緩衝液中で
約３時間電気泳動した。透析袋の内容物を０.２×ＴＡ
Ｅによる洗浄液４００μlと共に低塩緩衝液[０.２M Ｎ
ａＣｌ、２０mMトリス塩酸(ｐＨ７.５)、１.０mM ＥＤ
ＴＡ]２.４mlと混合し、これを製造者の実験案に従って
調製したエルーチップ-ｄカラム[シュライシャー・アン
ド・シュネル製(ニューハンプシャー州キーン)]に充填
した。低塩緩衝液で洗浄した後、４００μlの高塩緩衝
液[１.０M ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸(ｐＨ７.５)、
１.０mM ＥＤＴＡ]を２回用いてＤＮＡを上記カラムか
ら溶出させ、そのＤＮＡを氷冷無水エタノール８００μ
lの添加によって沈殿させ、次いでエッペンドルフ５４
１５Ｃ微量遠心機中１４０００rpmで４０分間遠心分離
した。風乾した２つのペレットをＴＥ(ｐＨ７.５)２０m
lに溶解することによって合わせ、その溶液を連結操作
まで−２０℃で保存した。これらの断片を、ＥｃｏＲＩ
消化とそれに続くウシ腸アルカリ性ホスファターゼ［カ
ルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]での５'
リン酸基除去によって予備処理したベクターｐＵＣ１９
[ギブコ ＢＲＬ製(メリーランド州ガイサースブルク)]
中に連結した。
【００５３】得られたプラスミドを用いて感応性大腸菌
Ｋ１２ ＤＨ５α細胞を形質転換し、次いでそれらの細
胞をアンピシリンとＸ-Ｇａｌの入ったＬ-寒天プレート
に植菌した。ベクターとしてプラスミドｐＵＣ１９を使
用することにより、青／白選択を用いて、挿入ＤＮＡを
含有するクローンを特異的に選択することができる。β
-ガラクトシダーゼのα-ペプチドをコード化するｌａｃ
Ｚ遺伝子の一部を含むｐＵＣ１９ベクターのみを含有す
る形質転換体は、Ｘ-Ｇａｌの切断で生じる青色によっ
て検出される活性な酵素を生産する。対照的に、ＥcoＲ
Ｉ部位に挿入物を含有する単離体は上記α-ペプチドの
読み枠を破壊し、Ｘ-Ｇａｌを変換することができない
ので、この単離体はＸ-Ｇａｌを含有する培地上で白色
のままである。１００以上の白いアンピシリン耐性コロ
ニーを選択し、表現型の安定性を試験するために同寒天
上に再植菌した。
Ｋ１２ ＤＨ５α細胞を形質転換し、次いでそれらの細
胞をアンピシリンとＸ-Ｇａｌの入ったＬ-寒天プレート
に植菌した。ベクターとしてプラスミドｐＵＣ１９を使
用することにより、青／白選択を用いて、挿入ＤＮＡを
含有するクローンを特異的に選択することができる。β
-ガラクトシダーゼのα-ペプチドをコード化するｌａｃ
Ｚ遺伝子の一部を含むｐＵＣ１９ベクターのみを含有す
る形質転換体は、Ｘ-Ｇａｌの切断で生じる青色によっ
て検出される活性な酵素を生産する。対照的に、ＥcoＲ
Ｉ部位に挿入物を含有する単離体は上記α-ペプチドの
読み枠を破壊し、Ｘ-Ｇａｌを変換することができない
ので、この単離体はＸ-Ｇａｌを含有する培地上で白色
のままである。１００以上の白いアンピシリン耐性コロ
ニーを選択し、表現型の安定性を試験するために同寒天
上に再植菌した。
【００５４】白コロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、これをゲル電気泳動によって分析した。必要な９kb
の大きさ(２.６８６kbのｐＵＣ１９ＤＮＡ＋約６kbの挿
入ＤＮＡ)のプラスミドＤＮＡを含有する７つのコロニ
ーをさらなる研究のために選択した。ＰＮＢ２プローブ
を用いるサザンハイブリッド形成によって試験したとこ
ろ、１つのプラスミドｐＮＢＥ１が強いハイブリッド形
成信号を示した。プラスミドｐＮＢＥ１をＥcoＲＩで消
化すると予期される大きさの２つの断片、即ち、直線化
したｐＵＣ１９(２.６８６kb)に対応する１断片と挿入
断片に対応する約６kbの大きさのもう１つの断片が得ら
れた。
し、これをゲル電気泳動によって分析した。必要な９kb
の大きさ(２.６８６kbのｐＵＣ１９ＤＮＡ＋約６kbの挿
入ＤＮＡ)のプラスミドＤＮＡを含有する７つのコロニ
ーをさらなる研究のために選択した。ＰＮＢ２プローブ
を用いるサザンハイブリッド形成によって試験したとこ
ろ、１つのプラスミドｐＮＢＥ１が強いハイブリッド形
成信号を示した。プラスミドｐＮＢＥ１をＥcoＲＩで消
化すると予期される大きさの２つの断片、即ち、直線化
したｐＵＣ１９(２.６８６kb)に対応する１断片と挿入
断片に対応する約６kbの大きさのもう１つの断片が得ら
れた。
【００５５】Ｋ．プラスミドｐＮＢＥ１上のｐｎｂＡの
転写の方向の解明 ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子に対するｐｎｂＡの転写の
方向と、ｐＮＢＥ１挿入物中のＡＴＧ転写開始部位のお
よその位置を決定するために、ｐＮＢＥ１を用いて２回
のＰＣＲ増幅を行った。第１の増幅ではＰＮＢ２オリゴ
ヌクレオチドプローブと順方向(−２０)Ｍ１３ＤＮＡ配
列決定用プライマー(ニュー・イングランド・バイオラ
ブス製)を使用した。第２の増幅でもＰＮＢ２を使用し
たが、もう１つのプライマーは逆方向(−２４)Ｍ１３配
列決定用プライマーであった。その結果、(−２０)順方
向配列決定用プライマーを用いた反応のみが増幅した断
片を与えることがわかった。増幅された断片の大きさを
決定したところ、２.０kbであった。したがって、ｐｎ
ｂＡのＡＴＧ開始部位はｐＵＣ１９のマルチクローニン
グ部位の開始部位から約４kb(キロ塩基対)下流に位置
し、ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向に転写される。
転写の方向の解明 ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子に対するｐｎｂＡの転写の
方向と、ｐＮＢＥ１挿入物中のＡＴＧ転写開始部位のお
よその位置を決定するために、ｐＮＢＥ１を用いて２回
のＰＣＲ増幅を行った。第１の増幅ではＰＮＢ２オリゴ
ヌクレオチドプローブと順方向(−２０)Ｍ１３ＤＮＡ配
列決定用プライマー(ニュー・イングランド・バイオラ
ブス製)を使用した。第２の増幅でもＰＮＢ２を使用し
たが、もう１つのプライマーは逆方向(−２４)Ｍ１３配
列決定用プライマーであった。その結果、(−２０)順方
向配列決定用プライマーを用いた反応のみが増幅した断
片を与えることがわかった。増幅された断片の大きさを
決定したところ、２.０kbであった。したがって、ｐｎ
ｂＡのＡＴＧ開始部位はｐＵＣ１９のマルチクローニン
グ部位の開始部位から約４kb(キロ塩基対)下流に位置
し、ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向に転写される。
【００５６】Ｌ．機能的ｐｎｂＡ遺伝子の確認 全ｐｎｂＡ遺伝子がｐＮＢＥ１上に存在するかどうか、
また、それが大腸菌中で発現することができるかどうか
を決定するために、プラスミドｐＮＢＥ１で形質転換し
た大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞の抽出物をエステラーゼ
活性について検定した。Ｌ-ブロス中で対数増殖中期ま
で生育した培養約７５mlから細胞抽出物を調製した。８
０００rpmで１０分間の遠心分離によって細胞を収集
し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０)中で洗
浄し、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁(１g細胞／
４ml緩衝液)し、３０秒間の超音波破砕[ソニケーター(S
onicatorTM)セル・ディスラプター・モデルＷ１８５Ｆ；
ヒート・システムズ-ウルトラソニックス,インコーポレ
イテッド製(ニューヨーク州プラインビュー)]に４回さ
らすことによって破壊した。微量遠心機中最大速度で２
０分間の遠心分離によって細胞残渣を除去した。精製Ｐ
ＮＢエステラーゼはβ-ラクタム系抗生物質のｐ-ニトロ
ベンジルエステルだけでなく酢酸ｐ-ニトロフェニルの
切断をも触媒するので、この反応を利用してｐ-ニトロ
フェノールの生成を分光光度測定法で都合よく監視する
ことができた。０.５M 酢酸ｐ-ニトロフェニル[１:９９
(ｖ／ｖ)アセトニトリル／水中]４００μl、１６７mMト
リス塩酸(ｐＨ７.０)６００μlおよび無細胞抽出物１〜
２０μlを含有する反応混合物を用いた。ギルフォード
・レスポンスII分光光度計を用いてＯＤ405の増大を監
視することにより、ｐ-ニトロフェノールの生成を分光
光度測定法で測定した。別法として、爪楊枝を用いてコ
ロニーの一部を上記反応混合物中に添加することによ
り、全細胞を使って酵素活性を定性的に明らかにするこ
ともできた。これらの方法による全細胞と無細胞抽出物
の検定は共に、プラスミドｐＮＢＥ１が無傷のｐｎｂＡ
遺伝子を含有すること並びに該遺伝子が発現して活性な
酵素を生産したことを立証した。プラスミドを保持しな
い大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中、あるいは上記ゲノム
ライブラリーから得られる他の非ハイブリッド形成性プ
ラスミドを保持する大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中には
有意な活性が検出されなかった。
また、それが大腸菌中で発現することができるかどうか
を決定するために、プラスミドｐＮＢＥ１で形質転換し
た大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞の抽出物をエステラーゼ
活性について検定した。Ｌ-ブロス中で対数増殖中期ま
で生育した培養約７５mlから細胞抽出物を調製した。８
０００rpmで１０分間の遠心分離によって細胞を収集
し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０)中で洗
浄し、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁(１g細胞／
４ml緩衝液)し、３０秒間の超音波破砕[ソニケーター(S
onicatorTM)セル・ディスラプター・モデルＷ１８５Ｆ；
ヒート・システムズ-ウルトラソニックス,インコーポレ
イテッド製(ニューヨーク州プラインビュー)]に４回さ
らすことによって破壊した。微量遠心機中最大速度で２
０分間の遠心分離によって細胞残渣を除去した。精製Ｐ
ＮＢエステラーゼはβ-ラクタム系抗生物質のｐ-ニトロ
ベンジルエステルだけでなく酢酸ｐ-ニトロフェニルの
切断をも触媒するので、この反応を利用してｐ-ニトロ
フェノールの生成を分光光度測定法で都合よく監視する
ことができた。０.５M 酢酸ｐ-ニトロフェニル[１:９９
(ｖ／ｖ)アセトニトリル／水中]４００μl、１６７mMト
リス塩酸(ｐＨ７.０)６００μlおよび無細胞抽出物１〜
２０μlを含有する反応混合物を用いた。ギルフォード
・レスポンスII分光光度計を用いてＯＤ405の増大を監
視することにより、ｐ-ニトロフェノールの生成を分光
光度測定法で測定した。別法として、爪楊枝を用いてコ
ロニーの一部を上記反応混合物中に添加することによ
り、全細胞を使って酵素活性を定性的に明らかにするこ
ともできた。これらの方法による全細胞と無細胞抽出物
の検定は共に、プラスミドｐＮＢＥ１が無傷のｐｎｂＡ
遺伝子を含有すること並びに該遺伝子が発現して活性な
酵素を生産したことを立証した。プラスミドを保持しな
い大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中、あるいは上記ゲノム
ライブラリーから得られる他の非ハイブリッド形成性プ
ラスミドを保持する大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中には
有意な活性が検出されなかった。
【００５７】Ｍ．ｐｎｂＡ遺伝子のサブクローニング 上述のＰＣＲ実験から得られた情報およびｐＮＢＥ１の
一制限酵素消化および二重制限酵素消化の結果を用い
て、上記６.０kbＥcoＲＩ断片の予備的な物理的地図を
作成することができた。プラスミドｐＮＢＥ１の制限酵
素部位と機能地図を図２に示す。次に、ｐＮＢＥ１をＨ
paIIで部分消化した後、ＥcoＲＩで完全消化し、得られ
たＨpaII-ＥcoＲＩ断片をＡccＩ-ＥcoＲＩで消化したｐ
ＵＣ１９に連結することによって、このプラスミドの一
連のサブクローンを作成した。上記挿入物のＨpaII部位
とｐＵＣ１９のＡccＩ部位はこの連結によって再生され
なかった。次に、得られたプラスミドを大腸菌Ｋ１２
ＤＨ５α細胞中に導入し、アンピシリン耐性コロニーを
選択し、それらをエステラーゼ活性について試験した。
いくつかの陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離
し、それらを分析してそのＨpaII-ＥcoＲＩ挿入物の大
きさを決定した。活性な酵素をコード化する最も小さい
挿入物は２.３kbであった。このプラスミドベクターを
ｐＮＢＨｐＥ２.３と命名した。
一制限酵素消化および二重制限酵素消化の結果を用い
て、上記６.０kbＥcoＲＩ断片の予備的な物理的地図を
作成することができた。プラスミドｐＮＢＥ１の制限酵
素部位と機能地図を図２に示す。次に、ｐＮＢＥ１をＨ
paIIで部分消化した後、ＥcoＲＩで完全消化し、得られ
たＨpaII-ＥcoＲＩ断片をＡccＩ-ＥcoＲＩで消化したｐ
ＵＣ１９に連結することによって、このプラスミドの一
連のサブクローンを作成した。上記挿入物のＨpaII部位
とｐＵＣ１９のＡccＩ部位はこの連結によって再生され
なかった。次に、得られたプラスミドを大腸菌Ｋ１２
ＤＨ５α細胞中に導入し、アンピシリン耐性コロニーを
選択し、それらをエステラーゼ活性について試験した。
いくつかの陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離
し、それらを分析してそのＨpaII-ＥcoＲＩ挿入物の大
きさを決定した。活性な酵素をコード化する最も小さい
挿入物は２.３kbであった。このプラスミドベクターを
ｐＮＢＨｐＥ２.３と命名した。
【００５８】さらにサブクローニング実験を行ったとこ
ろ、上記２.３kb挿入物の遠位末端にあるＳalＩ-ＥcoＲ
Ｉ断片が機能的なｐｎｂＡ遺伝子にとっては必要ないこ
とがわかった。ｐＮＢＨｐＥ２.３をまずＨindIIIとＳa
lＩで消化し、これをＨindIIIとＳalＩで消化したｐＵ
Ｃ１９に連結した後、大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中に
導入した。この構築によって得られたプラスミドをｐＮ
ＢＨ３Ｓ１.９と命名した。ｐＮＢＨ３Ｓ１.９は１.９k
bのＨpaII-ＳalＩ挿入物を含有し、活性なＰＮＢエステ
ラーゼタンパク質をコード化していた。このプラスミド
から得られる挿入ＤＮＡをｐＢluesript ＳＫ(−)[スト
ラタジーン製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]中にサブ
クローニングし、そのヌクレオチド配列を決定するべく
分析した。
ろ、上記２.３kb挿入物の遠位末端にあるＳalＩ-ＥcoＲ
Ｉ断片が機能的なｐｎｂＡ遺伝子にとっては必要ないこ
とがわかった。ｐＮＢＨｐＥ２.３をまずＨindIIIとＳa
lＩで消化し、これをＨindIIIとＳalＩで消化したｐＵ
Ｃ１９に連結した後、大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中に
導入した。この構築によって得られたプラスミドをｐＮ
ＢＨ３Ｓ１.９と命名した。ｐＮＢＨ３Ｓ１.９は１.９k
bのＨpaII-ＳalＩ挿入物を含有し、活性なＰＮＢエステ
ラーゼタンパク質をコード化していた。このプラスミド
から得られる挿入ＤＮＡをｐＢluesript ＳＫ(−)[スト
ラタジーン製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]中にサブ
クローニングし、そのヌクレオチド配列を決定するべく
分析した。
【００５９】実施例３：大腸菌におけるｐｎｂＡ遺伝子
の高レベル発現 クローン化したＰＮＢエステラーゼ遺伝子の大腸菌にお
ける発現を、ベクターｐＮＢ１０６Ｒを構築することに
よって改善した。プラスミドｐＮＢ１０６Ｒはプラスミ
ドコピー数の制御に寄与するｒｏｐ遺伝子を含有する(C
esareniら,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6313)。プ
ラスミドｐＮＢ１０６Ｒの制限酵素部位と機能地図を図
３に示す。
の高レベル発現 クローン化したＰＮＢエステラーゼ遺伝子の大腸菌にお
ける発現を、ベクターｐＮＢ１０６Ｒを構築することに
よって改善した。プラスミドｐＮＢ１０６Ｒはプラスミ
ドコピー数の制御に寄与するｒｏｐ遺伝子を含有する(C
esareniら,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6313)。プ
ラスミドｐＮＢ１０６Ｒの制限酵素部位と機能地図を図
３に示す。
【００６０】Ａ．大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／ｐＮＢ１０
６Ｒ、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＮＢ１０６Ｒおよ
び大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ１１１０５／ｐＮＢ１０６Ｒの構
築 異種遺伝子を改良型バクテリオファージラムダｐＬプロ
モーターから温度誘導的に発現させるべく、プラスミド
ｐＮＢＨ３Ｓ１.９から得られる１.９kbのＤＮＡ断片を
温度誘導性高レベル発現ベクターｐＨＫＹ３３８中にサ
ブクローニングすることによってプラスミドｐＮＢ１０
６Ｒを作成した。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＫＹ
３３８はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボラトリ
ー(ＮＲＲＬ)[米国農務省(イリノイ州６１６０４ペオリ
ア)]の永久保存株に１９９２年１月３１日付けで寄託さ
れており、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８９４５の下で入手
することができる。このプラスミドは特に重要な２つの
ＤＮＡ領域、即ち(ｉ)大腸菌中での該プラスミドの複製
と維持を可能にするｐＢＲ３２２から誘導された配列で
あって、その中のｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝
子がラムダｃＩ抑制遺伝子で置換されている配列および
(ii)テトラサイクリン遺伝子の下流に位置する改良型ラ
ムダプロモーターｐＬ１０６(米国特許出願第０７／７
３９２８０号)がカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠(Ｏ
ＲＦ，オープンリーディングフレーム)に直に隣接して
いる配列、を含有する。上記プロモーターは“枠外"２
シストロン集合を介して上記ＯＲＦの転写を制御する(S
chonerら,1990,Methods in Enzymology 185:94)。プラ
スミドｐＨＫＹ３３８は、ＮdeＩとＢamＨＩでの消化に
よってカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠を容易に除去
できるように構築された。ＡＴＧ転写開始コドンの部位
にＮdeＩ制限部位を有し、かつ、潜在的転写終止配列の
下流にＢamＨＩ互換性制限部位を有するＯＲＦはすべて
ｐＨＫＹ３３８中に挿入することができる。そうすれ
ば、これによって得られる挿入されたＯＲＦはバクテリ
オファージラムダｐＬプロモーターからの発現にとって
適正に並ぶことになる。
６Ｒ、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＮＢ１０６Ｒおよ
び大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ１１１０５／ｐＮＢ１０６Ｒの構
築 異種遺伝子を改良型バクテリオファージラムダｐＬプロ
モーターから温度誘導的に発現させるべく、プラスミド
ｐＮＢＨ３Ｓ１.９から得られる１.９kbのＤＮＡ断片を
温度誘導性高レベル発現ベクターｐＨＫＹ３３８中にサ
ブクローニングすることによってプラスミドｐＮＢ１０
６Ｒを作成した。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＫＹ
３３８はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボラトリ
ー(ＮＲＲＬ)[米国農務省(イリノイ州６１６０４ペオリ
ア)]の永久保存株に１９９２年１月３１日付けで寄託さ
れており、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８９４５の下で入手
することができる。このプラスミドは特に重要な２つの
ＤＮＡ領域、即ち(ｉ)大腸菌中での該プラスミドの複製
と維持を可能にするｐＢＲ３２２から誘導された配列で
あって、その中のｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝
子がラムダｃＩ抑制遺伝子で置換されている配列および
(ii)テトラサイクリン遺伝子の下流に位置する改良型ラ
ムダプロモーターｐＬ１０６(米国特許出願第０７／７
３９２８０号)がカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠(Ｏ
ＲＦ，オープンリーディングフレーム)に直に隣接して
いる配列、を含有する。上記プロモーターは“枠外"２
シストロン集合を介して上記ＯＲＦの転写を制御する(S
chonerら,1990,Methods in Enzymology 185:94)。プラ
スミドｐＨＫＹ３３８は、ＮdeＩとＢamＨＩでの消化に
よってカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠を容易に除去
できるように構築された。ＡＴＧ転写開始コドンの部位
にＮdeＩ制限部位を有し、かつ、潜在的転写終止配列の
下流にＢamＨＩ互換性制限部位を有するＯＲＦはすべて
ｐＨＫＹ３３８中に挿入することができる。そうすれ
ば、これによって得られる挿入されたＯＲＦはバクテリ
オファージラムダｐＬプロモーターからの発現にとって
適正に並ぶことになる。
【００６１】クローン化した１.９kbのバチルス・ズプ
チリスＤＮＡはＮdeＩ部位を所望の位置に含有していな
かったので、ｐｎｂＡ ＯＲＦのＡＴＧ転写開始部位に
それを導入する方法を開発した。この方法には、ｐｎｂ
Ａ遺伝子のアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を作成
するために別個の構築を行い、次にそれら２つの断片を
ｐＨＫＹ３３８ベクターから得られる第３の断片に連結
することが含まれる。上記３断片の構築を以下のように
達成した。
チリスＤＮＡはＮdeＩ部位を所望の位置に含有していな
かったので、ｐｎｂＡ ＯＲＦのＡＴＧ転写開始部位に
それを導入する方法を開発した。この方法には、ｐｎｂ
Ａ遺伝子のアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を作成
するために別個の構築を行い、次にそれら２つの断片を
ｐＨＫＹ３３８ベクターから得られる第３の断片に連結
することが含まれる。上記３断片の構築を以下のように
達成した。
【００６２】ｉ）アミノ末端断片 ＰＮＢエステラーゼのアミノ末端部をコード化し、か
つ、そのＡＴＧ転写開始部位の５'側に隣接するＮdeＩ
部位を含有する２６１bpの断片をＰＣＲ技術(実施例２
Ｅを参照のこと)を用いて合成した。このＰＣＲ増幅は
次の２つのプライマーを用いて行った(左から右に５'か
ら３'の方向で記載する)。 １．ＰＮＢＮＤＥ１：AAAAAGGGAG AGAACCATAT GACTCATC
AA ATAG（配列番号７） ２．ＰＮＢ５：TTGACATACA AGCAATCCTC（配列番号８）
つ、そのＡＴＧ転写開始部位の５'側に隣接するＮdeＩ
部位を含有する２６１bpの断片をＰＣＲ技術(実施例２
Ｅを参照のこと)を用いて合成した。このＰＣＲ増幅は
次の２つのプライマーを用いて行った(左から右に５'か
ら３'の方向で記載する)。 １．ＰＮＢＮＤＥ１：AAAAAGGGAG AGAACCATAT GACTCATC
AA ATAG（配列番号７） ２．ＰＮＢ５：TTGACATACA AGCAATCCTC（配列番号８）
【００６３】上で下線を付したＰＮＢＮＤＥ１の配列は
ＮdeＩ制限部位を表す。このプライマーの最初の３塩基
はクローン化したＰＮＢエステラーゼ遺伝子と合致しな
い。他方のプライマーＰＮＢ５はＡＴＧ開始部位から２
１５bp下流に位置するＡccＩ部位の下流約２５塩基対(b
p)にアニールする。上記増幅がもたらした２６１bpの断
片を、クロウ(Crowe)らが記述した方法(1991,Nuc.Acid
Res.19:184)に従い、これにわずかな変更を加えてプロ
テイナーゼＫ(トリチラチウム・アルブム由来のプロテ
アーゼ・タイプXXVIII)で処理した。次いでその断片を
標準的な方法を用いてＮdeＩおよびＡccＩで消化し、フ
ェノール抽出し、エタノール沈殿することによって、後
述の連結反応で使用する１８０bpの断片を作成した。
ＮdeＩ制限部位を表す。このプライマーの最初の３塩基
はクローン化したＰＮＢエステラーゼ遺伝子と合致しな
い。他方のプライマーＰＮＢ５はＡＴＧ開始部位から２
１５bp下流に位置するＡccＩ部位の下流約２５塩基対(b
p)にアニールする。上記増幅がもたらした２６１bpの断
片を、クロウ(Crowe)らが記述した方法(1991,Nuc.Acid
Res.19:184)に従い、これにわずかな変更を加えてプロ
テイナーゼＫ(トリチラチウム・アルブム由来のプロテ
アーゼ・タイプXXVIII)で処理した。次いでその断片を
標準的な方法を用いてＮdeＩおよびＡccＩで消化し、フ
ェノール抽出し、エタノール沈殿することによって、後
述の連結反応で使用する１８０bpの断片を作成した。
【００６４】ii）カルボキシ末端断片 本構築法ではアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を接
合するために上記ＯＲＦの内部にあるＡccＩ部位を使用
する必要があったので、該１.９kb断片上の他のＡccＩ
部位(ＳalＩ／ＡccＩ)を除去する必要があった。これを
次の２工程で達成した：(ｉ)ＯＲＦの断片を放出させる
ためのＨindIIIおよびＳalＩによるｐＮＢＨ３Ｓ１.９
の消化、および(ii)上記放出断片の、ＨindIIIおよびＸ
hoＩで消化したｐＢluescript ＳＫ(−)への連結。該
１.９kb断片のＳalＩ／ＡccＩ部位をｐＢluescript Ｓ
Ｋ(−)のＸhoＩ部位に挿入することによって３部位すべ
てが除去された。この連結混合物を大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５α中に導入し、推定のクローンをスクリーニングし、
制限消化によって構造を確認することによって、該ＯＲ
Ｆ上にＡccＩ部位が１つしかないｐＮＢＨ３(ＳＸ)ｓｋ
を単離した。カルボキシ末端にＢamＨＩを導入するには
もう１つの構築が必要であった。ｐＮＢＨ３(ＳＸ)ｓｋ
をＥcoＲＩおよびＫpnＩで消化してＯＲＦの断片を放出
させ、次いでこの断片を、やはりＥcoＲＩとＫpnＩで消
化したｐＵＣ１９中に連結することによって、これを達
成した。この連結混合物をＤＨ５α細胞中に導入し、次
いでクローンの選択と分析を行うことによって、該ＯＲ
Ｆ中に単一のＡccＩ部位を持ち、かつ、そのカルボキシ
末端の下流に適切に位置するＢamＨＩ部位を含有するプ
ラスミドｐＮＢＥＫｕｃを単離した。
合するために上記ＯＲＦの内部にあるＡccＩ部位を使用
する必要があったので、該１.９kb断片上の他のＡccＩ
部位(ＳalＩ／ＡccＩ)を除去する必要があった。これを
次の２工程で達成した：(ｉ)ＯＲＦの断片を放出させる
ためのＨindIIIおよびＳalＩによるｐＮＢＨ３Ｓ１.９
の消化、および(ii)上記放出断片の、ＨindIIIおよびＸ
hoＩで消化したｐＢluescript ＳＫ(−)への連結。該
１.９kb断片のＳalＩ／ＡccＩ部位をｐＢluescript Ｓ
Ｋ(−)のＸhoＩ部位に挿入することによって３部位すべ
てが除去された。この連結混合物を大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５α中に導入し、推定のクローンをスクリーニングし、
制限消化によって構造を確認することによって、該ＯＲ
Ｆ上にＡccＩ部位が１つしかないｐＮＢＨ３(ＳＸ)ｓｋ
を単離した。カルボキシ末端にＢamＨＩを導入するには
もう１つの構築が必要であった。ｐＮＢＨ３(ＳＸ)ｓｋ
をＥcoＲＩおよびＫpnＩで消化してＯＲＦの断片を放出
させ、次いでこの断片を、やはりＥcoＲＩとＫpnＩで消
化したｐＵＣ１９中に連結することによって、これを達
成した。この連結混合物をＤＨ５α細胞中に導入し、次
いでクローンの選択と分析を行うことによって、該ＯＲ
Ｆ中に単一のＡccＩ部位を持ち、かつ、そのカルボキシ
末端の下流に適切に位置するＢamＨＩ部位を含有するプ
ラスミドｐＮＢＥＫｕｃを単離した。
【００６５】 iii）ｐＨＫＹ３３８から得られるベクター断片 ｐＨＫＹ３３８をＮdeＩとＢamＨＩで消化してそのカナ
マイシン耐性遺伝子を除去し、その大制限断片をゲル単
離することによって、以下に記述する３断片連結反応用
のベクターを調製した。
マイシン耐性遺伝子を除去し、その大制限断片をゲル単
離することによって、以下に記述する３断片連結反応用
のベクターを調製した。
【００６６】ＮdeＩ-ＡccＩ消化ＰＣＲ断片(１８０b
p)、ｐＮＢＥＫｕｃのＡccＩ-ＢamＨＩ断片(１.７kb)お
よびｐＨＫＹ３３８のＮdeＩ-ＢamＨＩ断片(６kb)を用
いて、３断片連結を行った。これによって、温度誘導性
ラムダｐＬ合成プロモーターの制御下にある全ｐｎｂＡ
ＯＲＦを含有するプラスミドベクターｐＮＢ１０６Ｒ
が生成した。得られたＤＮＡを宿主株大腸菌Ｋ１２ Ｄ
Ｈ５α中に導入した。次いで、プラスミドｐＮＢ１０６
Ｒを宿主株大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ Ａ
ＴＣＣ １１１０５中に導入した。
p)、ｐＮＢＥＫｕｃのＡccＩ-ＢamＨＩ断片(１.７kb)お
よびｐＨＫＹ３３８のＮdeＩ-ＢamＨＩ断片(６kb)を用
いて、３断片連結を行った。これによって、温度誘導性
ラムダｐＬ合成プロモーターの制御下にある全ｐｎｂＡ
ＯＲＦを含有するプラスミドベクターｐＮＢ１０６Ｒ
が生成した。得られたＤＮＡを宿主株大腸菌Ｋ１２ Ｄ
Ｈ５α中に導入した。次いで、プラスミドｐＮＢ１０６
Ｒを宿主株大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ Ａ
ＴＣＣ １１１０５中に導入した。
【００６７】実施例４：プラスミドｐＮＢ１０６Ｒで形
質転換した大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ
３０８および大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ１１１０５の培養によ
るＰＮＢエステラーゼの合成 プラスミドｐＮＢ１０６Ｒで形質転換した大腸菌Ｋ１２
ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ
ＡＴＣＣ１１１０５の培養によるＰＮＢエステラーゼの
合成を以下のように誘導した。上記株の凍結保存培養を
５μg／mlテトラサイクリンの入ったＬ-ブロスに植菌し
た。３０℃で１６時間生育させた後、細胞を新鮮なＬ-
ブロス＋テトラサイクリンに継代(４％ｖ／ｖ)し、対数
増殖中期まで生育させた。培養の温度を４０℃に上げる
ことによって酵素合成の誘導を達成した。定期的に培養
から試料を採取し、無細胞抽出物中の酵素活性を実施例
１に記述したように検定することによってＰＮＢエステ
ラーゼ合成の速度を測定した。
質転換した大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ
３０８および大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ１１１０５の培養によ
るＰＮＢエステラーゼの合成 プラスミドｐＮＢ１０６Ｒで形質転換した大腸菌Ｋ１２
ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ
ＡＴＣＣ１１１０５の培養によるＰＮＢエステラーゼの
合成を以下のように誘導した。上記株の凍結保存培養を
５μg／mlテトラサイクリンの入ったＬ-ブロスに植菌し
た。３０℃で１６時間生育させた後、細胞を新鮮なＬ-
ブロス＋テトラサイクリンに継代(４％ｖ／ｖ)し、対数
増殖中期まで生育させた。培養の温度を４０℃に上げる
ことによって酵素合成の誘導を達成した。定期的に培養
から試料を採取し、無細胞抽出物中の酵素活性を実施例
１に記述したように検定することによってＰＮＢエステ
ラーゼ合成の速度を測定した。
【００６８】また、ＰＮＢエステラーゼタンパク質量の
相対的増大を監視することができるよう、無細胞抽出物
をＳＤＳ-ＰＡＧＥでも分析した。
相対的増大を監視することができるよう、無細胞抽出物
をＳＤＳ-ＰＡＧＥでも分析した。
【００６９】実施例５：ＰＮＢエステラーゼの組換え大
腸菌株からの精製 以下に記述する方法によって大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／
ｐＮＢ１０６ＲからＰＮＢエステラーゼを精製した。そ
の概略を表５に示す。この方法を、実施例１に記述し表
４に要約したバチルスからの精製と比較することができ
る。バチルスからの精製が８工程を必要とし、４１４０
０mgの粗タンパク質から４.０mgの純粋な酵素が得られ
たのに対し、組換え大腸菌株からはわずか６工程でわず
か２００mgの粗タンパク質から１０mgの純粋な酵素が得
られたことに気付くであろう。このように組換え大腸菌
を供給源として使用した場合、より簡単なこの精製工程
が、天然の生産菌バチルス・ズプチリスを酵素供給源と
して使用する、より複雑な従来の精製工程より３２５０
倍効率的であった。
腸菌株からの精製 以下に記述する方法によって大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／
ｐＮＢ１０６ＲからＰＮＢエステラーゼを精製した。そ
の概略を表５に示す。この方法を、実施例１に記述し表
４に要約したバチルスからの精製と比較することができ
る。バチルスからの精製が８工程を必要とし、４１４０
０mgの粗タンパク質から４.０mgの純粋な酵素が得られ
たのに対し、組換え大腸菌株からはわずか６工程でわず
か２００mgの粗タンパク質から１０mgの純粋な酵素が得
られたことに気付くであろう。このように組換え大腸菌
を供給源として使用した場合、より簡単なこの精製工程
が、天然の生産菌バチルス・ズプチリスを酵素供給源と
して使用する、より複雑な従来の精製工程より３２５０
倍効率的であった。
【００７０】実施例４の方法に従って生育させた大腸菌
Ｋ１２ ＤＨ５α／ｐＮＢ１０６Ｒの凍結細胞(５.４g)
を融解し、０.５mM ＥＤＴＡと１mM β-メルカプトエタ
ノールを含有する１０mMリン酸カリウム(ｐＨ７.０)(緩
衝液１)２０ml中でホモジナイズした。この細胞ホモジ
ネートの遠心分離(２８０００×ｇ，１５分)によって無
細胞抽出物を得た後、これを１０mM酢酸ナトリウム(ｐ
Ｈ５.０)５００mlに対して終夜透析した。その透析物を
２Ｎ ＮＨ4ＯＨでｐＨ７.０に調節し、硫酸アンモニウ
ム分画にかけた。４５〜８５％硫酸アンモニウム飽和度
で生成した沈殿物を１００mM ＮａＣｌの入った１０mM
トリス塩酸(ｐＨ８.５)(緩衝液２)２０mlに溶解し、こ
れを同緩衝液５００mlに対して終夜透析した。その透析
物を、緩衝液２で平衡化したＤＥ-５２カラム(１.６×
２０cm)に充填した。このカラムを１００mlの緩衝液２
および１００mM ＮａＣｌを含有する１０mM ＭＥＳ-Ｎ
ａＯＨ(ｐＨ６.５)(緩衝液３)２００mlで洗浄し、緩衝
液３中の１００mMから３００mMへの直線的ＮａＣｌ勾配
３７５mlを用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。１
８０〜２１０mM ＮａＣｌで溶出したエステラーゼ含有
分画を合し、これを限外濾過(アミコンＰＭ-３０膜)で
２０mlに濃縮し、１０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)(緩衝液
４)５００mlに対して終夜透析した。透析したエステラ
ーゼを、緩衝液４で平衡化したｐ-アミノベンズアミジ
ン-アガロースカラム(１.０×２０cm)に充填した。この
カラムを５０mlの緩衝液４で洗浄した後、緩衝液４中の
０から３００mMへの直線的ＮａＣｌ勾配１８０mlを用い
てこのカラムからエステラーゼを溶出させた。１２０〜
１５０mM ＮａＣｌで溶出したエステラーゼを集め、限
外濾過によって１５mlに濃縮し、５００mlの緩衝液２に
対して終夜透析した。その透析物を、緩衝液２で平衡化
したＱ-セファロースカラム(１.０×２０cm)に充填し
た。このカラムを５０mlの緩衝液２、５０mlの１０mM
ＭＥＳ-ＮａＯＨ(ｐＨ６.０)および１００mM ＮａＣｌ
(緩衝液５)で順次洗浄した後、緩衝液５中の１００ｍＭ
から３００ｍＭへの直線的ＮａＣｌ勾配１５０mlでこの
カラムからエステラーゼを溶出させた。１８０〜２１０
mM ＮａＣｌで溶出したエステラーゼを集め、限外濾過
によって１mlに濃縮した。得られたエステラーゼ調製物
をＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認したところ、これは電気泳動
的に純粋であった。精製データを表５に要約する。
Ｋ１２ ＤＨ５α／ｐＮＢ１０６Ｒの凍結細胞(５.４g)
を融解し、０.５mM ＥＤＴＡと１mM β-メルカプトエタ
ノールを含有する１０mMリン酸カリウム(ｐＨ７.０)(緩
衝液１)２０ml中でホモジナイズした。この細胞ホモジ
ネートの遠心分離(２８０００×ｇ，１５分)によって無
細胞抽出物を得た後、これを１０mM酢酸ナトリウム(ｐ
Ｈ５.０)５００mlに対して終夜透析した。その透析物を
２Ｎ ＮＨ4ＯＨでｐＨ７.０に調節し、硫酸アンモニウ
ム分画にかけた。４５〜８５％硫酸アンモニウム飽和度
で生成した沈殿物を１００mM ＮａＣｌの入った１０mM
トリス塩酸(ｐＨ８.５)(緩衝液２)２０mlに溶解し、こ
れを同緩衝液５００mlに対して終夜透析した。その透析
物を、緩衝液２で平衡化したＤＥ-５２カラム(１.６×
２０cm)に充填した。このカラムを１００mlの緩衝液２
および１００mM ＮａＣｌを含有する１０mM ＭＥＳ-Ｎ
ａＯＨ(ｐＨ６.５)(緩衝液３)２００mlで洗浄し、緩衝
液３中の１００mMから３００mMへの直線的ＮａＣｌ勾配
３７５mlを用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。１
８０〜２１０mM ＮａＣｌで溶出したエステラーゼ含有
分画を合し、これを限外濾過(アミコンＰＭ-３０膜)で
２０mlに濃縮し、１０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)(緩衝液
４)５００mlに対して終夜透析した。透析したエステラ
ーゼを、緩衝液４で平衡化したｐ-アミノベンズアミジ
ン-アガロースカラム(１.０×２０cm)に充填した。この
カラムを５０mlの緩衝液４で洗浄した後、緩衝液４中の
０から３００mMへの直線的ＮａＣｌ勾配１８０mlを用い
てこのカラムからエステラーゼを溶出させた。１２０〜
１５０mM ＮａＣｌで溶出したエステラーゼを集め、限
外濾過によって１５mlに濃縮し、５００mlの緩衝液２に
対して終夜透析した。その透析物を、緩衝液２で平衡化
したＱ-セファロースカラム(１.０×２０cm)に充填し
た。このカラムを５０mlの緩衝液２、５０mlの１０mM
ＭＥＳ-ＮａＯＨ(ｐＨ６.０)および１００mM ＮａＣｌ
(緩衝液５)で順次洗浄した後、緩衝液５中の１００ｍＭ
から３００ｍＭへの直線的ＮａＣｌ勾配１５０mlでこの
カラムからエステラーゼを溶出させた。１８０〜２１０
mM ＮａＣｌで溶出したエステラーゼを集め、限外濾過
によって１mlに濃縮した。得られたエステラーゼ調製物
をＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認したところ、これは電気泳動
的に純粋であった。精製データを表５に要約する。
【表５】
【００７１】組換え大腸菌を酵素供給源として用いるこ
の新しい精製法はかなり簡単であるから、大規模生産に
これを適用した場合、同じ酵素をバチルス・ズプチリス
から得るのに必要な精製法より安価であろう。これは、
組換え大腸菌株中で得られるＰＮＢエステラーゼの量が
かなり増大していることの直接的な結果である。
の新しい精製法はかなり簡単であるから、大規模生産に
これを適用した場合、同じ酵素をバチルス・ズプチリス
から得るのに必要な精製法より安価であろう。これは、
組換え大腸菌株中で得られるＰＮＢエステラーゼの量が
かなり増大していることの直接的な結果である。
【００７２】分子量、ウエスタンブロット分析および基
質特異性について、組換え大腸菌から精製したＰＮＢエ
ステラーゼを天然の酵素と比較した。分子量の測定は上
記２つの供給源から得られる酵素について５４０００の
値を与え、またこれら２つの酵素調製物を天然精製エス
テラーゼに対して調製した抗体を用いて試験したとこ
ろ、同一の沈降素バンドが得られた。両酵素はセファク
ロルＰＮＢエステル、セファクロル核ＰＮＢエステル、
ロラカルベフＰＮＢエステル、およびロラカルベフ核Ｐ
ＮＢエステルを加水分解した。天然のＰＮＢエステラー
ゼと組換え大腸菌株中で生産される対応するＰＮＢエス
テラーゼは機能的に同一であり、構造的にも巨視的には
同一物であると思われる。
質特異性について、組換え大腸菌から精製したＰＮＢエ
ステラーゼを天然の酵素と比較した。分子量の測定は上
記２つの供給源から得られる酵素について５４０００の
値を与え、またこれら２つの酵素調製物を天然精製エス
テラーゼに対して調製した抗体を用いて試験したとこ
ろ、同一の沈降素バンドが得られた。両酵素はセファク
ロルＰＮＢエステル、セファクロル核ＰＮＢエステル、
ロラカルベフＰＮＢエステル、およびロラカルベフ核Ｐ
ＮＢエステルを加水分解した。天然のＰＮＢエステラー
ゼと組換え大腸菌株中で生産される対応するＰＮＢエス
テラーゼは機能的に同一であり、構造的にも巨視的には
同一物であると思われる。
【００７３】
【００７４】配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Gly Val His 20
【００７５】配列番号：２ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジ：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Asn Ile Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp 1 5 10
【００７６】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe Gly Asn Leu Asp 1 5 10 15 Gly Leu Glu Xaa Met Ala Lys 20
【００７７】配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Gly Gln Trp Trp Phe Lys 1 5 10 15
【００７８】配列番号：５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A 41
【００７９】配列番号：６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ ６ 配列 ＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡ ＡＡＧＴＣＡＡＡＧＧ ＣＡＣ
ＡＣＡＡＧＡＡ ＡＡＴＧＧＣＧＴＣＣ Ａ ４１
ＡＣＡＡＧＡＡ ＡＡＴＧＧＣＧＴＣＣ Ａ ４１
【００８０】配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧ ＡＧＡＡＣＣＡＴＡＴ ＧＡＣ
ＴＣＡＴＣＡＡ ＡＴＡＧ ３４
ＴＣＡＴＣＡＡ ＡＴＡＧ ３４
【００８１】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TTGACATACA AGCAATCCTC 20
【図１】 ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる移動度に対するタン
パク質標品およびＰＮＢエステラーゼの分子量の片対数
プロット。
パク質標品およびＰＮＢエステラーゼの分子量の片対数
プロット。
【図２】 プラスミドｐＮＢＥ１の制限酵素部位および
機能地図。
機能地図。
【図３】 プラスミドｐＮＢ１０６Ｒの制限酵素部位お
よび機能地図。
よび機能地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 35/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (5)
- 【請求項１】 実質的に精製された形態にあるｐ-ニトロ
ベンジルエステラーゼ。 - 【請求項２】 請求項１のＰＮＢエステラーゼを実質的
に純粋な形態で調製する方法であって、次のａ）〜ｍ）
の工程を約０℃〜４℃の温度で行うことからなる方法。 ａ）ＰＮＢエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約ｐＨ７で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約４５％〜８０％飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 ｂ）約ｐＨ７に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 ｃ）その透析物を約ｐＨ５に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約ｐＨ８.５に調節する。 ｄ）該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐＨ７の緩衝液中の
０.０５Mから０.３Mへの直線的なＮａＣｌ勾配を用いて
該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出させる。 ｅ）工程ｄのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 ｆ）工程ｅの濃縮物を、還元剤の存在下で約ｐＨ８.０
の多糖型ゲルを通して濾過する。 ｇ）工程ｆのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、ｐＨ８.５に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 ｈ）工程ｇの濃縮物を約ｐＨ８.５のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐ
Ｈ６の緩衝液中の０.１Mから０.３Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いて該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出さ
せる。 ｉ）工程ｈのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ５.０に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 ｊ）上記透析物を約ｐＨ６のリン酸カルシウム-セルロ
ースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で
約ｐＨ７の０.０１Mから０.１０Mへの直線的なリン酸カ
リウム勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出
させる。 ｋ）工程ｊのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ８に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の存
在下で透析し、その透析物を集める。 ｌ）上記透析物を約ｐＨ８のｐ-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約ｐＨ８の０Mから０.３０Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出させ
る。 ｍ）工程ｌのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 - 【請求項３】 ＰＮＢエステラーゼを発現させることが
できる組換え宿主細胞から実質的に精製された形態のＰ
ＮＢエステラーゼを調製する方法であって、次の工程か
らなる方法。 ａ）ＰＮＢエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約ｐＨ７で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約４５％〜８５％飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 ｂ）約ｐＨ７に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 ｃ）その透析物を約ｐＨ５に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約ｐＨ８.５に調節する。 ｄ）該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐＨ７の緩衝液中の
０.０５Mから０.３Mへの直線的なＮａＣｌ勾配を用いて
該樹脂からＰＮＢエステラーゼを溶出させる。 ｅ）工程ｄのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 ｆ）その透析物を約ｐＨ８のｐ-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約ｐＨ８の０Mから０.３０Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼをそこから溶出させ
る。 ｇ）工程ｆのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、ｐＨ８.５に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 ｈ）工程ｇの濃縮物を約ｐＨ８.５のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約ｐ
Ｈ６の緩衝液中の０.１Mから０.３Mへの直線的なＮａＣ
ｌ勾配を用いてＰＮＢエステラーゼを該樹脂から溶出さ
せる。 ｉ）工程ｈのＰＮＢエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約ｐＨ５.０に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 - 【請求項４】 セファロスポリンＰＮＢエステルまたは
１-カルバセファロスポリンＰＮＢエステルからｐ-ニト
ロベンジル基を除去する方法であって、該エステルを請
求項１のＰＮＢエステラーゼと反応させることからなる
方法。 - 【請求項５】 該反応によってセファクロルまたはロラ
カルベフが生成する請求項４の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81138791A | 1991-12-20 | 1991-12-20 | |
| US811387 | 1991-12-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292961A true JPH05292961A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=25206399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4338706A Pending JPH05292961A (ja) | 1991-12-20 | 1992-12-18 | バチルス由来の精製パラ−ニトロベンジルエステラーゼ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0549264A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05292961A (ja) |
| KR (1) | KR930013102A (ja) |
| BR (1) | BR9205054A (ja) |
| CA (1) | CA2085803A1 (ja) |
| HU (1) | HUT69971A (ja) |
| IL (1) | IL104141A0 (ja) |
| MX (1) | MX9207384A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0551750B1 (en) * | 1991-12-20 | 1997-05-02 | Eli Lilly And Company | Recombinant DNA compounds and expression vectors encoding para-nitrobenzyl esterase activity from bacillus |
| DE102005037659A1 (de) | 2005-08-05 | 2007-02-22 | Henkel Kgaa | Verwendung von Esterasen zur Spaltung von Kunststoffen |
| EP2873736A1 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-20 | Sandoz AG | Chemoenzymatic synthesis of the cephalosporine intermediate 7-amino-3-alkenylcephem-4-carboxylic acid |
| US11103444B1 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-31 | B&R Plastics, Inc. | Teeth cleaning for animals |
Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
| US3972774A (en) * | 1975-07-28 | 1976-08-03 | Eli Lilly And Company | Enzymatic de-esterification of cephalosporin para-nitrobenzyl esters |
| US4904593A (en) * | 1986-04-22 | 1990-02-27 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Novel microorganism, a novel esterase and method for preparing the same |
| CA2018367A1 (en) * | 1989-06-12 | 1990-12-12 | Chang-An Yu | Purified enzyme and process therefor |
| EP0437378B1 (en) * | 1990-01-12 | 1999-05-19 | Glaxo Group Limited | DNA sequence for an antibiotic biosynthesis enzyme |
-
1992
- 1992-12-17 EP EP92311541A patent/EP0549264A1/en not_active Withdrawn
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- 1992-12-17 MX MX9207384A patent/MX9207384A/es unknown
- 1992-12-17 IL IL104141A patent/IL104141A0/xx unknown
- 1992-12-18 CA CA002085803A patent/CA2085803A1/en not_active Abandoned
- 1992-12-18 JP JP4338706A patent/JPH05292961A/ja active Pending
- 1992-12-18 HU HU9204038A patent/HUT69971A/hu unknown
- 1992-12-19 KR KR1019920024768A patent/KR930013102A/ko not_active Application Discontinuation
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| HUT69971A (en) | 1995-09-28 |
| MX9207384A (es) | 1993-07-01 |
| KR930013102A (ko) | 1993-07-21 |
| HU9204038D0 (en) | 1993-04-28 |
| EP0549264A1 (en) | 1993-06-30 |
| IL104141A0 (en) | 1993-05-13 |
| BR9205054A (pt) | 1993-06-22 |
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