JPH05292961A - バチルス由来の精製パラ−ニトロベンジルエステラーゼ - Google Patents
バチルス由来の精製パラ−ニトロベンジルエステラーゼInfo
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- JPH05292961A JPH05292961A JP4338706A JP33870692A JPH05292961A JP H05292961 A JPH05292961 A JP H05292961A JP 4338706 A JP4338706 A JP 4338706A JP 33870692 A JP33870692 A JP 33870692A JP H05292961 A JPH05292961 A JP H05292961A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 バチルス属由来の精製パラ-ニトロベンジル
エステラーゼ(PNBエステラーゼ)とその精製法を提供
する。 【効果】 本発明のPNBエステラーゼはセファロスポ
リン化合物および1-カルバセファロスポリン化合物の
PNBエステルを脱エステル化して対応する遊離酸に変
換する反応を触媒する。
エステラーゼ(PNBエステラーゼ)とその精製法を提供
する。 【効果】 本発明のPNBエステラーゼはセファロスポ
リン化合物および1-カルバセファロスポリン化合物の
PNBエステルを脱エステル化して対応する遊離酸に変
換する反応を触媒する。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は酵素技術の分野に関す
る。具体的には、本発明は、バチルス属由来の酵素p-
ニトロベンジルエステラーゼ(PNBエステラーゼ)およ
びこの酵素を精製型として調製する方法に関する。
る。具体的には、本発明は、バチルス属由来の酵素p-
ニトロベンジルエステラーゼ(PNBエステラーゼ)およ
びこの酵素を精製型として調製する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】セファロスポリンおよび1-カルバセフ
ァロスポリンのエステルはこれら抗生物質の遊離酸型の
合成に際して中間体として一般に使用されている。セフ
ァロスポリン類の製造についてはシャウベット(Chauvet
te),米国特許第4064343号によって広く教示され
ている。1−カルバセファロスポリン類の製造について
はクリステンセン(Christensen)ら,米国特許第4226
866号、ムンロー(Munroe),米国特許第479110
6号、およびヒラタ(Hirata)ら,米国特許第47089
56号によって広く教示されている。
ァロスポリンのエステルはこれら抗生物質の遊離酸型の
合成に際して中間体として一般に使用されている。セフ
ァロスポリン類の製造についてはシャウベット(Chauvet
te),米国特許第4064343号によって広く教示され
ている。1−カルバセファロスポリン類の製造について
はクリステンセン(Christensen)ら,米国特許第4226
866号、ムンロー(Munroe),米国特許第479110
6号、およびヒラタ(Hirata)ら,米国特許第47089
56号によって広く教示されている。
【0003】PNBエステル官能基は、セファロスポリ
ンおよび1−カルバセファロスポリンの酸性カルボン酸
官能基を、その分子の他の部位での反応を行う間、遮断
または保護するために一般に使用されている。例えばガ
ルブレヒト(Garbrecht),米国特許第3632850号
は、セファレキシン合成におけるp-ニトロベンジルエ
ステル基の使用について記述している。この合成の第1
段階では、このエステルを酸性条件下での水素化分解に
よって切断する。米国特許第3781282号において
ガルブレヒトは、ジメチルホルムアミドなどのアミド型
溶媒中の亜鉛および酸によるセファロスポリンのp-ニ
トロベンジルエステルの脱エステル化について記述して
いる。ジャクソン(Jackson),米国特許第3799924
号は、約7以上のpHにおいて亜ジチオン酸ナトリウム
または亜ジチオン酸カリウムで処理することによるセフ
ァロスポリンエステルのp-ニトロベンジルエステル基
の除去について記述している。ハットフィールド(Hatfi
eld),米国特許第4091214号は、亜鉛とα-ヒドロ
キシカルボン酸を含有する不活性溶媒を用いて還元的に
切断することからなるセファロスポリン化合物のエステ
ルの脱エステル化法について記述している。ヒラタら,
米国特許第4708956号は、1-カルボセファロス
ポリン化合物からパラ-ニトロベンジル保護基を除去す
る方法について記述している。これらの脱エステル化法
には、溶媒の再利用コストが高いこと並びに有機溶媒が
汚染を引き起こすという潜在的な問題が伴う。
ンおよび1−カルバセファロスポリンの酸性カルボン酸
官能基を、その分子の他の部位での反応を行う間、遮断
または保護するために一般に使用されている。例えばガ
ルブレヒト(Garbrecht),米国特許第3632850号
は、セファレキシン合成におけるp-ニトロベンジルエ
ステル基の使用について記述している。この合成の第1
段階では、このエステルを酸性条件下での水素化分解に
よって切断する。米国特許第3781282号において
ガルブレヒトは、ジメチルホルムアミドなどのアミド型
溶媒中の亜鉛および酸によるセファロスポリンのp-ニ
トロベンジルエステルの脱エステル化について記述して
いる。ジャクソン(Jackson),米国特許第3799924
号は、約7以上のpHにおいて亜ジチオン酸ナトリウム
または亜ジチオン酸カリウムで処理することによるセフ
ァロスポリンエステルのp-ニトロベンジルエステル基
の除去について記述している。ハットフィールド(Hatfi
eld),米国特許第4091214号は、亜鉛とα-ヒドロ
キシカルボン酸を含有する不活性溶媒を用いて還元的に
切断することからなるセファロスポリン化合物のエステ
ルの脱エステル化法について記述している。ヒラタら,
米国特許第4708956号は、1-カルボセファロス
ポリン化合物からパラ-ニトロベンジル保護基を除去す
る方法について記述している。これらの脱エステル化法
には、溶媒の再利用コストが高いこと並びに有機溶媒が
汚染を引き起こすという潜在的な問題が伴う。
【0004】上記方法の代替法である、セファロスポリ
ンおよびカルバセファロスポリン抗生物質の合成におい
て使用されるPNB遮断基を除去するための酵素法には
明瞭な利点があろう。温和な条件下で進行するこのよう
な反応は有機溶媒と金属触媒を使用することなく水性反
応混合物中で完結し得る。ブラノン(Brannon),米国特許
第3972774号は、セファロスポリンエステルをバ
チルス属の微生物から得られる粗調製物と反応させるこ
とからなる、セファロスポリンエステルからのPNBエ
ステルの除去法について記述している。しかし、この切
断に寄与する酵素は単離されておらず、またその切断が
単一の酵素によって起こるのかどうかも決定されなかっ
た。
ンおよびカルバセファロスポリン抗生物質の合成におい
て使用されるPNB遮断基を除去するための酵素法には
明瞭な利点があろう。温和な条件下で進行するこのよう
な反応は有機溶媒と金属触媒を使用することなく水性反
応混合物中で完結し得る。ブラノン(Brannon),米国特許
第3972774号は、セファロスポリンエステルをバ
チルス属の微生物から得られる粗調製物と反応させるこ
とからなる、セファロスポリンエステルからのPNBエ
ステルの除去法について記述している。しかし、この切
断に寄与する酵素は単離されておらず、またその切断が
単一の酵素によって起こるのかどうかも決定されなかっ
た。
【0005】セファロスポリンおよび1-カルバセファ
ロスポリンのp-ニトロベンジルエステルはこれら抗生
物質の遊離酸型の合成において重要であるから、このエ
ステル基の改善された除去法は常に研究の対象となって
いる。
ロスポリンのp-ニトロベンジルエステルはこれら抗生
物質の遊離酸型の合成において重要であるから、このエ
ステル基の改善された除去法は常に研究の対象となって
いる。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明はバチルス属の
微生物由来の精製PNBエステラーゼを提供する。本酵
素は約54000ダルトンの分子量を有する単量体であ
る。このPNBエステラーゼは、セファロスポリン化合
物および1-カルバセファロスポリン化合物のPNBエ
ステルの対応する遊離酸型への脱エステル化を触媒す
る。また本発明はバチルス種から本酵素を精製する方法
をも提供する。この方法は硫酸アンモニウム分画、pH
処理、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸
着-脱着クロマトグラフィー、およびアフィニティーク
ロマトグラフィーの組合わせからなる。
微生物由来の精製PNBエステラーゼを提供する。本酵
素は約54000ダルトンの分子量を有する単量体であ
る。このPNBエステラーゼは、セファロスポリン化合
物および1-カルバセファロスポリン化合物のPNBエ
ステルの対応する遊離酸型への脱エステル化を触媒す
る。また本発明はバチルス種から本酵素を精製する方法
をも提供する。この方法は硫酸アンモニウム分画、pH
処理、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸
着-脱着クロマトグラフィー、およびアフィニティーク
ロマトグラフィーの組合わせからなる。
【0007】
【課題を解決する方法】本発明はバチルス属の微生物由
来の酵素PNBエステラーゼを実質的に精製された形態
で提供する。本明細書で使用する場合、実質的に精製さ
れた形態とはバチルス細胞抽出物より10倍以上高い比
活性を意味する。さらに本発明は、セファロスポリンま
たは1-カルバセファロスポリンの遊離酸型をそのPN
Bエステル型から製造する方法において有用な精製酵素
の単離法をも提供する。本酵素は、SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって決定
した場合約54000ダルトンの分子量を有する単量体
型タンパク質である。本酵素のアミノ酸組成を表1に示
す。このアミノ酸組成は、後述のように高性能液体クロ
マトグラフィー並びに従来法によって決定した。本発明
が提供するPNBエステラーゼは約4〜50℃および約
5.5〜8.5のpHで安定である。
来の酵素PNBエステラーゼを実質的に精製された形態
で提供する。本明細書で使用する場合、実質的に精製さ
れた形態とはバチルス細胞抽出物より10倍以上高い比
活性を意味する。さらに本発明は、セファロスポリンま
たは1-カルバセファロスポリンの遊離酸型をそのPN
Bエステル型から製造する方法において有用な精製酵素
の単離法をも提供する。本酵素は、SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって決定
した場合約54000ダルトンの分子量を有する単量体
型タンパク質である。本酵素のアミノ酸組成を表1に示
す。このアミノ酸組成は、後述のように高性能液体クロ
マトグラフィー並びに従来法によって決定した。本発明
が提供するPNBエステラーゼは約4〜50℃および約
5.5〜8.5のpHで安定である。
【表1】
【0008】また本発明は、セファロスポリンエステル
および1-カルバセファロスポリンエステルからp-ニト
ロベンジル基を除去して対応するセファロスポリン酸お
よび1-カルバセファロスポリン酸を製造するための酵
素的切断法をも提供する。この方法は、セファロスポリ
ンエステルまたは1-カルバセファロスポリンエステル
を好ましくは水性媒質中25〜40℃で本発明の実質的
に精製されたPNBエステラーゼと反応させ、得られる
セファロスポリン酸または1-カルバセファロスポリン
酸を回収することからなる。
および1-カルバセファロスポリンエステルからp-ニト
ロベンジル基を除去して対応するセファロスポリン酸お
よび1-カルバセファロスポリン酸を製造するための酵
素的切断法をも提供する。この方法は、セファロスポリ
ンエステルまたは1-カルバセファロスポリンエステル
を好ましくは水性媒質中25〜40℃で本発明の実質的
に精製されたPNBエステラーゼと反応させ、得られる
セファロスポリン酸または1-カルバセファロスポリン
酸を回収することからなる。
【0009】本方法は、セファクロルおよびロラカルベ
フを製造するにあたって、その合成中これらの抗生物質
の4-カルボキシル基がパラ-ニトロベンジル基で保護さ
れている場合にとりわけ価値がある。
フを製造するにあたって、その合成中これらの抗生物質
の4-カルボキシル基がパラ-ニトロベンジル基で保護さ
れている場合にとりわけ価値がある。
【0010】ロラカルベフ核遊離酸は、フェニルグリシ
ンメチルエステルがこの化合物と反応してロラカルベフ
とメタノールを生成する反応において、ペニシリンGア
ミダーゼの基質である。同様に、ペニシリンGアミダー
ゼは、セファクロル核遊離酸またはセファレキシン核遊
離酸がフェニルグリシンメチルエステルと反応してセフ
ァクロルまたはセファレキシンとメタノールを与える変
換を触媒する。
ンメチルエステルがこの化合物と反応してロラカルベフ
とメタノールを生成する反応において、ペニシリンGア
ミダーゼの基質である。同様に、ペニシリンGアミダー
ゼは、セファクロル核遊離酸またはセファレキシン核遊
離酸がフェニルグリシンメチルエステルと反応してセフ
ァクロルまたはセファレキシンとメタノールを与える変
換を触媒する。
【0011】PNBエステラーゼのアミノ末端22残基
のアミノ酸配列を気相シークエンサーを伴う自動エドマ
ン分解によって決定した。得られた配列は次の通りであ
る:Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Ly
s Val Lys Gly Thr Thr GluAsn Gly Val His(配列番号
1)。
のアミノ酸配列を気相シークエンサーを伴う自動エドマ
ン分解によって決定した。得られた配列は次の通りであ
る:Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Ly
s Val Lys Gly Thr Thr GluAsn Gly Val His(配列番号
1)。
【0012】プロテアーゼで消化したPNBエステラー
ゼから次の内部アミノ酸配列が得られた:Glu Asn Ile
Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp(配列番号
2);Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe G
ly Asn Leu Asp Gly Leu GluXaa Met Ala Lys(配列番
号3);Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Gly Gln
Trp Trp Phe Lys(配列番号4)。
ゼから次の内部アミノ酸配列が得られた:Glu Asn Ile
Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp(配列番号
2);Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe G
ly Asn Leu Asp Gly Leu GluXaa Met Ala Lys(配列番
号3);Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Gly Gln
Trp Trp Phe Lys(配列番号4)。
【0013】後述の実施例1Dの方法に従って、他の酵
素の阻害剤として知られている種々の化合物がPNBエ
ステラーゼのPNBエステラーゼ活性に与える効果を測
定した。その結果を表2に示す。PNBエステラーゼ活
性は3つのセリン特異的化合物(フッ化フェニルメチル
スルホニル、p-ニトロフェニルリン酸ジエチルおよび
フルオロリン酸ジイソプロピル)と1つのヒスチジン特
異的化合物(ピロ炭酸ジエチル)によって強く阻害され
る。本酵素はアルギニン特異的化合物(フェニルグリオ
キサール)、カルボキシル指向性化合物(ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド)および2つのスルフヒドリル指向性
化合物[5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)および
塩化水銀]によって中程度に阻害された。PNBエステ
ラーゼはトリプシンの基質であるN-ベンゾイルフェニ
ルアラニンナプチルアミドによって中程度に阻害され
た。
素の阻害剤として知られている種々の化合物がPNBエ
ステラーゼのPNBエステラーゼ活性に与える効果を測
定した。その結果を表2に示す。PNBエステラーゼ活
性は3つのセリン特異的化合物(フッ化フェニルメチル
スルホニル、p-ニトロフェニルリン酸ジエチルおよび
フルオロリン酸ジイソプロピル)と1つのヒスチジン特
異的化合物(ピロ炭酸ジエチル)によって強く阻害され
る。本酵素はアルギニン特異的化合物(フェニルグリオ
キサール)、カルボキシル指向性化合物(ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド)および2つのスルフヒドリル指向性
化合物[5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)および
塩化水銀]によって中程度に阻害された。PNBエステ
ラーゼはトリプシンの基質であるN-ベンゾイルフェニ
ルアラニンナプチルアミドによって中程度に阻害され
た。
【表2】 PNBエステラーゼに対する阻害剤の効果 化合物(1mM) 阻害率(%) 無添加 0 フッ化フェニルメチルスルホニル 100 p-ニトロフェニルリン酸ジエチル 100 フルオロリン酸ジイソプロピル 100 ピロ炭酸ジエチル 100 ジシクロヘキシルカルボジイミド 78 フェニルグリオキサール 91 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) 69 N-ベンゾイルフェニルアラニンナプチルアミド 66 HgCl2 100 FeSO4 100 Zn(OCOCH3)2 97 2-メルカプトエタノール 0 EDTA 0
【0014】表3にPNBエステラーゼの基質特異性を
示す。
示す。
【表3】 PNBエステラーゼの基質特異性 基質 濃度 相対活性 Km Vmax (nM) (%) (mM) (単位/mg) ロラカルベフ-PNB 0.5 100 1.1 12.8 (オキサレート) ロラカルベフ-PNB 0.5 41 1.0 4.4 (トシレート) ロラカルベフ核-PNB 1.0 52 1.1 6.8 0.5 35 セファクロル核-PNB 0.5 16 1.1 2.0 セファレキシン-PNB 0.5 12 1.3 1.7 (トシレート) 酢酸p-ニトロフェニル 1.6 6300 0.56 381.7 酢酸p-ニトロベンジル 5.0 268 酢酸ベンジル 2.0 57 酢酸α-ナフチル 2.0 57 N-ベンゾイル-DL- 0.5 43 フェニルアラニン-β-ナプチルエステル
【0015】本発明が提供する酵素はバチルス属の微生
物から得ることができる。これらの生物の多くは公知で
あり、入手可能である。これらの生物には例えばバチル
ス・ズプチリス(枯草菌)NRRL B558、バチルス
・シルクロンスATCC 966、バチルス・セレウス
NRRL B569、バチルス・リシェホルミスATC
C 7072、バチルス・セレウスATCC 9634、
バチルス・ズプチリスNRRL 1471、バチルス・
ズプチリスNRRL B-8097およびバチルス・ズプ
チリスATCC 6633などが含まれる。PNBエス
テラーゼを単離する際の供給源として使用した特定の生
物はバチルス・ズプチリスNRRL B-8097であ
る。この微生物の培養はノーザン・リジョナル・リサー
チ・ラボラトリー(米国農務省、イリノイ州61604
ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号B-
8097の下で入手することができる。
物から得ることができる。これらの生物の多くは公知で
あり、入手可能である。これらの生物には例えばバチル
ス・ズプチリス(枯草菌)NRRL B558、バチルス
・シルクロンスATCC 966、バチルス・セレウス
NRRL B569、バチルス・リシェホルミスATC
C 7072、バチルス・セレウスATCC 9634、
バチルス・ズプチリスNRRL 1471、バチルス・
ズプチリスNRRL B-8097およびバチルス・ズプ
チリスATCC 6633などが含まれる。PNBエス
テラーゼを単離する際の供給源として使用した特定の生
物はバチルス・ズプチリスNRRL B-8097であ
る。この微生物の培養はノーザン・リジョナル・リサー
チ・ラボラトリー(米国農務省、イリノイ州61604
ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号B-
8097の下で入手することができる。
【0016】後述するPNBエステラーゼ精製法は、本
酵素を様々な濃度で含有するバチルス属の生物に適用す
ることができる。本酵素が妥当な量で存在するのであれ
ば、出発微生物中の酵素量は制約とならない。
酵素を様々な濃度で含有するバチルス属の生物に適用す
ることができる。本酵素が妥当な量で存在するのであれ
ば、出発微生物中の酵素量は制約とならない。
【0017】上記生産生物の細胞を培養培地から従来法
で収集することによって、その全細胞から粗酵素調製物
が得られる。この細胞を緩衝液A[10mMリン酸カリウ
ム(pH7.0)、1mM 2-メルカプトエタノール(2-M
E)、0.5mM EDTA]に懸濁する。その懸濁液を0℃
で超音波処理し、遠心分離し、無細胞抽出物を集める。
で収集することによって、その全細胞から粗酵素調製物
が得られる。この細胞を緩衝液A[10mMリン酸カリウ
ム(pH7.0)、1mM 2-メルカプトエタノール(2-M
E)、0.5mM EDTA]に懸濁する。その懸濁液を0℃
で超音波処理し、遠心分離し、無細胞抽出物を集める。
【0018】実質的に純粋なPNBエステラーゼの調製
法は次の工程からなる。 a)PNBエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約pH7で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約45%〜80%飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 b)約pH7に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 c)その透析物を約pH5に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約pH8.5に調節する。 d)該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約pH7の緩衝液中の
0.05Mから0.3Mへの直線的なNaCl勾配を用いて
該樹脂からPNBエステラーゼを溶出させる。 e)工程dのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 f)工程eの濃縮物を、還元剤の存在下で約pH8.0
の多糖型ゲルを通して濾過する。 g)工程fのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、pH8.5に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 h)工程gの濃縮物を約pH8.5のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約p
H6の緩衝液中の0.1Mから0.3Mへの直線的なNaC
l勾配を用いて該樹脂からPNBエステラーゼを溶出さ
せる。 i)工程hのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH5.0に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 j)上記透析物を約pH6のリン酸カルシウム-セルロ
ースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で
約pH7の0.01Mから0.10Mへの直線的なリン酸カ
リウム勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出
させる。 k)工程jのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH8に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の存
在下で透析し、その透析物を集める。 l)上記透析物を約pH8のp-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約pH8の0Mから0.30Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出させ
る。 m)工程lのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 この際、上記a〜mの工程を約0℃〜4℃の温度で行
う。
法は次の工程からなる。 a)PNBエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約pH7で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約45%〜80%飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 b)約pH7に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 c)その透析物を約pH5に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約pH8.5に調節する。 d)該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約pH7の緩衝液中の
0.05Mから0.3Mへの直線的なNaCl勾配を用いて
該樹脂からPNBエステラーゼを溶出させる。 e)工程dのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 f)工程eの濃縮物を、還元剤の存在下で約pH8.0
の多糖型ゲルを通して濾過する。 g)工程fのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、pH8.5に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 h)工程gの濃縮物を約pH8.5のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約p
H6の緩衝液中の0.1Mから0.3Mへの直線的なNaC
l勾配を用いて該樹脂からPNBエステラーゼを溶出さ
せる。 i)工程hのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH5.0に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 j)上記透析物を約pH6のリン酸カルシウム-セルロ
ースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で
約pH7の0.01Mから0.10Mへの直線的なリン酸カ
リウム勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出
させる。 k)工程jのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH8に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の存
在下で透析し、その透析物を集める。 l)上記透析物を約pH8のp-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約pH8の0Mから0.30Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出させ
る。 m)工程lのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 この際、上記a〜mの工程を約0℃〜4℃の温度で行
う。
【0019】本方法の鍵となる特徴は、PNBエステラ
ーゼの活性を維持しつつこの酵素の他のタンパク質から
の分離を可能にする一連の緩衝液とクロマトグラフィー
用樹脂の使用にある。
ーゼの活性を維持しつつこの酵素の他のタンパク質から
の分離を可能にする一連の緩衝液とクロマトグラフィー
用樹脂の使用にある。
【0020】上記精製法では、2-ME以外の還元剤も
緩衝液中で使用することができる。例えばジチオスレイ
トール、N-アセチル-L-システイン、および類似のス
ルフヒドリル試薬を使用することができる。2-MEが
好ましい。
緩衝液中で使用することができる。例えばジチオスレイ
トール、N-アセチル-L-システイン、および類似のス
ルフヒドリル試薬を使用することができる。2-MEが
好ましい。
【0021】本法の以降の工程のためにクロマトグラフ
ィー溶出液の体積を減じるべく、溶出液の限外濾過を従
来法で行う。
ィー溶出液の体積を減じるべく、溶出液の限外濾過を従
来法で行う。
【0022】本明細書に記載するPNBエステラーゼの
アミノ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列は、P
NBエステラーゼをコード化する遺伝子のクローニング
にとって有用である。組換えDNA技術を用いるPNB
エステラーゼ遺伝子のクローニングと発現は、より多量
の本酵素を提供する潜在能力を有する。
アミノ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列は、P
NBエステラーゼをコード化する遺伝子のクローニング
にとって有用である。組換えDNA技術を用いるPNB
エステラーゼ遺伝子のクローニングと発現は、より多量
の本酵素を提供する潜在能力を有する。
【0023】本発明は、PNBエステラーゼを発現する
ことができる組換え宿主細胞から実質的に精製された形
態のPNBエステラーゼを調製する方法であって、次の
工程からなる方法を提供する。 a)PNBエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約pH7で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約45%〜85%飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 b)約pH7に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 c)その透析物を約pH5に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約pH8.5に調節する。 d)該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約pH7の緩衝液中の
0.05Mから0.3Mへの直線的なNaCl勾配を用いて
該樹脂からPNBエステラーゼを溶出させる。 e)工程dのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 f)その透析物を約pH8のp-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約pH8の0Mから0.30Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出させ
る。 g)工程fのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、pH8.5に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 h)工程gの濃縮物を約pH8.5のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約p
H6の緩衝液中の0.1Mから0.3Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼを該樹脂から溶出さ
せる。 i)工程hのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH5.0に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。この際、上記
a〜iの工程を約0℃〜4℃の温度で行う。
ことができる組換え宿主細胞から実質的に精製された形
態のPNBエステラーゼを調製する方法であって、次の
工程からなる方法を提供する。 a)PNBエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約pH7で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約45%〜85%飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 b)約pH7に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 c)その透析物を約pH5に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約pH8.5に調節する。 d)該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約pH7の緩衝液中の
0.05Mから0.3Mへの直線的なNaCl勾配を用いて
該樹脂からPNBエステラーゼを溶出させる。 e)工程dのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 f)その透析物を約pH8のp-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約pH8の0Mから0.30Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出させ
る。 g)工程fのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、pH8.5に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 h)工程gの濃縮物を約pH8.5のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約p
H6の緩衝液中の0.1Mから0.3Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼを該樹脂から溶出さ
せる。 i)工程hのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH5.0に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。この際、上記
a〜iの工程を約0℃〜4℃の温度で行う。
【0024】本発明のさらなる理解を助けるべく以下に
実施例を記載する。使用した特定の材料、種および条件
は本発明をさらに例示するためのものであって、本発明
の妥当な範囲を制限しようとするものではない。
実施例を記載する。使用した特定の材料、種および条件
は本発明をさらに例示するためのものであって、本発明
の妥当な範囲を制限しようとするものではない。
【0025】実施例1:バチルス・ズプチリスからのP
NBエステラーゼの単離と精製 A.無細胞抽出物の調製 バチルス・ズプチリスNRRL B-8079の培養を従
来法で収集し、凍結した。凍結バチルス・ズプチリス
(760g)を融解し、2リットルの緩衝液A中でホモジ
ナイズ(均質化)した。24000×gで30分間遠心分
離することにより無細胞抽出物を得た。この抽出物に最
終濃度2.0mg/mlで硫酸プロタミンを加え、その混合
物を1時間撹拌した。生成した沈殿を遠心分離によって
除去した。以下の単離操作ではその上清を無細胞抽出物
として使用した。
NBエステラーゼの単離と精製 A.無細胞抽出物の調製 バチルス・ズプチリスNRRL B-8079の培養を従
来法で収集し、凍結した。凍結バチルス・ズプチリス
(760g)を融解し、2リットルの緩衝液A中でホモジ
ナイズ(均質化)した。24000×gで30分間遠心分
離することにより無細胞抽出物を得た。この抽出物に最
終濃度2.0mg/mlで硫酸プロタミンを加え、その混合
物を1時間撹拌した。生成した沈殿を遠心分離によって
除去した。以下の単離操作ではその上清を無細胞抽出物
として使用した。
【0026】B.粗PNBエステラーゼの単離 上記抽出物の硫酸アンモニウム分画を行った。45〜8
0%硫酸アンモニウム飽和度で生成した沈殿を遠心分離
によって集め、緩衝液Aに溶解した後、同緩衝液に対し
て終夜透析した。透析した試料を1N酢酸でpH5.0
に酸性化し、10分間インキュベートし、これを遠心分
離にかけることによって沈殿物を除去した。その上清に
は粗PNBエステラーゼが含まれていた。
0%硫酸アンモニウム飽和度で生成した沈殿を遠心分離
によって集め、緩衝液Aに溶解した後、同緩衝液に対し
て終夜透析した。透析した試料を1N酢酸でpH5.0
に酸性化し、10分間インキュベートし、これを遠心分
離にかけることによって沈殿物を除去した。その上清に
は粗PNBエステラーゼが含まれていた。
【0027】C.PNBエステラーゼの精製 上記上清を2N NH4OHでpH8.5に調節し、緩衝
液B[10mM トリス塩酸(pH8.5)、50mM NaC
l、1mM 2-ME、0.5mM EDTA]で平衡化した弱
アニオン性樹脂[DE52カラム、3.7×35cm、ファ
ルマシア,インコーポレイテッド製(ニュージャージー州
08854ピスカタウェイ)]に充填した。このカラムを
350mlの緩衝液Bで洗浄し、1750mlの緩衝液C
[10mMトリス塩酸(pH7.0)、50mM NaCl、1m
M 2-ME、0.5mM EDTA]で再度洗浄した。緩衝液
C中のNaCl勾配(50〜300mM、3500ml)を用
いてPNBエステラーゼを溶出させた。PNBエステラ
ーゼの分画を合し、アミコンPM-10膜[アミコン製
(マサチューセッツ州01923ダンバース)]での限外
濾過によって濃縮した。濃縮した粗PNBエステラーゼ
溶液を、緩衝液D[10mMトリス塩酸(pH8.0)、1mM
2-ME、0.5mM EDTA]で平衡化した多糖型ゲル
(セファクリルS-200HRカラム、5.0×95cm、
ファルマシア,インコーポレイテッド製)を用いるゲル濾
過にかけた。酵素活性を含有する分画を合わせ、限外濾
過によって濃縮し、緩衝液Bに対して終夜透析した。透
析した溶液を、緩衝液Bで平衡化したアニオン交換樹脂
(Q-セファロースカラム、2.6×20cm、ファルマシ
ア,インコーポレイテッド製)に充填した。このカラムを
100mlの緩衝液Bで洗浄し、次いで500mlの緩衝液
E[10mM MES-NaOH(pH6.0)、100mM N
aCl、1mM 2-ME、0.5mM EDTA]で洗浄し
た。緩衝液E中の直線的NaCl勾配(100〜300m
M、1500ml)を用いてPNBエステラーゼを溶出させ
た。PNBエステラーゼを含有する分画を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、1mM 2-MEと0.5mMエチレン
ジアミンテトラ酢酸を含む10mM 酢酸ナトリウム(pH
5.0)に対して終夜透析した。
液B[10mM トリス塩酸(pH8.5)、50mM NaC
l、1mM 2-ME、0.5mM EDTA]で平衡化した弱
アニオン性樹脂[DE52カラム、3.7×35cm、ファ
ルマシア,インコーポレイテッド製(ニュージャージー州
08854ピスカタウェイ)]に充填した。このカラムを
350mlの緩衝液Bで洗浄し、1750mlの緩衝液C
[10mMトリス塩酸(pH7.0)、50mM NaCl、1m
M 2-ME、0.5mM EDTA]で再度洗浄した。緩衝液
C中のNaCl勾配(50〜300mM、3500ml)を用
いてPNBエステラーゼを溶出させた。PNBエステラ
ーゼの分画を合し、アミコンPM-10膜[アミコン製
(マサチューセッツ州01923ダンバース)]での限外
濾過によって濃縮した。濃縮した粗PNBエステラーゼ
溶液を、緩衝液D[10mMトリス塩酸(pH8.0)、1mM
2-ME、0.5mM EDTA]で平衡化した多糖型ゲル
(セファクリルS-200HRカラム、5.0×95cm、
ファルマシア,インコーポレイテッド製)を用いるゲル濾
過にかけた。酵素活性を含有する分画を合わせ、限外濾
過によって濃縮し、緩衝液Bに対して終夜透析した。透
析した溶液を、緩衝液Bで平衡化したアニオン交換樹脂
(Q-セファロースカラム、2.6×20cm、ファルマシ
ア,インコーポレイテッド製)に充填した。このカラムを
100mlの緩衝液Bで洗浄し、次いで500mlの緩衝液
E[10mM MES-NaOH(pH6.0)、100mM N
aCl、1mM 2-ME、0.5mM EDTA]で洗浄し
た。緩衝液E中の直線的NaCl勾配(100〜300m
M、1500ml)を用いてPNBエステラーゼを溶出させ
た。PNBエステラーゼを含有する分画を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、1mM 2-MEと0.5mMエチレン
ジアミンテトラ酢酸を含む10mM 酢酸ナトリウム(pH
5.0)に対して終夜透析した。
【0028】沈殿物を遠心分離によって除去した後、そ
の酵素溶液を、1mM 2-MEと0.5mM EDTAを含む
10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で平衡化したリン酸
カルシウム-セルロールカラム(1.6×20cm)に充填し
た。ここで使用する細かく粉砕されたリン酸カルシウム
はイェナー(Jenner),米国特許第3737516号に従
って調製することができる。このカラムを250mlの同
緩衝液で洗浄した後、1mM 2-MEと0.5mM EDTA
を含む10〜50mMの直線的リン酸カリウム(pH7.
0)勾配(250ml)を用いてPNBエステラーゼを溶出
させた。PNBエステラーゼ活性を含有する分画を合
し、限外濾過によって濃縮した後、緩衝液Dに対して終
夜透析した。
の酵素溶液を、1mM 2-MEと0.5mM EDTAを含む
10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で平衡化したリン酸
カルシウム-セルロールカラム(1.6×20cm)に充填し
た。ここで使用する細かく粉砕されたリン酸カルシウム
はイェナー(Jenner),米国特許第3737516号に従
って調製することができる。このカラムを250mlの同
緩衝液で洗浄した後、1mM 2-MEと0.5mM EDTA
を含む10〜50mMの直線的リン酸カリウム(pH7.
0)勾配(250ml)を用いてPNBエステラーゼを溶出
させた。PNBエステラーゼ活性を含有する分画を合
し、限外濾過によって濃縮した後、緩衝液Dに対して終
夜透析した。
【0029】透析した酵素溶液を、緩衝液Dで平衡化し
たp-アミノベンズアミジン-アガロースカラム(1.0×
20cm、ファルマシア,インコーポレイテッド製)に充填
した。このカラムを50mlの緩衝液Dで洗浄した後、緩
衝液D中の直線的NaCl勾配(0〜300mM、100m
l)を用いてPNBエステラーゼを溶出させた。緩衝液D
中のほぼ160〜220mM NaClで溶出したPNB
エステラーゼ活性を伴う分画を合し、限外濾過によって
濃縮したところ、これは精製酵素であった。
たp-アミノベンズアミジン-アガロースカラム(1.0×
20cm、ファルマシア,インコーポレイテッド製)に充填
した。このカラムを50mlの緩衝液Dで洗浄した後、緩
衝液D中の直線的NaCl勾配(0〜300mM、100m
l)を用いてPNBエステラーゼを溶出させた。緩衝液D
中のほぼ160〜220mM NaClで溶出したPNB
エステラーゼ活性を伴う分画を合し、限外濾過によって
濃縮したところ、これは精製酵素であった。
【0030】上述の精製におけるすべての工程を0〜4
℃の温度で行った。この単離および精製の各工程で得ら
れたPNBエステラーゼ活性について試料を検定するこ
とにより、精製の進行を追跡した。表4は各工程後に得
られた結果を表す。
℃の温度で行った。この単離および精製の各工程で得ら
れたPNBエステラーゼ活性について試料を検定するこ
とにより、精製の進行を追跡した。表4は各工程後に得
られた結果を表す。
【表4】 バチルス・ズプチリス培養基からのPNBエステラーゼの精製 ロラカルベフ セファレキシン 工程 タンパク質1 活性 比活性 活性 比活性 (mg) (U) (U/mg) (U) (U/mg) 無細胞抽出物 41400 95.2 2.3 9.81 0.24 45-80%AmSO4分画 18400 49.6 2.7 5.64 0.31 pH処理 11000 44.2 4.0 5.18 0.47 DE52溶出液 2300 52.0 22.6 6.15 2.67 セファクリルS-200溶出液 985 47.5 48.2 5.98 6.07 Q-セファロース溶出液 16 20.5 1280 1.72 108リン 酸カルシウム-セルロース溶出液 6.9 11.7 1690 1.04 150 p-アミノヘ゛ンス゛アミシ゛ン- 4.0 8.0 2030 0.87 220 アカ゛ロース溶出液 1 総タンパク質量はローリー(Lowery,O.H.)らの方法[J.
Biol.Chem.193:265(1951)]で決定した。
Biol.Chem.193:265(1951)]で決定した。
【0031】D.PNBエステラーゼ活性の検定法 5μmolのビストリスプロパン塩酸(pH6.5)、0.5
μmolの基質(ロラカルベフPNBエステルまたはセファ
クロルPNBエステル)および適量の酵素溶液を含有す
る1mlの反応混合物を恒温振盪機中37℃で30分間イ
ンキュベートした。等体積ののアセトニトリルを添加す
ることによって反応を停止させた。次に、この混合物を
遠心分離することによってタンパク質を除去し、その上
清溶液を、生成物の生成と基質の消失について高性能液
体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。80%の
1mMトリエチルアミン塩酸(pH2.5)と20%のメタ
ノールを含有する緩衝液Aおよびメタノールを含有する
緩衝液Bによって形成される直線的勾配を1ml/分の流
速で用いて、C-18逆相カラム[ノバ-パックC18ラジ
アルパックカートリッジ(8×100mm)、ミリポア・ベ
ッドフォード製(マサチューセッツ州)]でHPLCを行
った。
μmolの基質(ロラカルベフPNBエステルまたはセファ
クロルPNBエステル)および適量の酵素溶液を含有す
る1mlの反応混合物を恒温振盪機中37℃で30分間イ
ンキュベートした。等体積ののアセトニトリルを添加す
ることによって反応を停止させた。次に、この混合物を
遠心分離することによってタンパク質を除去し、その上
清溶液を、生成物の生成と基質の消失について高性能液
体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。80%の
1mMトリエチルアミン塩酸(pH2.5)と20%のメタ
ノールを含有する緩衝液Aおよびメタノールを含有する
緩衝液Bによって形成される直線的勾配を1ml/分の流
速で用いて、C-18逆相カラム[ノバ-パックC18ラジ
アルパックカートリッジ(8×100mm)、ミリポア・ベ
ッドフォード製(マサチューセッツ州)]でHPLCを行
った。
【0032】使用したHPLC系はビスタ5560ユニ
ット[バリアン・アソシエーツ製(テキサス州シュガーラ
ンド)]とモデル230-401自動試料採取注入器[ギル
ソン・メディカル・エレクトロニクス製(ウィスコンシ
ン州ミドルトン)]を含むバリアンHPLCシステムであ
った。生成物の形成を254nmで監視することによって
PNBエステラーゼ活性を決定した。
ット[バリアン・アソシエーツ製(テキサス州シュガーラ
ンド)]とモデル230-401自動試料採取注入器[ギル
ソン・メディカル・エレクトロニクス製(ウィスコンシ
ン州ミドルトン)]を含むバリアンHPLCシステムであ
った。生成物の形成を254nmで監視することによって
PNBエステラーゼ活性を決定した。
【0033】酢酸p-ニトロフェニルが加水分解してp-
ニトロフェニルアルコールとアセテートに変化する際の
吸収変化を利用して、PNBエステラーゼの分光光度測
定検定法を開発した。この検定法で活性を示す酵素分画
は必ずしもPNBエステラーゼ活性を有するわけではな
いが、PNBエステラーゼはこの検定法で活性を示すで
あろう。精製PNBエステラーゼに関するこの検定法の
結果は、HPLC検定法の結果と十分な相関関係にあっ
た。したがってこの検定法は、一般に多数の検定を伴う
本酵素の精製に有益である。この検定を、100μMト
リス塩酸(pH7.0)、1.6μM酢酸p-ニトロフェニル
および1〜20μlの酵素溶液を含有する1mlの検定混
合物中室温で行った。カリー(Cary)分光光度計モデル2
19もしくはベックマンDU-50で405nmの吸収変
化を測定することにより活性を追跡した。
ニトロフェニルアルコールとアセテートに変化する際の
吸収変化を利用して、PNBエステラーゼの分光光度測
定検定法を開発した。この検定法で活性を示す酵素分画
は必ずしもPNBエステラーゼ活性を有するわけではな
いが、PNBエステラーゼはこの検定法で活性を示すで
あろう。精製PNBエステラーゼに関するこの検定法の
結果は、HPLC検定法の結果と十分な相関関係にあっ
た。したがってこの検定法は、一般に多数の検定を伴う
本酵素の精製に有益である。この検定を、100μMト
リス塩酸(pH7.0)、1.6μM酢酸p-ニトロフェニル
および1〜20μlの酵素溶液を含有する1mlの検定混
合物中室温で行った。カリー(Cary)分光光度計モデル2
19もしくはベックマンDU-50で405nmの吸収変
化を測定することにより活性を追跡した。
【0034】E.分子量決定 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(SDS-PAGE)によるPNBエステラーゼの分
子量決定を次のように行った。2%SDSおよび5%
2-MEで処理した精製PNBエステラーゼ 2μgをゲ
ルに乗せた。ラエムリのタンパク質標品(Laemmli,U.K.,
1970,Nature 227:680-682)と共に電気泳動を行った。使
用したタンパク質標品は(1)ホスホリラーゼB(分子量
(M.W.)=92500)、(2)ウシ血清アルブミン(M.
W.=66200)、(3)卵白アルブミン(M.W.=45
000)、(4)炭酸脱水酵素(M.W.=31000)、
(5)大豆トリプシンインヒビター(M.W.=2150
0)、および(6)リゾチーム(M.W.=14400)であ
った。
泳動(SDS-PAGE)によるPNBエステラーゼの分
子量決定を次のように行った。2%SDSおよび5%
2-MEで処理した精製PNBエステラーゼ 2μgをゲ
ルに乗せた。ラエムリのタンパク質標品(Laemmli,U.K.,
1970,Nature 227:680-682)と共に電気泳動を行った。使
用したタンパク質標品は(1)ホスホリラーゼB(分子量
(M.W.)=92500)、(2)ウシ血清アルブミン(M.
W.=66200)、(3)卵白アルブミン(M.W.=45
000)、(4)炭酸脱水酵素(M.W.=31000)、
(5)大豆トリプシンインヒビター(M.W.=2150
0)、および(6)リゾチーム(M.W.=14400)であ
った。
【0035】図1は、ゲル上での移動度に対する分子量
の片対数プロットである。プロット中の数字は使用した
上記タンパク質標品の括弧内の番号を表す。EはPNB
エステラーゼを表す。
の片対数プロットである。プロット中の数字は使用した
上記タンパク質標品の括弧内の番号を表す。EはPNB
エステラーゼを表す。
【0036】F.アミノ酸配列およびアミノ酸組成 ハインリクソン(Heinrikson)とメレディス(Meredith)の
方法(1984,Anal.Biochem.136,65-74)およびビドリング
マイヤー(Bidlingmeyer)らの方法(1984,J.Chromatog.33
6:93-104)に従い、フェニルイソチオシアネート(PIT
C)を用いてフェニルチオカルバモイルアミノ酸(PTC
-アミノ酸)に誘導体化した後、HPLC逆相によってア
ミノ酸を分析した。
方法(1984,Anal.Biochem.136,65-74)およびビドリング
マイヤー(Bidlingmeyer)らの方法(1984,J.Chromatog.33
6:93-104)に従い、フェニルイソチオシアネート(PIT
C)を用いてフェニルチオカルバモイルアミノ酸(PTC
-アミノ酸)に誘導体化した後、HPLC逆相によってア
ミノ酸を分析した。
【0037】精製PNBエステラーゼを水に対して充分
に透析し、酸洗浄したチューブ中で凍結乾燥した後、6
N HClを用いて110℃で24時間加水分解した。
加水分解物をPITCと反応させ、生成したPTC-ア
ミノ酸を、外部アミノ酸標準とウルトロスフェアー-O
DSカラム(0.46cm×25cm)(ベックマン製)を用い
るHPLCによって定量した。(A)50mM酢酸アンモニ
ウム(pH6.0)および(B)アセトニトリル/メタノー
ル/0.22M酢酸アンモニウム(pH6.0)混合液(4
4:10:46)からなる溶媒勾配を用いてPTC-アミノ
酸を溶出させた。さらに、PNBエステラーゼのアミノ
酸組成を従来のニンヒドリン法でも分析した。
に透析し、酸洗浄したチューブ中で凍結乾燥した後、6
N HClを用いて110℃で24時間加水分解した。
加水分解物をPITCと反応させ、生成したPTC-ア
ミノ酸を、外部アミノ酸標準とウルトロスフェアー-O
DSカラム(0.46cm×25cm)(ベックマン製)を用い
るHPLCによって定量した。(A)50mM酢酸アンモニ
ウム(pH6.0)および(B)アセトニトリル/メタノー
ル/0.22M酢酸アンモニウム(pH6.0)混合液(4
4:10:46)からなる溶媒勾配を用いてPTC-アミノ
酸を溶出させた。さらに、PNBエステラーゼのアミノ
酸組成を従来のニンヒドリン法でも分析した。
【0038】放出されるアミノ酸フェニルチオヒダント
イン誘導体(PTH-アミノ酸)のオンライン検出を伴う
モデル470A気相タンパク質シークエンサーを用い
て、アミノ酸配列分析をエドマン分解によって行った。
上記誘導体を、アプライド・バイオシステムズ(カリフ
ォルニア州フォスターシティー)のモデル120A PT
H-アミノ酸分析装置で検出した[アプライド・バイオシ
ステムズ・プロテイン・シークエンサー・ブレティンN
o.12(1985)]。水に対して充分に透析して凍結乾
燥した精製PNBエステラーゼを0.1%トリフルオロ
酢酸の入った5%アセトニトリルに溶解した後、ポリブ
レン塗被ガラス製ミクロ繊維フィルター中に吸着させ
た。
イン誘導体(PTH-アミノ酸)のオンライン検出を伴う
モデル470A気相タンパク質シークエンサーを用い
て、アミノ酸配列分析をエドマン分解によって行った。
上記誘導体を、アプライド・バイオシステムズ(カリフ
ォルニア州フォスターシティー)のモデル120A PT
H-アミノ酸分析装置で検出した[アプライド・バイオシ
ステムズ・プロテイン・シークエンサー・ブレティンN
o.12(1985)]。水に対して充分に透析して凍結乾
燥した精製PNBエステラーゼを0.1%トリフルオロ
酢酸の入った5%アセトニトリルに溶解した後、ポリブ
レン塗被ガラス製ミクロ繊維フィルター中に吸着させ
た。
【0039】実施例2:バチルス・ズプチリス(NRR
L B-8079)DNAのゲノムライブラリーからのP
NBエステラーゼ遺伝子(pnbA)の単離 A.菌株の説明と遺伝子型 バチルス・ズプチリス株NRRL B-8079を、セフ
ァロスポリンからパラ-ニトロベンジルエステルを除去
することができる微生物を同定するべく設計されたスク
リーニング法で単離した(Brannonら,J.Antibiotics XXI
X No.2:121-124,1976)。バチルス・ズプチリスNRRL
B-8097はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボ
ラトリー(NRRL)(米国農務省,イリノイ州6160
4ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号
B-8079の下で入手可能である。エシェリシア・コ
リ(大腸菌)K12 DH5αTM[マックス・エフィシェン
シーDH5αTMコンピテント・セル;ギブコ BRL製
(メリーランド州ガイサースブルク)]は、高い形質転換
能と大腸菌プラスミドの維持にとって安定な環境を提供
するために開発されたrecA-株である。この大腸菌
株を、バチルス・ズプチリス株NRRL B-8079ゲ
ノムライブラリー用の宿主細胞として使用した(実施例
2Jを参照のこと)。クローン化したPNBエステラー
ゼ遺伝子の高レベル発現にはrecA+大腸菌K12 R
V308を使用した。この大腸菌株は、大腸菌中で異種
タンパク質を工業的規模で発現させる際の宿主として好
ましい。大腸菌K12/RV308はNRRLに寄託さ
れており、受託番号B-15624の下で入手可能であ
る。
L B-8079)DNAのゲノムライブラリーからのP
NBエステラーゼ遺伝子(pnbA)の単離 A.菌株の説明と遺伝子型 バチルス・ズプチリス株NRRL B-8079を、セフ
ァロスポリンからパラ-ニトロベンジルエステルを除去
することができる微生物を同定するべく設計されたスク
リーニング法で単離した(Brannonら,J.Antibiotics XXI
X No.2:121-124,1976)。バチルス・ズプチリスNRRL
B-8097はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボ
ラトリー(NRRL)(米国農務省,イリノイ州6160
4ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号
B-8079の下で入手可能である。エシェリシア・コ
リ(大腸菌)K12 DH5αTM[マックス・エフィシェン
シーDH5αTMコンピテント・セル;ギブコ BRL製
(メリーランド州ガイサースブルク)]は、高い形質転換
能と大腸菌プラスミドの維持にとって安定な環境を提供
するために開発されたrecA-株である。この大腸菌
株を、バチルス・ズプチリス株NRRL B-8079ゲ
ノムライブラリー用の宿主細胞として使用した(実施例
2Jを参照のこと)。クローン化したPNBエステラー
ゼ遺伝子の高レベル発現にはrecA+大腸菌K12 R
V308を使用した。この大腸菌株は、大腸菌中で異種
タンパク質を工業的規模で発現させる際の宿主として好
ましい。大腸菌K12/RV308はNRRLに寄託さ
れており、受託番号B-15624の下で入手可能であ
る。
【0040】B.菌株の培養 トリプチカーゼR-ソイ・ブロス(TSB;ベクトン・デ
ィッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ製)
およびルリア・ブロス(L-ブロス;1リットルあたり1
0g ディフコ・バクト-トリプトンR、10g NaClお
よび5g 酵母エキス)を液体培養用の生育培地として使
用した。固体培地上での培養は2%(w/v)寒天を補足
したL-ブロス(L-寒天)上で生育させた。必要な場合に
は次の濃度で抗生物質を培地に添加した:アンピシリン
(50μg/ml)、テトラサイクリン(5μg/ml)。β-ガ
ラクトシダーゼ活性を検出するために、5-ブロモ-4-
クロロ-3-インドリル-D-ガラクトシド[X-gal;シ
グマ・ケミカル・カンパニー製(ミズーリ州63178
セントルイス)]を20μg/mlの濃度で培地に添加し
た。
ィッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ製)
およびルリア・ブロス(L-ブロス;1リットルあたり1
0g ディフコ・バクト-トリプトンR、10g NaClお
よび5g 酵母エキス)を液体培養用の生育培地として使
用した。固体培地上での培養は2%(w/v)寒天を補足
したL-ブロス(L-寒天)上で生育させた。必要な場合に
は次の濃度で抗生物質を培地に添加した:アンピシリン
(50μg/ml)、テトラサイクリン(5μg/ml)。β-ガ
ラクトシダーゼ活性を検出するために、5-ブロモ-4-
クロロ-3-インドリル-D-ガラクトシド[X-gal;シ
グマ・ケミカル・カンパニー製(ミズーリ州63178
セントルイス)]を20μg/mlの濃度で培地に添加し
た。
【0041】C.大腸菌K12 DH5α、大腸菌K1
2 RV308および大腸菌W ATTC 11105の
形質転換 大腸菌K12 DH5α感応細胞をBRLから入手し、
製造者の実験案を用いてこれを形質転換した。別法とし
て、大腸菌K12 DH5α、大腸菌K12 RV308
または大腸菌W ATCC 11105の培養50mlをL
-ブロス中でOD590が約0.5吸光度単位になるまで生
育させ、その細胞を遠心分離によって集めた。細胞ペレ
ットを冷たい100mM CaCl2 25mlに再懸濁し、
氷上で25分間インキュベートした。その細胞を遠心分
離によって集め、冷たい100mMCaCl2 2.5ml中
に再懸濁し、氷上で終夜インキュベートした。感応細胞
を直接使用するか、もしくは形質転換に使用する準備が
調うまで−70℃で保存した。
2 RV308および大腸菌W ATTC 11105の
形質転換 大腸菌K12 DH5α感応細胞をBRLから入手し、
製造者の実験案を用いてこれを形質転換した。別法とし
て、大腸菌K12 DH5α、大腸菌K12 RV308
または大腸菌W ATCC 11105の培養50mlをL
-ブロス中でOD590が約0.5吸光度単位になるまで生
育させ、その細胞を遠心分離によって集めた。細胞ペレ
ットを冷たい100mM CaCl2 25mlに再懸濁し、
氷上で25分間インキュベートした。その細胞を遠心分
離によって集め、冷たい100mMCaCl2 2.5ml中
に再懸濁し、氷上で終夜インキュベートした。感応細胞
を直接使用するか、もしくは形質転換に使用する準備が
調うまで−70℃で保存した。
【0042】感応性大腸菌細胞を形質転換するために、
感応細胞懸濁液100μlを−70℃の貯蔵庫から取り
出し、氷上で融解させる。ポリプロピレン製チューブ中
で細胞をプラスミドDNAの溶液(1ng/ml)5μlと穏
やかに混合し、得られた溶液を氷上で30分間インキュ
ベートした。このチューブを42℃の水槽に移し、振盪
せずに45秒間インキュベートした。この熱ショック処
理後、チューブを氷上に2分間静置した。次に、チュー
ブを氷から取り出し、予め室温にインキュベートしてお
いたS.O.C.培地(2%バクト-トリプトンR、0.5%
酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10m
M MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース)
0.9mlを加えた。次に、その細胞懸濁液を37℃22
5rpmで1時間振盪し、その一部をアンピシリンの入っ
たL-寒天上に植菌した。37℃でインキュベートした
後、形質転換体と推定される菌をプレートから選び取っ
た。形質転換体と推定される菌の帰属を、水平ゲル電気
泳動を用いてプラスミドDNAのサイズを測定すること
によって確認した(Sambrookら,1989)。選択したクロー
ンから得たプラスミドDNAを制限酵素分析によって特
徴づけた。
感応細胞懸濁液100μlを−70℃の貯蔵庫から取り
出し、氷上で融解させる。ポリプロピレン製チューブ中
で細胞をプラスミドDNAの溶液(1ng/ml)5μlと穏
やかに混合し、得られた溶液を氷上で30分間インキュ
ベートした。このチューブを42℃の水槽に移し、振盪
せずに45秒間インキュベートした。この熱ショック処
理後、チューブを氷上に2分間静置した。次に、チュー
ブを氷から取り出し、予め室温にインキュベートしてお
いたS.O.C.培地(2%バクト-トリプトンR、0.5%
酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10m
M MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース)
0.9mlを加えた。次に、その細胞懸濁液を37℃22
5rpmで1時間振盪し、その一部をアンピシリンの入っ
たL-寒天上に植菌した。37℃でインキュベートした
後、形質転換体と推定される菌をプレートから選び取っ
た。形質転換体と推定される菌の帰属を、水平ゲル電気
泳動を用いてプラスミドDNAのサイズを測定すること
によって確認した(Sambrookら,1989)。選択したクロー
ンから得たプラスミドDNAを制限酵素分析によって特
徴づけた。
【0043】D.プラスミドDNAの単離 標準的なアルカリ-SDS法(Sambrookら,1989)を用いて
大腸菌株からプラスミドDNAを単離した。別法とし
て、プラスミドDNAを次のように単離した。50mg/
mlのアンピシリンを含有するL-寒天上で生育する形質
転換体コロニーの一部を50mg/mlのアンピシリンを含
むL-ブロス 1リットルに移し、これを空気振盪機中3
7℃で約16時間インキュベートした。ベックマンJA
-10ローターを用いる4℃,8000rpm,10分間の遠
心分離によって500mlチューブ中に細胞を収集した。
細胞ペレットをpH8.0のTE(10mMトリス塩酸、1
mMEDTA)で洗浄し、50mMトリス塩酸(pH8.0)、
25%ショ糖中に再懸濁して全量を10mlとした。25
mMトリス塩酸(pH8.0)中の20mg/mlリゾチーム[シ
グマ・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州セントルイ
ス)]1mlを撹拌しながら加え、その混合物を氷上で30
分間インキュベートした。200mM EDTA 4mlを加
えた後、氷上で10分間インキュベートし、次いでブリ
ージ/DOC溶菌溶液[1%ブリージ58、0.4%デオ
キシコレート、50mMトリス塩酸(pH8.0)、60mM
EDTA]15mlを添加した。混合するためにチューブ
を穏やかに反転させ、氷上で15〜30分間インキュベ
ートした。ベックマンJA-20ローター中18000r
pmで1時間遠心分離することにより細胞残渣を除去し
た。上清を静かに移すことにより約30mlを得、これに
10mg/mlのRNAse A(シグマ・ケミカル・カンパ
ニー製)150mlを加えた。37℃で1時間インキュベ
ートした後、10mg/mlのプロテイナーゼK(ベーリン
ガー・マンハイム製)150mlを加え、次いで37℃で
さらに1時間インキュベートした。1/10体積の3M
酢酸ナトリウム(pH7.0)を添加し、次いで3体積の
氷冷無水エタノールを添加することによってDNAを沈
殿させた。ベックマンJA-14ローター[ベックマン・
インストルメンツ,インコーポレイテッド製(カリフォル
ニア州92634フラートン)]中8000rpmで30分
間の遠心分離によってDNAを回収した。風乾したペレ
ットをTE(pH8.0)に再懸濁して全量を9mlにし、
これに塩化セシウム(ベーリンガー・マンハイム製)9g
および10mg/ml臭化エチジウム 0.5mlを加えた。得
られた溶液を2つの5.1mlチューブ,クイック-シール
(Quik-Seal)(ベックマン・インストルメンツ,インコーポ
レイテッド)に移し、ベックマンVTi65.2超遠心ロ
ーター中65000rpmで6時間遠心分離した。紫外光
下でプラスミドバンドを可視化し、これを注射器で取り
出した。臭化エチジウムを除去するために得られたDN
A溶液を塩飽和イソプロパノールで抽出し、1000倍
体積のTE(pH8.0)に対して16時間透析した。必
要になるまで、DNA溶液を−20℃で保存した。
大腸菌株からプラスミドDNAを単離した。別法とし
て、プラスミドDNAを次のように単離した。50mg/
mlのアンピシリンを含有するL-寒天上で生育する形質
転換体コロニーの一部を50mg/mlのアンピシリンを含
むL-ブロス 1リットルに移し、これを空気振盪機中3
7℃で約16時間インキュベートした。ベックマンJA
-10ローターを用いる4℃,8000rpm,10分間の遠
心分離によって500mlチューブ中に細胞を収集した。
細胞ペレットをpH8.0のTE(10mMトリス塩酸、1
mMEDTA)で洗浄し、50mMトリス塩酸(pH8.0)、
25%ショ糖中に再懸濁して全量を10mlとした。25
mMトリス塩酸(pH8.0)中の20mg/mlリゾチーム[シ
グマ・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州セントルイ
ス)]1mlを撹拌しながら加え、その混合物を氷上で30
分間インキュベートした。200mM EDTA 4mlを加
えた後、氷上で10分間インキュベートし、次いでブリ
ージ/DOC溶菌溶液[1%ブリージ58、0.4%デオ
キシコレート、50mMトリス塩酸(pH8.0)、60mM
EDTA]15mlを添加した。混合するためにチューブ
を穏やかに反転させ、氷上で15〜30分間インキュベ
ートした。ベックマンJA-20ローター中18000r
pmで1時間遠心分離することにより細胞残渣を除去し
た。上清を静かに移すことにより約30mlを得、これに
10mg/mlのRNAse A(シグマ・ケミカル・カンパ
ニー製)150mlを加えた。37℃で1時間インキュベ
ートした後、10mg/mlのプロテイナーゼK(ベーリン
ガー・マンハイム製)150mlを加え、次いで37℃で
さらに1時間インキュベートした。1/10体積の3M
酢酸ナトリウム(pH7.0)を添加し、次いで3体積の
氷冷無水エタノールを添加することによってDNAを沈
殿させた。ベックマンJA-14ローター[ベックマン・
インストルメンツ,インコーポレイテッド製(カリフォル
ニア州92634フラートン)]中8000rpmで30分
間の遠心分離によってDNAを回収した。風乾したペレ
ットをTE(pH8.0)に再懸濁して全量を9mlにし、
これに塩化セシウム(ベーリンガー・マンハイム製)9g
および10mg/ml臭化エチジウム 0.5mlを加えた。得
られた溶液を2つの5.1mlチューブ,クイック-シール
(Quik-Seal)(ベックマン・インストルメンツ,インコーポ
レイテッド)に移し、ベックマンVTi65.2超遠心ロ
ーター中65000rpmで6時間遠心分離した。紫外光
下でプラスミドバンドを可視化し、これを注射器で取り
出した。臭化エチジウムを除去するために得られたDN
A溶液を塩飽和イソプロパノールで抽出し、1000倍
体積のTE(pH8.0)に対して16時間透析した。必
要になるまで、DNA溶液を−20℃で保存した。
【0044】E.ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅 DNAサーマルサイクラー(DNA Thermal CyclerTM)
とジーン-アンプ(Gene-AmpTM)試薬キット[パーキン-エ
ルマー・シータス製(コネチカット州06859ノルウ
ォーク)]を用い、製造者の指針に従ってポリメラーゼ連
鎖反応を行った。次のインキュベーションを1サイクル
として30サイクルの増幅を行った:93℃で1分、次
いで40℃で2分、次いで72℃で4分。72℃で10
分間インキュベートすることによって合成を完結させ
た。
とジーン-アンプ(Gene-AmpTM)試薬キット[パーキン-エ
ルマー・シータス製(コネチカット州06859ノルウ
ォーク)]を用い、製造者の指針に従ってポリメラーゼ連
鎖反応を行った。次のインキュベーションを1サイクル
として30サイクルの増幅を行った:93℃で1分、次
いで40℃で2分、次いで72℃で4分。72℃で10
分間インキュベートすることによって合成を完結させ
た。
【0045】F.ヌクレオチド配列の分析 キアゲン(Qiagen)DNA結合カラム[キアゲン,インコー
ポレイテッド(カリフォルニア州チャトスワース)]を用
い、製造者が示す実験案に従って、大腸菌培養のアルカ
リ溶菌液から配列決定用の高次コイルプラスミドDNA
鋳型を精製した。蛍光性色素標識ジデオキシヌクレチ
ド、高次コインプラスミド鋳型および配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、サイクル配列決定法
[アプライド・バイオシステム,インコーポレイテッド
(ABI)(カリフォルニア州94404フォスターシテ
ィー)]に従って、ジデオキシヌクレオチド鎖終結(チェ
ーン・ターミネーション)配列決定反応を行った。配列
決定反応液をABIモデル373A自動DNAシークエ
ンサーで分析した。ヌクレオチド配列を集め、編集し、
デベルックス(Devereux)らのGCGコンピュータープロ
グラム(1985,Nucleic Acids Res.12:387-395)を用いて
分析した。
ポレイテッド(カリフォルニア州チャトスワース)]を用
い、製造者が示す実験案に従って、大腸菌培養のアルカ
リ溶菌液から配列決定用の高次コイルプラスミドDNA
鋳型を精製した。蛍光性色素標識ジデオキシヌクレチ
ド、高次コインプラスミド鋳型および配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、サイクル配列決定法
[アプライド・バイオシステム,インコーポレイテッド
(ABI)(カリフォルニア州94404フォスターシテ
ィー)]に従って、ジデオキシヌクレオチド鎖終結(チェ
ーン・ターミネーション)配列決定反応を行った。配列
決定反応液をABIモデル373A自動DNAシークエ
ンサーで分析した。ヌクレオチド配列を集め、編集し、
デベルックス(Devereux)らのGCGコンピュータープロ
グラム(1985,Nucleic Acids Res.12:387-395)を用いて
分析した。
【0046】 G.オリゴヌクレオチドプローブの合成と末端ラベル化 バチルス・ズプチリスNRRL B-8079から精製し
たPNBエステラーゼ[比活性約2.2U/mg(ロラカル
ベフPNBエステルの対応する遊離酸への加水分解に基
づく)]25ピコモルを自動気相シークエネーターでの分
析(Hewickら,1981,J.Biol.Chem.256:7990;Hunkapiller
およびHood,1978,Biochemistry 17:2124)にかけること
により、この酵素のアミノ末端配列を得た。PNBエス
テラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列は、Met Thr His
Gln Ile Val Thr Thr Tyr Gly Lys Lys Val Lys Gly Th
r Gln Glu Asn Gly Val His(配列番号1)であった。
たPNBエステラーゼ[比活性約2.2U/mg(ロラカル
ベフPNBエステルの対応する遊離酸への加水分解に基
づく)]25ピコモルを自動気相シークエネーターでの分
析(Hewickら,1981,J.Biol.Chem.256:7990;Hunkapiller
およびHood,1978,Biochemistry 17:2124)にかけること
により、この酵素のアミノ末端配列を得た。PNBエス
テラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列は、Met Thr His
Gln Ile Val Thr Thr Tyr Gly Lys Lys Val Lys Gly Th
r Gln Glu Asn Gly Val His(配列番号1)であった。
【0047】この配列と公知のバチルス・ズプチリスに
関するコドン使用則[Harwoodら,“Molecular Biologica
l Methods for Bacillus",ジョン・ウィリー・アンド・サ
ンズ・リミテッド,イングランド,ウエスト・サセックス
(1990)]に基づき、β-シアノエチルホスホルアミダ
イト化学を用いるアプライドバイオシステムズ,インコ
ーポレイテッド・モデル380B DNA合成装置で、
製造者の指針に従って、2つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成した。PNB1およびPNB2と命名したこ
れらオリゴヌクレオチドプローブを次に示す。ここでは
左から右に5'から3'の方向で表す。 PNB1:ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A(配列番号5) PNB2:TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CACACAAGAA AATGGCGTCC A(配列番号6)
関するコドン使用則[Harwoodら,“Molecular Biologica
l Methods for Bacillus",ジョン・ウィリー・アンド・サ
ンズ・リミテッド,イングランド,ウエスト・サセックス
(1990)]に基づき、β-シアノエチルホスホルアミダ
イト化学を用いるアプライドバイオシステムズ,インコ
ーポレイテッド・モデル380B DNA合成装置で、
製造者の指針に従って、2つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成した。PNB1およびPNB2と命名したこ
れらオリゴヌクレオチドプローブを次に示す。ここでは
左から右に5'から3'の方向で表す。 PNB1:ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A(配列番号5) PNB2:TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CACACAAGAA AATGGCGTCC A(配列番号6)
【0048】上記一本鎖DNAセグメントをまずカラム
精製(オリゴヌクレオチド・ピュリフィケーション・カ
ートリッジ;アプライド・バイオシステムズ,インコー
ポレイテッド製)し、次に以下のように末端ラベル化し
た。キナーゼ緩衝液[50mMトリス塩酸(pH7.6)、1
0mM MgCl2]中のT4ポリヌクレオチドキナーゼ8
単位および[γ-32P]アデノシン三リン酸(ATP;50
00Ci/ml)12μlを含有する20μlの反応混合物
に、各プローブ10ピコモルを添加した。37℃で35
分間反応させ、キナーゼを不活化するために70℃で5
分間インキュベートした後、セファデックスG-50ニ
ックカラム[ファルマシア,インコーポレイテッド製(ニ
ュージャージー州08854ピスカタウェイ)]を用い
て、取り込まれなかった[γ-32P]ATPを反応混合物
から除去した。
精製(オリゴヌクレオチド・ピュリフィケーション・カ
ートリッジ;アプライド・バイオシステムズ,インコー
ポレイテッド製)し、次に以下のように末端ラベル化し
た。キナーゼ緩衝液[50mMトリス塩酸(pH7.6)、1
0mM MgCl2]中のT4ポリヌクレオチドキナーゼ8
単位および[γ-32P]アデノシン三リン酸(ATP;50
00Ci/ml)12μlを含有する20μlの反応混合物
に、各プローブ10ピコモルを添加した。37℃で35
分間反応させ、キナーゼを不活化するために70℃で5
分間インキュベートした後、セファデックスG-50ニ
ックカラム[ファルマシア,インコーポレイテッド製(ニ
ュージャージー州08854ピスカタウェイ)]を用い
て、取り込まれなかった[γ-32P]ATPを反応混合物
から除去した。
【0049】H.バチルス・ズプチリスNRRL B-8
079からのゲノムDNAの単離 TSB中25℃で16時間生育して対数増殖中期に達し
たバチルス・ズプチリスNRRL B-8079の培養2
リットルから全DNAを単離した。遠心分離によって細
胞を収集し、緩衝液[50mMトリス塩酸(pH8.0)、5
0mM EDTA]20ml中に再懸濁した。細胞の溶解を次
の2工程で達成した:(i)1mg/mlのリゾチーム[卵白
由来:カルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョ
ラ)]を添加し、その懸濁液を37℃で20分間インキュ
ベートし、次いで(ii)溶菌緩衝液[0.5%ドデシル硫酸
ナトリウム(SDS)、50mMトリス(pH7.5)、0.4
M EDTA、1mg/mlプロテイナーゼK]4mlを添加
し、50℃で30分間インキュベートする。2回フェノ
ール抽出し、次いで1回クロロホルム抽出することによ
ってDNAを精製した後、エタノールで沈殿させ、これ
をガラス棒に巻き取ることによって回収した。1mM E
DTAと0.2mg/mlリボヌクレアーゼ(ウシ膵臓由来;
シグマ・ケミカル・カンパニー製)を含有する40mMト
リス塩酸緩衝液(pH7.5)中にDNAを穏やかに再懸
濁し、その調製物を25℃で30分間インキュベートす
ることによって、上記調製物からRNAを除去した。フ
ェノールとクロロホルムで再抽出し、これをTE(pH
7.5)に再懸濁することによってさらなる精製を達成し
た。
079からのゲノムDNAの単離 TSB中25℃で16時間生育して対数増殖中期に達し
たバチルス・ズプチリスNRRL B-8079の培養2
リットルから全DNAを単離した。遠心分離によって細
胞を収集し、緩衝液[50mMトリス塩酸(pH8.0)、5
0mM EDTA]20ml中に再懸濁した。細胞の溶解を次
の2工程で達成した:(i)1mg/mlのリゾチーム[卵白
由来:カルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョ
ラ)]を添加し、その懸濁液を37℃で20分間インキュ
ベートし、次いで(ii)溶菌緩衝液[0.5%ドデシル硫酸
ナトリウム(SDS)、50mMトリス(pH7.5)、0.4
M EDTA、1mg/mlプロテイナーゼK]4mlを添加
し、50℃で30分間インキュベートする。2回フェノ
ール抽出し、次いで1回クロロホルム抽出することによ
ってDNAを精製した後、エタノールで沈殿させ、これ
をガラス棒に巻き取ることによって回収した。1mM E
DTAと0.2mg/mlリボヌクレアーゼ(ウシ膵臓由来;
シグマ・ケミカル・カンパニー製)を含有する40mMト
リス塩酸緩衝液(pH7.5)中にDNAを穏やかに再懸
濁し、その調製物を25℃で30分間インキュベートす
ることによって、上記調製物からRNAを除去した。フ
ェノールとクロロホルムで再抽出し、これをTE(pH
7.5)に再懸濁することによってさらなる精製を達成し
た。
【0050】I.オリゴヌクレオチドプローブを用いる
EcoRI制限断片のサザンハイブリッド形成 バチルス・ズプチリスNRRL B-8079から得たゲ
ノムDNAをEcoRIで消化し、1%アガロス-TBE
ゲル(Sambrookら,1989)での電気泳動にかけた。次に、
サイズ分画したDNAをサザンブロッティング(Sambroo
kら,1989)によってハイボンド-N+ ナイロン膜[アマシ
ャム製(米国イリノイ州アルリングトン・ハイツ)]に転
写し、紫外光で5分間処理することによって上記基盤に
架橋させた。そのDNAを、6×SSC[1×SSC(p
H7.0)は0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナ
トリウムを含有する]、5×デンハルト溶液[1×デンハ
ルト溶液は0.2g/l フィコール400、0.2g/l ポ
リビニルピロリドンおよび0.2g/l ウシ血清アルブ
ミン(フラクションV)を含有する]、0.25%SDS、
および超音波処理によって断片化した20μg/mlウシ
胸腺DNAを含有するハイブリッド形成緩衝液中70℃
で1〜2時間予備ハイブリッド形成させた後、[32P]-
標識オリゴヌクレオチド(実施例2Gに記述したように
調製したもの)を含有する新鮮なハイブリッド形成緩衝
液を加えて最終プローブ濃度を0.5ピコモル/mlにし
た。このインキュベーション混合物の温度を終夜インキ
ュベーションの間に45℃に低下させた。次に、各プロ
ーブについて最適化した厳密度条件を用いてこの膜を洗
浄した。PNB1にハイブリッド形成させた膜は、4×
SSC、0.25%SDS中45℃で3回連続して25
分間洗浄した。PNB2にハイブリッド形成させた膜
は、0.5×SSC、0.25%SDSを用いて同様に洗
浄した。洗浄後、膜を室温で乾燥し、フィルムにさらし
た。
EcoRI制限断片のサザンハイブリッド形成 バチルス・ズプチリスNRRL B-8079から得たゲ
ノムDNAをEcoRIで消化し、1%アガロス-TBE
ゲル(Sambrookら,1989)での電気泳動にかけた。次に、
サイズ分画したDNAをサザンブロッティング(Sambroo
kら,1989)によってハイボンド-N+ ナイロン膜[アマシ
ャム製(米国イリノイ州アルリングトン・ハイツ)]に転
写し、紫外光で5分間処理することによって上記基盤に
架橋させた。そのDNAを、6×SSC[1×SSC(p
H7.0)は0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナ
トリウムを含有する]、5×デンハルト溶液[1×デンハ
ルト溶液は0.2g/l フィコール400、0.2g/l ポ
リビニルピロリドンおよび0.2g/l ウシ血清アルブ
ミン(フラクションV)を含有する]、0.25%SDS、
および超音波処理によって断片化した20μg/mlウシ
胸腺DNAを含有するハイブリッド形成緩衝液中70℃
で1〜2時間予備ハイブリッド形成させた後、[32P]-
標識オリゴヌクレオチド(実施例2Gに記述したように
調製したもの)を含有する新鮮なハイブリッド形成緩衝
液を加えて最終プローブ濃度を0.5ピコモル/mlにし
た。このインキュベーション混合物の温度を終夜インキ
ュベーションの間に45℃に低下させた。次に、各プロ
ーブについて最適化した厳密度条件を用いてこの膜を洗
浄した。PNB1にハイブリッド形成させた膜は、4×
SSC、0.25%SDS中45℃で3回連続して25
分間洗浄した。PNB2にハイブリッド形成させた膜
は、0.5×SSC、0.25%SDSを用いて同様に洗
浄した。洗浄後、膜を室温で乾燥し、フィルムにさらし
た。
【0051】上記の方法を用いることによって、約6kb
の大きさのEcoRI断片を示すバンドがプローブPNB
1およびPNB2とハイブリッド形成することがわかっ
た。
の大きさのEcoRI断片を示すバンドがプローブPNB
1およびPNB2とハイブリッド形成することがわかっ
た。
【0052】J.EcoRI断片の濃縮ライブラリーの構
築とpNBE1の単離 バチルス・ズプチリスNRRL B-8097ゲノムDN
AをEcoRIで完全に消化し、水平1.2%アガロース
ゲル(40mMトリス酢酸および1mM EDTAからなる1
×TAE緩衝液中,2V/cm)中で16時間電気泳動に
かけた。このゲルを臭化エチジウム希釈液(1mg/ml)中
で染色し、長波長紫外光下でDNAバンドを可視化し
た。大きさが約6kbのDNAに対応するゲルの領域であ
って、かつ、PNB1およびPNB2とハイブリッド形
成することが既にわかっているバンドをまたぐゲルの領
域から切片を取り出した。サムブルックらの手法(Sambr
ook,1989)に従い、これにわずかな調整を加えて、ゲル
切片からDNA断片を溶出させた。簡単に述べると、ゲ
ル切片を0.2×TAE緩衝液200μlと共に透析袋中
に入れ、クリップで封印し、0.2×TAE緩衝液中で
約3時間電気泳動した。透析袋の内容物を0.2×TA
Eによる洗浄液400μlと共に低塩緩衝液[0.2M N
aCl、20mMトリス塩酸(pH7.5)、1.0mM ED
TA]2.4mlと混合し、これを製造者の実験案に従って
調製したエルーチップ-dカラム[シュライシャー・アン
ド・シュネル製(ニューハンプシャー州キーン)]に充填
した。低塩緩衝液で洗浄した後、400μlの高塩緩衝
液[1.0M NaCl、20mMトリス塩酸(pH7.5)、
1.0mM EDTA]を2回用いてDNAを上記カラムか
ら溶出させ、そのDNAを氷冷無水エタノール800μ
lの添加によって沈殿させ、次いでエッペンドルフ54
15C微量遠心機中14000rpmで40分間遠心分離
した。風乾した2つのペレットをTE(pH7.5)20m
lに溶解することによって合わせ、その溶液を連結操作
まで−20℃で保存した。これらの断片を、EcoRI
消化とそれに続くウシ腸アルカリ性ホスファターゼ[カ
ルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]での5'
リン酸基除去によって予備処理したベクターpUC19
[ギブコ BRL製(メリーランド州ガイサースブルク)]
中に連結した。
築とpNBE1の単離 バチルス・ズプチリスNRRL B-8097ゲノムDN
AをEcoRIで完全に消化し、水平1.2%アガロース
ゲル(40mMトリス酢酸および1mM EDTAからなる1
×TAE緩衝液中,2V/cm)中で16時間電気泳動に
かけた。このゲルを臭化エチジウム希釈液(1mg/ml)中
で染色し、長波長紫外光下でDNAバンドを可視化し
た。大きさが約6kbのDNAに対応するゲルの領域であ
って、かつ、PNB1およびPNB2とハイブリッド形
成することが既にわかっているバンドをまたぐゲルの領
域から切片を取り出した。サムブルックらの手法(Sambr
ook,1989)に従い、これにわずかな調整を加えて、ゲル
切片からDNA断片を溶出させた。簡単に述べると、ゲ
ル切片を0.2×TAE緩衝液200μlと共に透析袋中
に入れ、クリップで封印し、0.2×TAE緩衝液中で
約3時間電気泳動した。透析袋の内容物を0.2×TA
Eによる洗浄液400μlと共に低塩緩衝液[0.2M N
aCl、20mMトリス塩酸(pH7.5)、1.0mM ED
TA]2.4mlと混合し、これを製造者の実験案に従って
調製したエルーチップ-dカラム[シュライシャー・アン
ド・シュネル製(ニューハンプシャー州キーン)]に充填
した。低塩緩衝液で洗浄した後、400μlの高塩緩衝
液[1.0M NaCl、20mMトリス塩酸(pH7.5)、
1.0mM EDTA]を2回用いてDNAを上記カラムか
ら溶出させ、そのDNAを氷冷無水エタノール800μ
lの添加によって沈殿させ、次いでエッペンドルフ54
15C微量遠心機中14000rpmで40分間遠心分離
した。風乾した2つのペレットをTE(pH7.5)20m
lに溶解することによって合わせ、その溶液を連結操作
まで−20℃で保存した。これらの断片を、EcoRI
消化とそれに続くウシ腸アルカリ性ホスファターゼ[カ
ルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]での5'
リン酸基除去によって予備処理したベクターpUC19
[ギブコ BRL製(メリーランド州ガイサースブルク)]
中に連結した。
【0053】得られたプラスミドを用いて感応性大腸菌
K12 DH5α細胞を形質転換し、次いでそれらの細
胞をアンピシリンとX-Galの入ったL-寒天プレート
に植菌した。ベクターとしてプラスミドpUC19を使
用することにより、青/白選択を用いて、挿入DNAを
含有するクローンを特異的に選択することができる。β
-ガラクトシダーゼのα-ペプチドをコード化するlac
Z遺伝子の一部を含むpUC19ベクターのみを含有す
る形質転換体は、X-Galの切断で生じる青色によっ
て検出される活性な酵素を生産する。対照的に、EcoR
I部位に挿入物を含有する単離体は上記α-ペプチドの
読み枠を破壊し、X-Galを変換することができない
ので、この単離体はX-Galを含有する培地上で白色
のままである。100以上の白いアンピシリン耐性コロ
ニーを選択し、表現型の安定性を試験するために同寒天
上に再植菌した。
K12 DH5α細胞を形質転換し、次いでそれらの細
胞をアンピシリンとX-Galの入ったL-寒天プレート
に植菌した。ベクターとしてプラスミドpUC19を使
用することにより、青/白選択を用いて、挿入DNAを
含有するクローンを特異的に選択することができる。β
-ガラクトシダーゼのα-ペプチドをコード化するlac
Z遺伝子の一部を含むpUC19ベクターのみを含有す
る形質転換体は、X-Galの切断で生じる青色によっ
て検出される活性な酵素を生産する。対照的に、EcoR
I部位に挿入物を含有する単離体は上記α-ペプチドの
読み枠を破壊し、X-Galを変換することができない
ので、この単離体はX-Galを含有する培地上で白色
のままである。100以上の白いアンピシリン耐性コロ
ニーを選択し、表現型の安定性を試験するために同寒天
上に再植菌した。
【0054】白コロニーからプラスミドDNAを単離
し、これをゲル電気泳動によって分析した。必要な9kb
の大きさ(2.686kbのpUC19DNA+約6kbの挿
入DNA)のプラスミドDNAを含有する7つのコロニ
ーをさらなる研究のために選択した。PNB2プローブ
を用いるサザンハイブリッド形成によって試験したとこ
ろ、1つのプラスミドpNBE1が強いハイブリッド形
成信号を示した。プラスミドpNBE1をEcoRIで消
化すると予期される大きさの2つの断片、即ち、直線化
したpUC19(2.686kb)に対応する1断片と挿入
断片に対応する約6kbの大きさのもう1つの断片が得ら
れた。
し、これをゲル電気泳動によって分析した。必要な9kb
の大きさ(2.686kbのpUC19DNA+約6kbの挿
入DNA)のプラスミドDNAを含有する7つのコロニ
ーをさらなる研究のために選択した。PNB2プローブ
を用いるサザンハイブリッド形成によって試験したとこ
ろ、1つのプラスミドpNBE1が強いハイブリッド形
成信号を示した。プラスミドpNBE1をEcoRIで消
化すると予期される大きさの2つの断片、即ち、直線化
したpUC19(2.686kb)に対応する1断片と挿入
断片に対応する約6kbの大きさのもう1つの断片が得ら
れた。
【0055】K.プラスミドpNBE1上のpnbAの
転写の方向の解明 pUC19のlacZ遺伝子に対するpnbAの転写の
方向と、pNBE1挿入物中のATG転写開始部位のお
よその位置を決定するために、pNBE1を用いて2回
のPCR増幅を行った。第1の増幅ではPNB2オリゴ
ヌクレオチドプローブと順方向(−20)M13DNA配
列決定用プライマー(ニュー・イングランド・バイオラ
ブス製)を使用した。第2の増幅でもPNB2を使用し
たが、もう1つのプライマーは逆方向(−24)M13配
列決定用プライマーであった。その結果、(−20)順方
向配列決定用プライマーを用いた反応のみが増幅した断
片を与えることがわかった。増幅された断片の大きさを
決定したところ、2.0kbであった。したがって、pn
bAのATG開始部位はpUC19のマルチクローニン
グ部位の開始部位から約4kb(キロ塩基対)下流に位置
し、lacZ遺伝子と同じ方向に転写される。
転写の方向の解明 pUC19のlacZ遺伝子に対するpnbAの転写の
方向と、pNBE1挿入物中のATG転写開始部位のお
よその位置を決定するために、pNBE1を用いて2回
のPCR増幅を行った。第1の増幅ではPNB2オリゴ
ヌクレオチドプローブと順方向(−20)M13DNA配
列決定用プライマー(ニュー・イングランド・バイオラ
ブス製)を使用した。第2の増幅でもPNB2を使用し
たが、もう1つのプライマーは逆方向(−24)M13配
列決定用プライマーであった。その結果、(−20)順方
向配列決定用プライマーを用いた反応のみが増幅した断
片を与えることがわかった。増幅された断片の大きさを
決定したところ、2.0kbであった。したがって、pn
bAのATG開始部位はpUC19のマルチクローニン
グ部位の開始部位から約4kb(キロ塩基対)下流に位置
し、lacZ遺伝子と同じ方向に転写される。
【0056】L.機能的pnbA遺伝子の確認 全pnbA遺伝子がpNBE1上に存在するかどうか、
また、それが大腸菌中で発現することができるかどうか
を決定するために、プラスミドpNBE1で形質転換し
た大腸菌K12 DH5α細胞の抽出物をエステラーゼ
活性について検定した。L-ブロス中で対数増殖中期ま
で生育した培養約75mlから細胞抽出物を調製した。8
000rpmで10分間の遠心分離によって細胞を収集
し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中で洗
浄し、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁(1g細胞/
4ml緩衝液)し、30秒間の超音波破砕[ソニケーター(S
onicatorTM)セル・ディスラプター・モデルW185F;
ヒート・システムズ-ウルトラソニックス,インコーポレ
イテッド製(ニューヨーク州プラインビュー)]に4回さ
らすことによって破壊した。微量遠心機中最大速度で2
0分間の遠心分離によって細胞残渣を除去した。精製P
NBエステラーゼはβ-ラクタム系抗生物質のp-ニトロ
ベンジルエステルだけでなく酢酸p-ニトロフェニルの
切断をも触媒するので、この反応を利用してp-ニトロ
フェノールの生成を分光光度測定法で都合よく監視する
ことができた。0.5M 酢酸p-ニトロフェニル[1:99
(v/v)アセトニトリル/水中]400μl、167mMト
リス塩酸(pH7.0)600μlおよび無細胞抽出物1〜
20μlを含有する反応混合物を用いた。ギルフォード
・レスポンスII分光光度計を用いてOD405の増大を監
視することにより、p-ニトロフェノールの生成を分光
光度測定法で測定した。別法として、爪楊枝を用いてコ
ロニーの一部を上記反応混合物中に添加することによ
り、全細胞を使って酵素活性を定性的に明らかにするこ
ともできた。これらの方法による全細胞と無細胞抽出物
の検定は共に、プラスミドpNBE1が無傷のpnbA
遺伝子を含有すること並びに該遺伝子が発現して活性な
酵素を生産したことを立証した。プラスミドを保持しな
い大腸菌K12 DH5α細胞中、あるいは上記ゲノム
ライブラリーから得られる他の非ハイブリッド形成性プ
ラスミドを保持する大腸菌K12 DH5α細胞中には
有意な活性が検出されなかった。
また、それが大腸菌中で発現することができるかどうか
を決定するために、プラスミドpNBE1で形質転換し
た大腸菌K12 DH5α細胞の抽出物をエステラーゼ
活性について検定した。L-ブロス中で対数増殖中期ま
で生育した培養約75mlから細胞抽出物を調製した。8
000rpmで10分間の遠心分離によって細胞を収集
し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中で洗
浄し、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁(1g細胞/
4ml緩衝液)し、30秒間の超音波破砕[ソニケーター(S
onicatorTM)セル・ディスラプター・モデルW185F;
ヒート・システムズ-ウルトラソニックス,インコーポレ
イテッド製(ニューヨーク州プラインビュー)]に4回さ
らすことによって破壊した。微量遠心機中最大速度で2
0分間の遠心分離によって細胞残渣を除去した。精製P
NBエステラーゼはβ-ラクタム系抗生物質のp-ニトロ
ベンジルエステルだけでなく酢酸p-ニトロフェニルの
切断をも触媒するので、この反応を利用してp-ニトロ
フェノールの生成を分光光度測定法で都合よく監視する
ことができた。0.5M 酢酸p-ニトロフェニル[1:99
(v/v)アセトニトリル/水中]400μl、167mMト
リス塩酸(pH7.0)600μlおよび無細胞抽出物1〜
20μlを含有する反応混合物を用いた。ギルフォード
・レスポンスII分光光度計を用いてOD405の増大を監
視することにより、p-ニトロフェノールの生成を分光
光度測定法で測定した。別法として、爪楊枝を用いてコ
ロニーの一部を上記反応混合物中に添加することによ
り、全細胞を使って酵素活性を定性的に明らかにするこ
ともできた。これらの方法による全細胞と無細胞抽出物
の検定は共に、プラスミドpNBE1が無傷のpnbA
遺伝子を含有すること並びに該遺伝子が発現して活性な
酵素を生産したことを立証した。プラスミドを保持しな
い大腸菌K12 DH5α細胞中、あるいは上記ゲノム
ライブラリーから得られる他の非ハイブリッド形成性プ
ラスミドを保持する大腸菌K12 DH5α細胞中には
有意な活性が検出されなかった。
【0057】M.pnbA遺伝子のサブクローニング 上述のPCR実験から得られた情報およびpNBE1の
一制限酵素消化および二重制限酵素消化の結果を用い
て、上記6.0kbEcoRI断片の予備的な物理的地図を
作成することができた。プラスミドpNBE1の制限酵
素部位と機能地図を図2に示す。次に、pNBE1をH
paIIで部分消化した後、EcoRIで完全消化し、得られ
たHpaII-EcoRI断片をAccI-EcoRIで消化したp
UC19に連結することによって、このプラスミドの一
連のサブクローンを作成した。上記挿入物のHpaII部位
とpUC19のAccI部位はこの連結によって再生され
なかった。次に、得られたプラスミドを大腸菌K12
DH5α細胞中に導入し、アンピシリン耐性コロニーを
選択し、それらをエステラーゼ活性について試験した。
いくつかの陽性クローンからプラスミドDNAを単離
し、それらを分析してそのHpaII-EcoRI挿入物の大
きさを決定した。活性な酵素をコード化する最も小さい
挿入物は2.3kbであった。このプラスミドベクターを
pNBHpE2.3と命名した。
一制限酵素消化および二重制限酵素消化の結果を用い
て、上記6.0kbEcoRI断片の予備的な物理的地図を
作成することができた。プラスミドpNBE1の制限酵
素部位と機能地図を図2に示す。次に、pNBE1をH
paIIで部分消化した後、EcoRIで完全消化し、得られ
たHpaII-EcoRI断片をAccI-EcoRIで消化したp
UC19に連結することによって、このプラスミドの一
連のサブクローンを作成した。上記挿入物のHpaII部位
とpUC19のAccI部位はこの連結によって再生され
なかった。次に、得られたプラスミドを大腸菌K12
DH5α細胞中に導入し、アンピシリン耐性コロニーを
選択し、それらをエステラーゼ活性について試験した。
いくつかの陽性クローンからプラスミドDNAを単離
し、それらを分析してそのHpaII-EcoRI挿入物の大
きさを決定した。活性な酵素をコード化する最も小さい
挿入物は2.3kbであった。このプラスミドベクターを
pNBHpE2.3と命名した。
【0058】さらにサブクローニング実験を行ったとこ
ろ、上記2.3kb挿入物の遠位末端にあるSalI-EcoR
I断片が機能的なpnbA遺伝子にとっては必要ないこ
とがわかった。pNBHpE2.3をまずHindIIIとSa
lIで消化し、これをHindIIIとSalIで消化したpU
C19に連結した後、大腸菌K12 DH5α細胞中に
導入した。この構築によって得られたプラスミドをpN
BH3S1.9と命名した。pNBH3S1.9は1.9k
bのHpaII-SalI挿入物を含有し、活性なPNBエステ
ラーゼタンパク質をコード化していた。このプラスミド
から得られる挿入DNAをpBluesript SK(−)[スト
ラタジーン製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]中にサブ
クローニングし、そのヌクレオチド配列を決定するべく
分析した。
ろ、上記2.3kb挿入物の遠位末端にあるSalI-EcoR
I断片が機能的なpnbA遺伝子にとっては必要ないこ
とがわかった。pNBHpE2.3をまずHindIIIとSa
lIで消化し、これをHindIIIとSalIで消化したpU
C19に連結した後、大腸菌K12 DH5α細胞中に
導入した。この構築によって得られたプラスミドをpN
BH3S1.9と命名した。pNBH3S1.9は1.9k
bのHpaII-SalI挿入物を含有し、活性なPNBエステ
ラーゼタンパク質をコード化していた。このプラスミド
から得られる挿入DNAをpBluesript SK(−)[スト
ラタジーン製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]中にサブ
クローニングし、そのヌクレオチド配列を決定するべく
分析した。
【0059】実施例3:大腸菌におけるpnbA遺伝子
の高レベル発現 クローン化したPNBエステラーゼ遺伝子の大腸菌にお
ける発現を、ベクターpNB106Rを構築することに
よって改善した。プラスミドpNB106Rはプラスミ
ドコピー数の制御に寄与するrop遺伝子を含有する(C
esareniら,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6313)。プ
ラスミドpNB106Rの制限酵素部位と機能地図を図
3に示す。
の高レベル発現 クローン化したPNBエステラーゼ遺伝子の大腸菌にお
ける発現を、ベクターpNB106Rを構築することに
よって改善した。プラスミドpNB106Rはプラスミ
ドコピー数の制御に寄与するrop遺伝子を含有する(C
esareniら,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6313)。プ
ラスミドpNB106Rの制限酵素部位と機能地図を図
3に示す。
【0060】A.大腸菌K12 DH5α/pNB10
6R、大腸菌K12 RV308/pNB106Rおよ
び大腸菌W ATCC11105/pNB106Rの構
築 異種遺伝子を改良型バクテリオファージラムダpLプロ
モーターから温度誘導的に発現させるべく、プラスミド
pNBH3S1.9から得られる1.9kbのDNA断片を
温度誘導性高レベル発現ベクターpHKY338中にサ
ブクローニングすることによってプラスミドpNB10
6Rを作成した。大腸菌K12 RV308/pHKY
338はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボラトリ
ー(NRRL)[米国農務省(イリノイ州61604ペオリ
ア)]の永久保存株に1992年1月31日付けで寄託さ
れており、受託番号NRRL B-18945の下で入手
することができる。このプラスミドは特に重要な2つの
DNA領域、即ち(i)大腸菌中での該プラスミドの複製
と維持を可能にするpBR322から誘導された配列で
あって、その中のpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子がラムダcI抑制遺伝子で置換されている配列および
(ii)テトラサイクリン遺伝子の下流に位置する改良型ラ
ムダプロモーターpL106(米国特許出願第07/7
39280号)がカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠(O
RF,オープンリーディングフレーム)に直に隣接して
いる配列、を含有する。上記プロモーターは“枠外"2
シストロン集合を介して上記ORFの転写を制御する(S
chonerら,1990,Methods in Enzymology 185:94)。プラ
スミドpHKY338は、NdeIとBamHIでの消化に
よってカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠を容易に除去
できるように構築された。ATG転写開始コドンの部位
にNdeI制限部位を有し、かつ、潜在的転写終止配列の
下流にBamHI互換性制限部位を有するORFはすべて
pHKY338中に挿入することができる。そうすれ
ば、これによって得られる挿入されたORFはバクテリ
オファージラムダpLプロモーターからの発現にとって
適正に並ぶことになる。
6R、大腸菌K12 RV308/pNB106Rおよ
び大腸菌W ATCC11105/pNB106Rの構
築 異種遺伝子を改良型バクテリオファージラムダpLプロ
モーターから温度誘導的に発現させるべく、プラスミド
pNBH3S1.9から得られる1.9kbのDNA断片を
温度誘導性高レベル発現ベクターpHKY338中にサ
ブクローニングすることによってプラスミドpNB10
6Rを作成した。大腸菌K12 RV308/pHKY
338はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボラトリ
ー(NRRL)[米国農務省(イリノイ州61604ペオリ
ア)]の永久保存株に1992年1月31日付けで寄託さ
れており、受託番号NRRL B-18945の下で入手
することができる。このプラスミドは特に重要な2つの
DNA領域、即ち(i)大腸菌中での該プラスミドの複製
と維持を可能にするpBR322から誘導された配列で
あって、その中のpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子がラムダcI抑制遺伝子で置換されている配列および
(ii)テトラサイクリン遺伝子の下流に位置する改良型ラ
ムダプロモーターpL106(米国特許出願第07/7
39280号)がカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠(O
RF,オープンリーディングフレーム)に直に隣接して
いる配列、を含有する。上記プロモーターは“枠外"2
シストロン集合を介して上記ORFの転写を制御する(S
chonerら,1990,Methods in Enzymology 185:94)。プラ
スミドpHKY338は、NdeIとBamHIでの消化に
よってカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠を容易に除去
できるように構築された。ATG転写開始コドンの部位
にNdeI制限部位を有し、かつ、潜在的転写終止配列の
下流にBamHI互換性制限部位を有するORFはすべて
pHKY338中に挿入することができる。そうすれ
ば、これによって得られる挿入されたORFはバクテリ
オファージラムダpLプロモーターからの発現にとって
適正に並ぶことになる。
【0061】クローン化した1.9kbのバチルス・ズプ
チリスDNAはNdeI部位を所望の位置に含有していな
かったので、pnbA ORFのATG転写開始部位に
それを導入する方法を開発した。この方法には、pnb
A遺伝子のアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を作成
するために別個の構築を行い、次にそれら2つの断片を
pHKY338ベクターから得られる第3の断片に連結
することが含まれる。上記3断片の構築を以下のように
達成した。
チリスDNAはNdeI部位を所望の位置に含有していな
かったので、pnbA ORFのATG転写開始部位に
それを導入する方法を開発した。この方法には、pnb
A遺伝子のアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を作成
するために別個の構築を行い、次にそれら2つの断片を
pHKY338ベクターから得られる第3の断片に連結
することが含まれる。上記3断片の構築を以下のように
達成した。
【0062】i)アミノ末端断片 PNBエステラーゼのアミノ末端部をコード化し、か
つ、そのATG転写開始部位の5'側に隣接するNdeI
部位を含有する261bpの断片をPCR技術(実施例2
Eを参照のこと)を用いて合成した。このPCR増幅は
次の2つのプライマーを用いて行った(左から右に5'か
ら3'の方向で記載する)。 1.PNBNDE1:AAAAAGGGAG AGAACCATAT GACTCATC
AA ATAG(配列番号7) 2.PNB5:TTGACATACA AGCAATCCTC(配列番号8)
つ、そのATG転写開始部位の5'側に隣接するNdeI
部位を含有する261bpの断片をPCR技術(実施例2
Eを参照のこと)を用いて合成した。このPCR増幅は
次の2つのプライマーを用いて行った(左から右に5'か
ら3'の方向で記載する)。 1.PNBNDE1:AAAAAGGGAG AGAACCATAT GACTCATC
AA ATAG(配列番号7) 2.PNB5:TTGACATACA AGCAATCCTC(配列番号8)
【0063】上で下線を付したPNBNDE1の配列は
NdeI制限部位を表す。このプライマーの最初の3塩基
はクローン化したPNBエステラーゼ遺伝子と合致しな
い。他方のプライマーPNB5はATG開始部位から2
15bp下流に位置するAccI部位の下流約25塩基対(b
p)にアニールする。上記増幅がもたらした261bpの断
片を、クロウ(Crowe)らが記述した方法(1991,Nuc.Acid
Res.19:184)に従い、これにわずかな変更を加えてプロ
テイナーゼK(トリチラチウム・アルブム由来のプロテ
アーゼ・タイプXXVIII)で処理した。次いでその断片を
標準的な方法を用いてNdeIおよびAccIで消化し、フ
ェノール抽出し、エタノール沈殿することによって、後
述の連結反応で使用する180bpの断片を作成した。
NdeI制限部位を表す。このプライマーの最初の3塩基
はクローン化したPNBエステラーゼ遺伝子と合致しな
い。他方のプライマーPNB5はATG開始部位から2
15bp下流に位置するAccI部位の下流約25塩基対(b
p)にアニールする。上記増幅がもたらした261bpの断
片を、クロウ(Crowe)らが記述した方法(1991,Nuc.Acid
Res.19:184)に従い、これにわずかな変更を加えてプロ
テイナーゼK(トリチラチウム・アルブム由来のプロテ
アーゼ・タイプXXVIII)で処理した。次いでその断片を
標準的な方法を用いてNdeIおよびAccIで消化し、フ
ェノール抽出し、エタノール沈殿することによって、後
述の連結反応で使用する180bpの断片を作成した。
【0064】ii)カルボキシ末端断片 本構築法ではアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を接
合するために上記ORFの内部にあるAccI部位を使用
する必要があったので、該1.9kb断片上の他のAccI
部位(SalI/AccI)を除去する必要があった。これを
次の2工程で達成した:(i)ORFの断片を放出させる
ためのHindIIIおよびSalIによるpNBH3S1.9
の消化、および(ii)上記放出断片の、HindIIIおよびX
hoIで消化したpBluescript SK(−)への連結。該
1.9kb断片のSalI/AccI部位をpBluescript S
K(−)のXhoI部位に挿入することによって3部位すべ
てが除去された。この連結混合物を大腸菌K12 DH
5α中に導入し、推定のクローンをスクリーニングし、
制限消化によって構造を確認することによって、該OR
F上にAccI部位が1つしかないpNBH3(SX)sk
を単離した。カルボキシ末端にBamHIを導入するには
もう1つの構築が必要であった。pNBH3(SX)sk
をEcoRIおよびKpnIで消化してORFの断片を放出
させ、次いでこの断片を、やはりEcoRIとKpnIで消
化したpUC19中に連結することによって、これを達
成した。この連結混合物をDH5α細胞中に導入し、次
いでクローンの選択と分析を行うことによって、該OR
F中に単一のAccI部位を持ち、かつ、そのカルボキシ
末端の下流に適切に位置するBamHI部位を含有するプ
ラスミドpNBEKucを単離した。
合するために上記ORFの内部にあるAccI部位を使用
する必要があったので、該1.9kb断片上の他のAccI
部位(SalI/AccI)を除去する必要があった。これを
次の2工程で達成した:(i)ORFの断片を放出させる
ためのHindIIIおよびSalIによるpNBH3S1.9
の消化、および(ii)上記放出断片の、HindIIIおよびX
hoIで消化したpBluescript SK(−)への連結。該
1.9kb断片のSalI/AccI部位をpBluescript S
K(−)のXhoI部位に挿入することによって3部位すべ
てが除去された。この連結混合物を大腸菌K12 DH
5α中に導入し、推定のクローンをスクリーニングし、
制限消化によって構造を確認することによって、該OR
F上にAccI部位が1つしかないpNBH3(SX)sk
を単離した。カルボキシ末端にBamHIを導入するには
もう1つの構築が必要であった。pNBH3(SX)sk
をEcoRIおよびKpnIで消化してORFの断片を放出
させ、次いでこの断片を、やはりEcoRIとKpnIで消
化したpUC19中に連結することによって、これを達
成した。この連結混合物をDH5α細胞中に導入し、次
いでクローンの選択と分析を行うことによって、該OR
F中に単一のAccI部位を持ち、かつ、そのカルボキシ
末端の下流に適切に位置するBamHI部位を含有するプ
ラスミドpNBEKucを単離した。
【0065】 iii)pHKY338から得られるベクター断片 pHKY338をNdeIとBamHIで消化してそのカナ
マイシン耐性遺伝子を除去し、その大制限断片をゲル単
離することによって、以下に記述する3断片連結反応用
のベクターを調製した。
マイシン耐性遺伝子を除去し、その大制限断片をゲル単
離することによって、以下に記述する3断片連結反応用
のベクターを調製した。
【0066】NdeI-AccI消化PCR断片(180b
p)、pNBEKucのAccI-BamHI断片(1.7kb)お
よびpHKY338のNdeI-BamHI断片(6kb)を用
いて、3断片連結を行った。これによって、温度誘導性
ラムダpL合成プロモーターの制御下にある全pnbA
ORFを含有するプラスミドベクターpNB106R
が生成した。得られたDNAを宿主株大腸菌K12 D
H5α中に導入した。次いで、プラスミドpNB106
Rを宿主株大腸菌K12 RV308および大腸菌W A
TCC 11105中に導入した。
p)、pNBEKucのAccI-BamHI断片(1.7kb)お
よびpHKY338のNdeI-BamHI断片(6kb)を用
いて、3断片連結を行った。これによって、温度誘導性
ラムダpL合成プロモーターの制御下にある全pnbA
ORFを含有するプラスミドベクターpNB106R
が生成した。得られたDNAを宿主株大腸菌K12 D
H5α中に導入した。次いで、プラスミドpNB106
Rを宿主株大腸菌K12 RV308および大腸菌W A
TCC 11105中に導入した。
【0067】実施例4:プラスミドpNB106Rで形
質転換した大腸菌K12 DH5α、大腸菌K12 RV
308および大腸菌W ATCC11105の培養によ
るPNBエステラーゼの合成 プラスミドpNB106Rで形質転換した大腸菌K12
DH5α、大腸菌K12 RV308および大腸菌W
ATCC11105の培養によるPNBエステラーゼの
合成を以下のように誘導した。上記株の凍結保存培養を
5μg/mlテトラサイクリンの入ったL-ブロスに植菌し
た。30℃で16時間生育させた後、細胞を新鮮なL-
ブロス+テトラサイクリンに継代(4%v/v)し、対数
増殖中期まで生育させた。培養の温度を40℃に上げる
ことによって酵素合成の誘導を達成した。定期的に培養
から試料を採取し、無細胞抽出物中の酵素活性を実施例
1に記述したように検定することによってPNBエステ
ラーゼ合成の速度を測定した。
質転換した大腸菌K12 DH5α、大腸菌K12 RV
308および大腸菌W ATCC11105の培養によ
るPNBエステラーゼの合成 プラスミドpNB106Rで形質転換した大腸菌K12
DH5α、大腸菌K12 RV308および大腸菌W
ATCC11105の培養によるPNBエステラーゼの
合成を以下のように誘導した。上記株の凍結保存培養を
5μg/mlテトラサイクリンの入ったL-ブロスに植菌し
た。30℃で16時間生育させた後、細胞を新鮮なL-
ブロス+テトラサイクリンに継代(4%v/v)し、対数
増殖中期まで生育させた。培養の温度を40℃に上げる
ことによって酵素合成の誘導を達成した。定期的に培養
から試料を採取し、無細胞抽出物中の酵素活性を実施例
1に記述したように検定することによってPNBエステ
ラーゼ合成の速度を測定した。
【0068】また、PNBエステラーゼタンパク質量の
相対的増大を監視することができるよう、無細胞抽出物
をSDS-PAGEでも分析した。
相対的増大を監視することができるよう、無細胞抽出物
をSDS-PAGEでも分析した。
【0069】実施例5:PNBエステラーゼの組換え大
腸菌株からの精製 以下に記述する方法によって大腸菌K12 DH5α/
pNB106RからPNBエステラーゼを精製した。そ
の概略を表5に示す。この方法を、実施例1に記述し表
4に要約したバチルスからの精製と比較することができ
る。バチルスからの精製が8工程を必要とし、4140
0mgの粗タンパク質から4.0mgの純粋な酵素が得られ
たのに対し、組換え大腸菌株からはわずか6工程でわず
か200mgの粗タンパク質から10mgの純粋な酵素が得
られたことに気付くであろう。このように組換え大腸菌
を供給源として使用した場合、より簡単なこの精製工程
が、天然の生産菌バチルス・ズプチリスを酵素供給源と
して使用する、より複雑な従来の精製工程より3250
倍効率的であった。
腸菌株からの精製 以下に記述する方法によって大腸菌K12 DH5α/
pNB106RからPNBエステラーゼを精製した。そ
の概略を表5に示す。この方法を、実施例1に記述し表
4に要約したバチルスからの精製と比較することができ
る。バチルスからの精製が8工程を必要とし、4140
0mgの粗タンパク質から4.0mgの純粋な酵素が得られ
たのに対し、組換え大腸菌株からはわずか6工程でわず
か200mgの粗タンパク質から10mgの純粋な酵素が得
られたことに気付くであろう。このように組換え大腸菌
を供給源として使用した場合、より簡単なこの精製工程
が、天然の生産菌バチルス・ズプチリスを酵素供給源と
して使用する、より複雑な従来の精製工程より3250
倍効率的であった。
【0070】実施例4の方法に従って生育させた大腸菌
K12 DH5α/pNB106Rの凍結細胞(5.4g)
を融解し、0.5mM EDTAと1mM β-メルカプトエタ
ノールを含有する10mMリン酸カリウム(pH7.0)(緩
衝液1)20ml中でホモジナイズした。この細胞ホモジ
ネートの遠心分離(28000×g,15分)によって無
細胞抽出物を得た後、これを10mM酢酸ナトリウム(p
H5.0)500mlに対して終夜透析した。その透析物を
2N NH4OHでpH7.0に調節し、硫酸アンモニウ
ム分画にかけた。45〜85%硫酸アンモニウム飽和度
で生成した沈殿物を100mM NaClの入った10mM
トリス塩酸(pH8.5)(緩衝液2)20mlに溶解し、こ
れを同緩衝液500mlに対して終夜透析した。その透析
物を、緩衝液2で平衡化したDE-52カラム(1.6×
20cm)に充填した。このカラムを100mlの緩衝液2
および100mM NaClを含有する10mM MES-N
aOH(pH6.5)(緩衝液3)200mlで洗浄し、緩衝
液3中の100mMから300mMへの直線的NaCl勾配
375mlを用いてPNBエステラーゼを溶出させた。1
80〜210mM NaClで溶出したエステラーゼ含有
分画を合し、これを限外濾過(アミコンPM-30膜)で
20mlに濃縮し、10mMトリス塩酸(pH8.0)(緩衝液
4)500mlに対して終夜透析した。透析したエステラ
ーゼを、緩衝液4で平衡化したp-アミノベンズアミジ
ン-アガロースカラム(1.0×20cm)に充填した。この
カラムを50mlの緩衝液4で洗浄した後、緩衝液4中の
0から300mMへの直線的NaCl勾配180mlを用い
てこのカラムからエステラーゼを溶出させた。120〜
150mM NaClで溶出したエステラーゼを集め、限
外濾過によって15mlに濃縮し、500mlの緩衝液2に
対して終夜透析した。その透析物を、緩衝液2で平衡化
したQ-セファロースカラム(1.0×20cm)に充填し
た。このカラムを50mlの緩衝液2、50mlの10mM
MES-NaOH(pH6.0)および100mM NaCl
(緩衝液5)で順次洗浄した後、緩衝液5中の100mM
から300mMへの直線的NaCl勾配150mlでこの
カラムからエステラーゼを溶出させた。180〜210
mM NaClで溶出したエステラーゼを集め、限外濾過
によって1mlに濃縮した。得られたエステラーゼ調製物
をSDS-PAGEで確認したところ、これは電気泳動
的に純粋であった。精製データを表5に要約する。
K12 DH5α/pNB106Rの凍結細胞(5.4g)
を融解し、0.5mM EDTAと1mM β-メルカプトエタ
ノールを含有する10mMリン酸カリウム(pH7.0)(緩
衝液1)20ml中でホモジナイズした。この細胞ホモジ
ネートの遠心分離(28000×g,15分)によって無
細胞抽出物を得た後、これを10mM酢酸ナトリウム(p
H5.0)500mlに対して終夜透析した。その透析物を
2N NH4OHでpH7.0に調節し、硫酸アンモニウ
ム分画にかけた。45〜85%硫酸アンモニウム飽和度
で生成した沈殿物を100mM NaClの入った10mM
トリス塩酸(pH8.5)(緩衝液2)20mlに溶解し、こ
れを同緩衝液500mlに対して終夜透析した。その透析
物を、緩衝液2で平衡化したDE-52カラム(1.6×
20cm)に充填した。このカラムを100mlの緩衝液2
および100mM NaClを含有する10mM MES-N
aOH(pH6.5)(緩衝液3)200mlで洗浄し、緩衝
液3中の100mMから300mMへの直線的NaCl勾配
375mlを用いてPNBエステラーゼを溶出させた。1
80〜210mM NaClで溶出したエステラーゼ含有
分画を合し、これを限外濾過(アミコンPM-30膜)で
20mlに濃縮し、10mMトリス塩酸(pH8.0)(緩衝液
4)500mlに対して終夜透析した。透析したエステラ
ーゼを、緩衝液4で平衡化したp-アミノベンズアミジ
ン-アガロースカラム(1.0×20cm)に充填した。この
カラムを50mlの緩衝液4で洗浄した後、緩衝液4中の
0から300mMへの直線的NaCl勾配180mlを用い
てこのカラムからエステラーゼを溶出させた。120〜
150mM NaClで溶出したエステラーゼを集め、限
外濾過によって15mlに濃縮し、500mlの緩衝液2に
対して終夜透析した。その透析物を、緩衝液2で平衡化
したQ-セファロースカラム(1.0×20cm)に充填し
た。このカラムを50mlの緩衝液2、50mlの10mM
MES-NaOH(pH6.0)および100mM NaCl
(緩衝液5)で順次洗浄した後、緩衝液5中の100mM
から300mMへの直線的NaCl勾配150mlでこの
カラムからエステラーゼを溶出させた。180〜210
mM NaClで溶出したエステラーゼを集め、限外濾過
によって1mlに濃縮した。得られたエステラーゼ調製物
をSDS-PAGEで確認したところ、これは電気泳動
的に純粋であった。精製データを表5に要約する。
【表5】
【0071】組換え大腸菌を酵素供給源として用いるこ
の新しい精製法はかなり簡単であるから、大規模生産に
これを適用した場合、同じ酵素をバチルス・ズプチリス
から得るのに必要な精製法より安価であろう。これは、
組換え大腸菌株中で得られるPNBエステラーゼの量が
かなり増大していることの直接的な結果である。
の新しい精製法はかなり簡単であるから、大規模生産に
これを適用した場合、同じ酵素をバチルス・ズプチリス
から得るのに必要な精製法より安価であろう。これは、
組換え大腸菌株中で得られるPNBエステラーゼの量が
かなり増大していることの直接的な結果である。
【0072】分子量、ウエスタンブロット分析および基
質特異性について、組換え大腸菌から精製したPNBエ
ステラーゼを天然の酵素と比較した。分子量の測定は上
記2つの供給源から得られる酵素について54000の
値を与え、またこれら2つの酵素調製物を天然精製エス
テラーゼに対して調製した抗体を用いて試験したとこ
ろ、同一の沈降素バンドが得られた。両酵素はセファク
ロルPNBエステル、セファクロル核PNBエステル、
ロラカルベフPNBエステル、およびロラカルベフ核P
NBエステルを加水分解した。天然のPNBエステラー
ゼと組換え大腸菌株中で生産される対応するPNBエス
テラーゼは機能的に同一であり、構造的にも巨視的には
同一物であると思われる。
質特異性について、組換え大腸菌から精製したPNBエ
ステラーゼを天然の酵素と比較した。分子量の測定は上
記2つの供給源から得られる酵素について54000の
値を与え、またこれら2つの酵素調製物を天然精製エス
テラーゼに対して調製した抗体を用いて試験したとこ
ろ、同一の沈降素バンドが得られた。両酵素はセファク
ロルPNBエステル、セファクロル核PNBエステル、
ロラカルベフPNBエステル、およびロラカルベフ核P
NBエステルを加水分解した。天然のPNBエステラー
ゼと組換え大腸菌株中で生産される対応するPNBエス
テラーゼは機能的に同一であり、構造的にも巨視的には
同一物であると思われる。
【0073】
【0074】配列番号:1 配列の長さ:22 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Gly Val His 20
【0075】配列番号:2 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジ:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Glu Asn Ile Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp 1 5 10
【0076】配列番号:3 配列の長さ:22 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe Gly Asn Leu Asp 1 5 10 15 Gly Leu Glu Xaa Met Ala Lys 20
【0077】配列番号:4 配列の長さ:15 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Gly Gln Trp Trp Phe Lys 1 5 10 15
【0078】配列番号:5 配列の長さ:41 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列 ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A 41
【0079】配列番号:6 配列の長さ:41 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 6 配列 TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CAC
ACAAGAA AATGGCGTCC A 41
ACAAGAA AATGGCGTCC A 41
【0080】配列番号:7 配列の長さ:34 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列 AAAAAGGGAG AGAACCATAT GAC
TCATCAA ATAG 34
TCATCAA ATAG 34
【0081】配列番号:8 配列の長さ:20 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列 TTGACATACA AGCAATCCTC 20
【図1】 SDS-PAGEによる移動度に対するタン
パク質標品およびPNBエステラーゼの分子量の片対数
プロット。
パク質標品およびPNBエステラーゼの分子量の片対数
プロット。
【図2】 プラスミドpNBE1の制限酵素部位および
機能地図。
機能地図。
【図3】 プラスミドpNB106Rの制限酵素部位お
よび機能地図。
よび機能地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:125) (C12N 15/55 C12R 1:125) (C12P 35/02 C12R 1:125)
Claims (5)
- 【請求項1】 実質的に精製された形態にあるp-ニトロ
ベンジルエステラーゼ。 - 【請求項2】 請求項1のPNBエステラーゼを実質的
に純粋な形態で調製する方法であって、次のa)〜m)
の工程を約0℃〜4℃の温度で行うことからなる方法。 a)PNBエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約pH7で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約45%〜80%飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 b)約pH7に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 c)その透析物を約pH5に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約pH8.5に調節する。 d)該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約pH7の緩衝液中の
0.05Mから0.3Mへの直線的なNaCl勾配を用いて
該樹脂からPNBエステラーゼを溶出させる。 e)工程dのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 f)工程eの濃縮物を、還元剤の存在下で約pH8.0
の多糖型ゲルを通して濾過する。 g)工程fのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、pH8.5に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 h)工程gの濃縮物を約pH8.5のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約p
H6の緩衝液中の0.1Mから0.3Mへの直線的なNaC
l勾配を用いて該樹脂からPNBエステラーゼを溶出さ
せる。 i)工程hのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH5.0に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 j)上記透析物を約pH6のリン酸カルシウム-セルロ
ースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で
約pH7の0.01Mから0.10Mへの直線的なリン酸カ
リウム勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出
させる。 k)工程jのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH8に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の存
在下で透析し、その透析物を集める。 l)上記透析物を約pH8のp-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約pH8の0Mから0.30Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出させ
る。 m)工程lのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 - 【請求項3】 PNBエステラーゼを発現させることが
できる組換え宿主細胞から実質的に精製された形態のP
NBエステラーゼを調製する方法であって、次の工程か
らなる方法。 a)PNBエステラーゼを含有する水性無細胞抽出物に
約pH7で硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム
濃度を約45%〜85%飽和度にし、得られた沈殿物を
集める。 b)約pH7に緩衝化した沈殿物の溶液を還元剤の存在
下で透析する。 c)その透析物を約pH5に酸性化し、沈殿を除去し、
該透析物を約pH8.5に調節する。 d)該透析物を弱アニオン交換樹脂でのクロマトグラフ
ィーにかけ、還元剤の存在下で約pH7の緩衝液中の
0.05Mから0.3Mへの直線的なNaCl勾配を用いて
該樹脂からPNBエステラーゼを溶出させる。 e)工程dのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮する。 f)その透析物を約pH8のp-アミノベンズアミジン-
アガロースでのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存
在下で約pH8の0Mから0.30Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼをそこから溶出させ
る。 g)工程fのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、pH8.5に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤の
存在下で透析する。 h)工程gの濃縮物を約pH8.5のアニオン交換樹脂
でのクロマトグラフィーにかけ、還元剤の存在下で約p
H6の緩衝液中の0.1Mから0.3Mへの直線的なNaC
l勾配を用いてPNBエステラーゼを該樹脂から溶出さ
せる。 i)工程hのPNBエステラーゼ含有溶出液を合し、濃
縮し、約pH5.0に緩衝化した濃縮物の溶液を還元剤
の存在下で透析し、その透析物を集める。 - 【請求項4】 セファロスポリンPNBエステルまたは
1-カルバセファロスポリンPNBエステルからp-ニト
ロベンジル基を除去する方法であって、該エステルを請
求項1のPNBエステラーゼと反応させることからなる
方法。 - 【請求項5】 該反応によってセファクロルまたはロラ
カルベフが生成する請求項4の方法。
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