KR930013102A - 바실러스로부터 정제된 파라-니트로벤질 에스테라제 - Google Patents

바실러스로부터 정제된 파라-니트로벤질 에스테라제 Download PDF

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KR930013102A
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dialysate
esterase
concentrate
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Application number
KR1019920024768A
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시게유끼 우수이
창-안 유
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원본미기재
일라이 릴리 앤드 캄파니
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin

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Abstract

본 발명은 바실러스 속 미생물로 부터 정제된 PNB에스테라제를 제공한다. 상기 효소는 약 54,000달론의 분자량을 갖는 단량체이다. 상기 PNB에스테라제는 세팔로스포린및 1-카바세팔로스포린 화합물의 PNB-에스테르를 유리산 형태로 탈에스테르화시키는 과정을 촉진한다. 본 발명은 또한 바실러스 종으로 부터 효소를 정제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 황산 암모늄 분별, pH처리, 음이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과, 흡착-탈착 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피의 조합을 포함한다.

Description

바실러스로부터 정제된 파라-니트로벤질 에스테라제
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 단백질 표준물화 PNB에스테라제의 분자량 대 SDS-PAGE에 의한 이동도의 반로그 플롯이다,
제2도는 플라스미드 pNBE1의 제한 효소 부위와 작용지도이다,
제3도는 플라스미드 pNB106R의 제한 효소 부위와 작용지도이다.

Claims (5)

  1. 충분히 정제된 형태의 p-니트로벤질-에스테라제.
  2. 하기단계(a)내지(m)을 포함하는, 제1항의 PNB에스테라제를 충분히 순수한 형태로 제조하는 방법 : (a) 약 PH7에서 PNB에스테라제를 함유하는 수성 무세포 추출물에 황산 암모늄을 가하여 약45%내지 80%포화도의 황산 암모늄 농도를 달성하고, 생성된 침전물을 수거하고, (b) 환원제의 종재하에 약 pH7로 완충된 침전물 용액을 투석시키고, (c)상기 투석물을 약 pH5로 산성화시키고, 침전물을 제거한 후, 투석물을 약 pH8.5로 조정하고, (d)상기 투석물을 약 음이온 교환 수지상에서 크로마토그래피 시키고, 약 pH7의 완충제중에서 환원제의 존재하에 0.05M내지 0.3NaCl의 선형 구배로 상기 수지로부터 PNB 에스테라제를 용출시키고, (e) 상기단계 (d)의 PNB에스테라제-함유 용출액을 모아서 농축시키고, (f) 환원제의 존재하에 약 pH8.0에서 폴라사카라이드-타입 겔을 통해 상기 단계(e)의 농축물을 여과시키고, (g) 상기 단계 (f)의 PNB-에스테라제 함유 용출액을 모아서 통축시키고, 환원제의 존재하에 pH8.5로 완충된 농축물의 용액을 투석시키고, (h)상기 단계 (g)의 농축물을 약 pH8.5에서 음이온 교환 수지상에서 크로마토그래피시키고, 약 pH6의 완충제중에서 환원제의 존재하에 0.1M내지 0.3M NaCl의 선형 구배로 상기 수지롤 부터 PNB 에스테라제를 용출시키고, (i)상기단계 (h)의 PNB에스테라제-함유 용출액을 모아서 농축시키고, 환원제의 존재하에 약 pH5.0으로 완충된 농출물 용액을 투석시킨후, 투석물을 수거하고, (j)상기 투석물을 약 pH6에서 인산칼슘-셀룰로즈상에서 크로마토그래피시키고, 환원제의 존재하에 약 pH7에서 0.01내지 0.10M인산 칼슘의 선형 구배로 상기 셀룰로즈로부터 PNB에스테라제를 용출시키고, (k)상기단계 (j)의 PNB에스테라제-함유용출액을 모아서 농축시키고, 환원제의 존재하에 약 pH8로 완충된 농축물의 용액을 투석시킨후, 투석물을 수거하고, (l)약 pH8에서 상기 투석물을 아미노벤즈아미딘-아가로즈상에서 크로마토그래피시키고, 환원제의 존재하에 약 pH8에서 0내지 0.30M NaCl의 선형 구배로 상기 아가로즈로부터 PNB에스테라제를 용출시키고, (m)상기단계 (l)의 PNB에스테라제-함유 용출액을 모아서 농축시킨다(이때, 상기단계(a) 내지 (m)은 약 0℃내지 4℃의 온도에서 수행한다.).
  3. 하기단계(a) 내지 (i)를 포함하는, PNB에스테라제를 발현시킬 수 있는 제조합 숙주 세포로부터 충분히 정제된 형태로 PNB에스테라제를 제조하는 방법 : (a) 약 pH7에서 PNB에스테라제를 함유하는 수성 무세포 추출물에 황산 암모늄을 가하여 약 45% 내지 85%포화도의 황산 암모늄 농도를 달성하고, 생성된 침전물을 수거하고, (b)환원제의 존재하에 약 pH7로 완충된 침전물 용액을 투석시키고, (C)상기 투석물을 약 pH5로 산성화시키고, 침전물을 제거한 후, 투석물을 약 pH8.5로 조정하고, (d)상기 투석물을 약 음이온 교환 수지상에서 크로마토그래피 시키고, 약 pH7의 완충제중에서 환원제의 존재하에 0.05M내지 0.3M NaCl의 선형 구배로 사익 수지로부터 PNB에스테라제를 용출시키고, (e)상기 단계(d)의 PNB에스테라제-함유 용출액을 모아서 농축시키고, (f) 약 pH8에서 상기 투석물을 P-아미노벤즈아미딘-아가로즈 상에서 크로마토그래피시키고, 환원제의 존재하에 약 pH8.0에서 0 내지 0.30M NaCl의 선형구배로 상기 아가로즈로부터 PNB에스테라제를 용출시키고, (g)상기 단계 (f)의 PNB-에스테라제함유 용출액을 모아서 농축시키고, 환원제의 존재하에 pH8.5로 완충된 농축물의 용액을 투석시키고, (h) 상기 단계(g)의 농축물을 약 pH8.5에서 음이온 교환수지상에서 크로마토그래피시키고, 약 pH6의 완충제중에서 환원제의 존재하에 0.1M 내지 0.3M NaCl의 선형구배로 상기 수지로 부터 PNB에스테라제를 용출시키고, (i) 상기단계(h)의 PNB에스테라제-함유 용출액을 모아서 농축시키고, 환원제의 종재하에 약 pH5.0으로 완충된 농축물 용액을 투석시킨후, 투석물을 수거한다.
  4. 세팔로스포린 PNB에스테르 또는 1-카바세팔로스포린 PNB에스테르를 제1항의 PNB에스테라제와 반응시킴을 포함하는, 상기 에스테르로 부터 p-니트로벤질 그룹을 제거하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기와 같이 생성된 세팔로스포린이 세파클로르 또는 로라카베프인 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
KR1019920024768A 1991-12-20 1992-12-19 바실러스로부터 정제된 파라-니트로벤질 에스테라제 KR930013102A (ko)

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