CN105732807B - 一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，其通过乳化制备油包水型灭活疫苗，然后通过猪伪狂犬病病毒活疫苗和灭活苗协同作用刺激羊体产生的免疫反应获得高中和效价的猪伪狂犬病病毒阳性血清。本发明减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险，为阳性血清的制备提供了新的思路。

Description

一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法。
背景技术
随着时代和国家发展，生物安全越来越受到国家和人民的重视，生物制品类以病毒或细菌为原始材料进行生产的产品的生物安全性也逐渐成为了政府监管的重中之重。同时我国很多疫苗确实存在着生物安全隐患，造成了养殖户的重大经济损失，人民恐慌，社会不稳定因素增加，因此在生产过程中要不断改进及增加检验操作项目，以杜绝因污染外源病毒而导致免疫失败或引发其他病毒引起的流行病暴发。
目前针对猪伪狂犬病病毒活疫苗的外源病毒检验存在着较大的制约因素，即无高效价的商品化的价格低廉的阳性血清，这对产品检验造成了一定的影响。目前，虽然也有用猪制备猪伪狂犬病病毒阳性血清的方法，但效价不高，仅可达到1:512，且因使用同源动物，其可能较复杂的携带外源性抗原抗体，纯净性难以保证，在实际检验过程中也难以应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用自备的免疫佐剂进行伪狂犬病病毒灭活疫苗的制备，并用该疫苗进行羊体免疫，从而提供一种高效价的猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备灭活疫苗：
1) 转移因子佐剂的制备：将有机相与转移因子溶液按体积比1:1混合，得到转移因子佐剂，所述有机相为卵磷脂、胆固醇和吐温-80的混合物，所述有机相中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1，所述转移因子溶液的浓度为6-8mg/ml；
2) 油相的制备：将白油、吐温-80和硬脂酸铝按照体积比94:6-7:1.5-2混合，得到油相；
3) 水相的制备：在猪伪狂犬病病毒抗原液（效价为107.5TCID50/ml）中加入猪伪狂犬病病毒抗原液1-1.5‰的甲醛，得到水相，然后将水相置于37℃水浴放置21-24h进行灭活，期间摇动3-4次，灭活后将水相放置于2-8℃保存备用；
4) 抗原的乳化：将上述转移因子佐剂与水相按照体积比1:1-3混合得到混合液，然后再按照体积比1:1将混合液加入上述油相中，乳化得到灭活疫苗；
其次，实施免疫方案：
1) 选择实验动物：选择3-6月龄的山羊为实验动物，且所述山羊对猪伪狂犬病，猪瘟，猪细小病毒，猪Ⅱ型圆环病毒，猪乙型脑炎，口蹄疫，羊蓝舌病，小反刍兽疫病，羊痘等的抗原及抗体均呈阴性；
2）免疫接种：分别对每只山羊进行3-5次免疫接种：
第1次免疫接种：对每只山羊肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒抗原液（效价≥106.5TCID50/ml）；
第2-5次免疫接种：第1次免疫接种后每隔7-14天分别对每只山羊进行肌肉多点注射上述步骤4）乳化得到的灭活疫苗，第2次免疫接种量为1-3ml，第3-5次免疫接种量为每只山羊每次依上次剂量增加4 ml（即依次为1-3、5-7，9-11，13-17ml）；
3) 采集山羊血清：最后1次免疫后21-28天采集山羊血清，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
进一步，所述水相的制备过程中，所述猪伪狂犬病病毒抗原液的效价为107.5TCID50/ml。
所述第1次免疫接种中，对每只山羊肌肉注射的猪伪狂犬病病毒抗原液的效价≥106.5TCID50/ml。
所述油相的制备过程中，白油、吐温-80、硬脂酸铝的体积比为94:6:1.5。
进一步，预实验过程中，最后1次免疫后每隔一周采集一次山羊清进行检测，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，做相对定量（血清做1:2倍比稀释）的检测，具体根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定方法进行检测，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清，最后收获血清的时间一般为最后一次免疫后的21-28天。因此，后续实验可直接采集最后一次免疫后21-28天的山羊血清进行检测，并收集目的血清。
所述猪伪狂犬病病毒阳性血清收集后，经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的猪伪狂犬病病毒阳性血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染后冻存备用。
本发明采用以上技术方案，通过使用转移因子佐剂、白油和灭活后猪伪狂犬病病毒抗原（Bartha-K61株)按照一定的比例进行乳化形成油包水型灭活疫苗，通过一定的免疫程序免疫山羊，从而可制备出中和抗体效价可达1:2048的阳性血清，1ml该血清可中和106.0TCID50/ml的猪伪狂犬病病毒抗原（Bartha-K61株)。本发明通过猪伪狂犬病病毒活疫苗和灭活苗协同作用刺激羊体产生的免疫反应获得高中和效价的阳性血清，减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险，为阳性血清的制备提供了新的思路。
具体实施方式
一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备灭活疫苗：
1) 转移因子佐剂的制备：将有机相与转移因子溶液按体积比1:1混合，得到转移因子佐剂，所述有机相为卵磷脂、胆固醇和吐温-80的混合物，所述有机相中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1，所述转移因子溶液的浓度为6-8mg/ml；
2) 油相的制备：将白油、吐温-80和硬脂酸铝按照体积比94:6-7:1.5-2混合，得到油相；
3) 水相的制备：在猪伪狂犬病病毒抗原液（效价为107.5TCID50/ml）中加入猪伪狂犬病病毒抗原液1-1.5‰的甲醛，得到水相，然后将水相置于37℃水浴放置21-24h进行灭活，期间摇动3-4次，灭活后将水相放置于2-8℃保存备用；
4) 抗原的乳化：将上述转移因子佐剂与水相按照体积比1:1-3混合得到混合液，然后再按照体积比1:1将混合液加入上述油相中，乳化得到灭活疫苗；
其次，实施免疫方案：
1) 选择实验动物：选择3-6月龄的山羊为实验动物，且山羊不带有猪伪狂犬病病毒抗原及抗体，猪瘟病毒抗原及抗体，猪细小病毒抗原及抗体，猪Ⅱ型圆环病毒抗原及抗体，猪乙型脑炎病毒抗原及抗体，口蹄疫病毒抗原及抗体，羊蓝舌病抗原及抗体，小反刍兽疫病病毒及抗体，羊痘抗原及抗体等；
2）免疫接种：分别对每只山羊进行3-5次免疫接种：
第1次免疫接种：对每只山羊肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒抗原液（效价≥106.5TCID50/ml）；
第2-5次免疫接种：第1次免疫接种后每隔7-14天分别对每只山羊进行肌肉多点注射上述步骤4）乳化得到的灭活疫苗，第2次免疫接种量为1-3ml，第3-5次免疫接种量为每只山羊每次依上次剂量增加4 ml（即依次为1-3、5-7，9-11，13-17ml）；
3) 采集山羊血清：最后1次免疫后21-28天采集山羊血清，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
猪伪狂犬病病毒阳性血清收集后，经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的猪伪狂犬病病毒阳性血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染后冻存备用。
实施例1
一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备灭活疫苗：
1) 转移因子佐剂的制备：将有机相与转移因子溶液按体积比1:1混合，得到转移因子佐剂，所述有机相为卵磷脂、胆固醇和吐温-80的混合物，所述有机相中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1，所述转移因子溶液的浓度为6mg/ml；
2) 油相的制备：将白油、吐温-80和硬脂酸铝按照体积比94:6:1.5混合，得到油相；
3) 水相的制备：在猪伪狂犬病病毒抗原液（效价为107.5TCID50/ml）中加入猪伪狂犬病病毒抗原液1‰的甲醛，得到水相，然后将水相置于37℃水浴放置21h进行灭活，期间摇动3次，灭活后将水相放置于2℃保存备用；
4) 抗原的乳化：将上述转移因子佐剂与水相按照体积比1:1混合得到混合液，然后再按照体积比1:1将混合液加入上述油相中，乳化得到灭活疫苗；
其次，实施免疫方案：
1) 选择实验动物：选择3-6月龄的山羊为实验动物，且山羊不带有猪伪狂犬病病毒抗原及抗体，猪瘟病毒抗原及抗体，猪细小病毒抗原及抗体，猪Ⅱ型圆环病毒抗原及抗体，猪乙型脑炎病毒抗原及抗体，口蹄疫病毒抗原及抗体，羊蓝舌病抗原及抗体，小反刍兽疫病病毒及抗体，羊痘抗原及抗体等；
2）免疫接种：分别对每只山羊进行3次免疫接种：
第1次免疫接种：对每只山羊肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒抗原液（效价≥106.5TCID50/ml）；
第2-3次免疫接种：第1次免疫接种后每隔7-14天分别对每只山羊进行肌肉多点注射上述步骤4）乳化得到的灭活疫苗，第2次免疫接种量为1-3ml，第3次免疫接种量为5-7ml；
3) 采集山羊血清：最后1次免疫后21-28天采集山羊血清，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
猪伪狂犬病病毒阳性血清收集后，经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的猪伪狂犬病病毒阳性血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染后冻存备用。
实施例2
一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备灭活疫苗：
1) 转移因子佐剂的制备：将有机相与转移因子溶液按体积比1:1混合，得到转移因子佐剂，所述有机相为卵磷脂、胆固醇和吐温-80的混合物，所述有机相中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1，所述转移因子溶液的浓度为8mg/ml；
2) 油相的制备：将白油、吐温-80和硬脂酸铝按照体积比94:7:2混合，得到油相；
3) 水相的制备：在猪伪狂犬病病毒抗原液（效价为107.5TCID50/ml）中加入猪伪狂犬病病毒抗原液1.5‰的甲醛，得到水相，然后将水相置于37℃水浴放置21-24h进行灭活，期间摇动4次，灭活后将水相放置于8℃保存备用；
4) 抗原的乳化：将上述转移因子佐剂与水相按照体积比1: 3混合得到混合液，然后再按照体积比1:1将混合液加入上述油相中，乳化得到灭活疫苗；
其次，实施免疫方案：
1) 选择实验动物：选择3-6月龄的山羊为实验动物，且山羊不带有猪伪狂犬病病毒抗原及抗体，猪瘟病毒抗原及抗体，猪细小病毒抗原及抗体，猪Ⅱ型圆环病毒抗原及抗体，猪乙型脑炎病毒抗原及抗体，口蹄疫病毒抗原及抗体，羊蓝舌病抗原及抗体，小反刍兽疫病病毒及抗体，羊痘抗原及抗体等；
2）免疫接种：分别对每只山羊进行4次免疫接种：
第1次免疫接种：对每只山羊肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒抗原液（效价≥106.5TCID50/ml）；
第2-4次免疫接种：第1次免疫接种后每隔7-14天分别对每只山羊进行肌肉多点注射上述步骤4）乳化得到的灭活疫苗，第2次免疫接种量为1-3ml，第3次免疫接种量为5-7ml，第4次免疫接种量为9-11ml；
3) 采集山羊血清：最后1次免疫后21-28天采集山羊血清，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
猪伪狂犬病病毒阳性血清收集后，经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的猪伪狂犬病病毒阳性血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染后冻存备用。
实施例3
一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备灭活疫苗：
1) 转移因子佐剂的制备：将有机相与转移因子溶液按体积比1:1混合，得到转移因子佐剂，所述有机相为卵磷脂、胆固醇和吐温-80的混合物，所述有机相中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1，所述转移因子溶液的浓度为7mg/ml；
2) 油相的制备：将白油、吐温-80和硬脂酸铝按照体积比94:6.5:1.5混合，得到油相；
3) 水相的制备：在猪伪狂犬病病毒抗原液（效价为107.5TCID50/ml）中加入猪伪狂犬病病毒抗原液1‰的甲醛，得到水相，然后将水相置于37℃水浴放置21-24h进行灭活，期间摇动3次，灭活后将水相放置于5℃保存备用；
4) 抗原的乳化：将上述转移因子佐剂与水相按照体积比1:2混合得到混合液，然后再按照体积比1:1将混合液加入上述油相中，乳化得到灭活疫苗；
其次，实施免疫方案：
1) 选择实验动物：选择3-6月龄的山羊为实验动物，且山羊不带有猪伪狂犬病病毒抗原及抗体，猪瘟病毒抗原及抗体，猪细小病毒抗原及抗体，猪Ⅱ型圆环病毒抗原及抗体，猪乙型脑炎病毒抗原及抗体，口蹄疫病毒抗原及抗体，羊蓝舌病抗原及抗体，小反刍兽疫病病毒及抗体，羊痘抗原及抗体等；
2）免疫接种：分别对每只山羊进行5次免疫接种：
第1次免疫接种：对每只山羊肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒抗原液（效价≥106.5TCID50/ml）；
第2-5次免疫接种：第1次免疫接种后每隔7-14天分别对每只山羊进行肌肉多点注射上述步骤4）乳化得到的灭活疫苗，第2次免疫接种量为1-3ml，第3次免疫接种量为5-7ml，第4次免疫接种量为9-11ml；第4次免疫接种量为13-15ml；
3) 采集山羊血清：最后1次免疫后21-28天采集山羊血清，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
猪伪狂犬病病毒阳性血清收集后，经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的猪伪狂犬病病毒阳性血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染后冻存备用。

Claims (5)

1.一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
首先，制备灭活疫苗：
1) 转移因子佐剂的制备：将有机相与转移因子溶液按体积比1:1混合，得到转移因子佐剂，所述有机相为卵磷脂、胆固醇和吐温-80的混合物，所述有机相中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1，所述转移因子溶液的浓度为6-8mg/ml；
2) 油相的制备：将白油、吐温-80和硬脂酸铝按照体积比94:6-7:1.5-2混合，得到油相；
3) 水相的制备：在猪伪狂犬病病毒抗原液中加入猪伪狂犬病病毒抗原液1-1.5‰的甲醛，得到水相，然后将水相置于37℃水浴放置21-24h进行灭活，期间摇动3-4次，灭活后将水相放置于2-8℃保存备用；
4) 抗原的乳化：将上述转移因子佐剂与水相按照体积比1:1-3混合得到混合液，然后再按照体积比1:1将混合液加入上述油相中，乳化得到灭活疫苗；
其次，实施免疫方案：
1) 选择实验动物：选择3-6月龄的山羊为实验动物，且所述山羊对猪伪狂犬病，猪瘟，猪细小病毒，猪Ⅱ型圆环病毒，猪乙型脑炎，口蹄疫，羊蓝舌病，小反刍兽疫病，羊痘的抗原及抗体均呈阴性；
2）免疫接种：分别对每只山羊进行3-5次免疫接种：
第1次免疫接种：对每只山羊肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒抗原液；
第2-5次免疫接种：第1次免疫接种后每隔7-14天分别对每只山羊进行肌肉多点注射上述步骤4）乳化得到的灭活疫苗，第2次免疫接种量为1-3ml，第3-5次免疫接种量为每只山羊每次依上次剂量增加4 ml；
3) 采集山羊血清：最后1次免疫后21-28天采集山羊血清，用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体试剂盒及细胞中和抗体效价检测法，确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述水相的制备过程中，所述猪伪狂犬病病毒抗原液的效价为107.5TCID50/ml。
3.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述第1次免疫接种中，对每只山羊肌肉注射的猪伪狂犬病病毒抗原液的效价≥106.5TCID50/ml。
4.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述油相的制备过程中，白油、吐温-80、硬脂酸铝的体积比为94:6:1.5。
5.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：最后1次免疫后每隔一周采集一次山羊清进行检测，直至确认山羊血清为猪伪狂犬病病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价为1:2048以上，即收获猪伪狂犬病病毒阳性血清。
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用牛驴羊制备鸡新城疫和传染性腔上囊病二联超免疫血清的方法比较及临床应用效果;黄嘉驷等;《中国兽医科技》;19991225;第29卷(第12期);摘要

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