CN101921729A - 端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法，属于遗传工程的细胞修饰领域，该方法包括传代培养皮肤成纤维细胞；用pCIneo-hTERT质粒转染正常成纤维细胞；筛选稳定转染的pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞阳性克隆并扩大培养。该方法为细胞组织工程提供一种安全、接近生理过程的标准的种子细胞，解决了现有方法中基因随机性整合、基因产物干扰细胞内生理途径等问题。

Description

端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法

技术领域

本发明属于遗传工程的细胞修饰领域，涉及一种细胞系及其建立方法和应用，具体涉及一种端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下可生长、分裂，但经过有限次数的传代以后，就会停止增殖，进而衰老和死亡。这样限制了体外培养细胞的进一步应用。为了给细胞组织工程提供标准的细胞系，学者们提出了多种建立永生化细胞株的方法。所谓“永生化”(immortalization)，就是指细胞处于连续的细胞周期而终止其发育进程，使细胞获得了无限的增殖能力。建立永生化细胞至少具有以下几点优势：可以在体外研究软骨细胞的分化与生长及增殖之间的关系。永生化的组织细胞可以考虑作为组织细胞工程的细胞库或基因治疗的靶细胞，前者为组织组织工程提供大量的经过预先处理和优化的组织细胞，真正做到“组织工程化”；后者则使基因治疗应用于组织细胞成为可能，因为正常组织细胞传代、增殖有限的缺点妨碍了基因转染阳性靶细胞的挑选、鉴定及回输。另外可以作为药理或毒理研究的标准细胞，有利于对各项实验结果进行比较，因为各个实验室的组织细胞来源不同，培养方法各异，传代千差万别，使得实验结果难以比较。而采用永生化细胞使得实验采用的组织细胞保持统一。

细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite Cell Line)，也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。建立永生化细胞系的方法包括肿瘤病毒、原癌基因、p53突变体等转染正常组织细胞来构建。肿瘤病毒包括腺病毒、猴肾细胞病毒、多瘤病毒等。其中猴肾细胞病毒转染比较常见。

猴肾细胞病毒(simian virus 40，SV40)，于60年代初被发现并分离，属多瘤病毒科，直径45nm，为20面体立体对称结构，壳粒数目为72，DNA分子量为3400kDa，由5,243个碱基对组成，它由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和两种肿瘤抗原(大T和小T抗原)组成。SV40病毒早期转录区转化基因(A基因)编码大T和小T抗原。大T抗原(95kDa)98％定位于细胞核内，具有ATP酶和DNA解旋酶活性，使蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化、ADP核糖基化和己酰基化以及活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，为细胞转化启动所必需，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须有大T抗原的连续表达。小T抗原(20kDa)定位于核内及胞质内，能反式激活RNA多聚酶II和III基因的启动子，以及c-myc和c-fos癌基因转录，使细胞质肌动蛋白缺失和细胞粘附性下降，它不是细胞转化所必需的，但可起加强作用，与大T抗原一道共同维持转化表型。

SV40介导的永生化受多种因素影响，涉及到病毒DNA的整合、端粒酶的活化、生长抑制因子的失活等多个方面。研究证实，SV40的大T抗原能延长细胞寿命、使细胞永生化的功能与其灭活三种生长抑制因子-pRB、p53和SEN6的功能有关。①视网膜母细胞瘤基因产物(product of retinoblastoma gene，pRB)在脱磷酸化时，借助RB功能区与转录因子E2F形成稳定的复合物(pRB-E2F)，从而抑制E2F的转录活性，使细胞不能进入S期。而SV40大T抗原能与脱磷酸化的pRB结合形成复合物，而使E2F游离，促进细胞进入S期。②p53基因定位于17号染色体(17p13.1)，编码由393个氨基酸组成的核磷蛋白，具有转录因子作用。正常的p53蛋白(野生型)在细胞周期G1期停滞时，检查DNA的完整性，并通过其过度表达使受损细胞进入凋亡，以确保DNA复制的完整性，避免子细胞出现DNA丢失。SV40大T抗原能与p53结合而灭活其转录功能，使细胞避开G1期停滞，进入增殖。③6号染色体长臂存在生长抑制因子SEN6，定位于6q27，它与受体蛋白酪氨酸激酶EphB3相作用，SEN6功能的丢失将会导致永生化。SEN6在复制衰老和永生化中的具体作用尚不清楚，但推测可能与信号转导通路有关。近来研究发现永生化上调蛋白-1和永生化上调蛋白-2与SV40介导的永生化也密切相关。RyooZY等将IMUP-1和IMUP-2基因稳定转染到NIH/3T3小鼠成纤维细胞株后，发现IMUP-1和IMUP-2过表达的细胞株生长增殖特性发生改变，丧失停泊依赖生长特性，在裸鼠体内浸润生长并形成肿瘤，表明IMUP-1和IMUP-2的异位过表达在转化基因表型的获得、体外致瘤性中发挥重要作用。

SV40转染是目前研究AST永生化使用最多的方法。感染人和啮齿动物细胞后，病毒DNA随机整合入宿主基因组，其早期区基因编码的大T抗原可导致细胞的永生化，这是建立永生化细胞株最常用的方法。SV40能使几乎任何一种人类细胞发生永生化，但其永生化率非常低。人乳头瘤病毒(HPV)16型或18型的E6和E7蛋白已经成功的将人的包皮细胞、角化上皮细胞等永生化。其它如腺病毒E1A基因和EB病毒可分别有效永生化大鼠肾细胞和人淋巴细胞。

细胞内许多原癌基因可编码生长因子等蛋白质，参与细胞增殖与分化的调控。如myc、c-Jun、c-ras等通过基因转染可介导目的细胞的永生化。P53是一种肿瘤抑制因子，而其突变体则能够使啮齿动物原代细胞永生化。

以上将细胞永生化均是通过把外源性病毒、原癌基因等导入目的细胞，其整合是随机的，其表达产物可干扰细胞内生理途径，发生非预期的改变，如失去分化特征和细胞周期检查点的控制。同时，通过外源性病毒、原癌基因等转染获得的是转化细胞而非正常细胞，其表型、核型等可发生改变，如接触抑制丧失、多倍体改变等。本发明从现有技术中进行细胞永生化时减少诸如这些表型、核型等的发生改变、基因随机性整合等问题出发得到本发明的研究成果。

发明内容

本发明的目的是提供一种端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法，解决了现有技术中构建永生化皮肤成纤维细胞时存在的基因随机性整合、基因产物干扰细胞内生理途径等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下：

一种端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系，发明目的是提供一种所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)传代培养皮肤成纤维细胞；

(2)用pCIneo-hTERT质粒转染正常成纤维细胞；

(3)筛选稳定转染的pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞阳性克隆并扩大培养。

优选的，所述步骤(1)中传代培养的皮肤成纤维细胞是对人体皮肤采用植块法进行分离皮肤成纤维细胞。

优选的，所述步骤(3)中筛选阳性克隆是采用G418药物进行筛选。

优选的，所述步骤(3)中筛选是在转染24小时后进行。

优选的，所述开始筛选时采用的G418药物的浓度为400μg/ml，挑单后维持浓度为200μg/ml。

优选的，所述方法还包括对稳定转染的pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞阳性克隆的检测步骤。

优选的，所述的检测方法是通过RT-PCR法来进行的；其使用的逆转录反应合成cDNA hTERT上下游引物为：

上游引物：5′CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3’；

下游引物：5’GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3’；

PCR反应条件：94℃预变性2min；PCR循环：94℃30s，53℃45s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min；PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

优选的，所述检测方法中采用的内参照GAPDH上下游引物为：

上游引物：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC 3’；

下游引物：5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’。

本发明的又一目的在于提供一种所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系在用作人类皮肤疾病研究和治疗相关疾病的药物中的应用。

本发明人经长期研究发现，细胞缺乏端粒酶导致分裂过程中端粒长度不断丢失是细胞衰老的主要机制之一，而导入外源性人端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)基因可以诱导细胞内端粒酶的活性，从而使端粒长度保持稳定，延长细胞生存期和增强细胞增殖能力。而且最重要的是，它类似于胚胎干细胞内存在的生理途径，因此，hTERT激活端粒酶而诱导细胞永生化是一种接近生理过程的途径，这样就为获得理想的组织工程皮种子细胞提供了有力保障。

本发明皮肤成纤维细胞永生化的方法，是选取人端粒酶催化亚单位hTERT对皮肤成纤维细胞进行转染，最终得到与正常成纤维细胞生物学行为接近、性状相对稳定的永生化皮肤成纤维细胞系。该细胞系不仅可以成为细胞组织工程皮肤的种子细胞来源之一，同时是一种延长体外培养细胞寿命并防止衰老的有效手段。

本发明的构建方法通过将hTERT的真核表达质粒pCIneo-hTERT转染原代培养的正常人皮肤成纤维细胞，转染后经筛选药物G418进行筛选两周后，挑取阳性抗性克隆，用有限稀释法将细胞克隆移至96孔板，待单个细胞克隆长大后扩大培养，用多种指标检测获得的稳定转染细胞株的永生化情况得到比较满意的结果。

与现有技术中已有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明技术方案得到的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系为一种安全、接近生理过程的标准的种子细胞；本发明技术方案中构建端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的方法是一种接近生理过程的途径，通过hTERT激活端粒酶而诱导细胞永生化，为细胞组织工程提供一种安全、接近生理过程的标准的种子细胞，解决了目前技术中存在的基因随机性整合、基因产物干扰细胞内生理途径等问题。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例组织块法原代培养的人成纤维细胞；其中普通光镜×100；

图2为本发明实施例稳定转染pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞图；

图3为本发明实施例端粒酶活性检测图；其中1为Hela细胞端粒酶活性检测(阳性对照)；2为第5代稳定转染pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞端粒酶活性检测；3为第5代未转染人成纤维细胞端粒酶活性检测；

图4为本发明实施例琼脂糖凝胶电泳检测稳定转染细胞中hTERT表达；其中M为DL2000 Marker，分子量从小到大依次为：100，250，500，750，1000，2000bp；

图5为本发明实施例第80代经转染的成纤维细胞；

图6为本发明实施例第40代未经转染的成纤维细胞；

图7为本发明实施例第80代经转染的成纤维细胞核型分析；

图8为本发明实施例Hela细胞的软琼脂培养(阳性对照)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建

人皮肤成纤维细胞的组织块培养

手术切取患者腹部皮肤(其它手术部位皮肤也可满足条件)，置于含有10万u/L氨苄青霉素和100mg/L硫酸链霉素的含0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，反复漂洗3-5次后，直到漂洗液清亮透明为止。剪弃表皮，脂肪和结缔组织后，再将皮肤尽量剪碎，越小越好，用PBS冲洗剪刀上的组织块。用弯头吸管将组织块在瓶底均匀摆置，每小块间距5mm左右。组织块放置好后，向瓶内滴入少许培养液，将培养瓶慢慢平放入37℃培养箱中，静止培养，动作要轻柔以免影响细胞贴壁。前3天内尽量减少观察次数或不做观察，以免影响组织贴壁以至培养失败。约一周左右组织块周围有成纤维细胞游离出，初次传代前不必勤换培养液，有代谢产物严重时才需更换培养液。每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况。直到成纤维细胞长满瓶底并能顺利穿代者视为培养成功；图1为组织块法原代培养的人成纤维细胞。

正常人成纤维细胞转染pCIneo-hTERT质粒和稳定转染阳性克隆的挑选

扩增并提取pCIneo-hTERT质粒。将培养的第3代人皮肤成纤维细胞接种入6孔板，按Lipofectamine^TM 2000说明书进行基因转染。转染后24小时以1∶10比例进行传代，48小时后加入400μg/ml筛选药物G418进行筛选。待对照组未转染细胞全部死亡后，将浓度减半为200μg/ml继续维持筛选，直至出现阳性细胞克隆，用有限稀释法将细胞克隆移至96孔板，待单个细胞克隆长大后扩大培养。

实施例2稳定转染的成纤维细胞系的检测和确证研究

稳定转染的成纤维细胞端粒酶活性检测

检测显示经转染后成纤维细胞能稳定地表达端粒酶活性，反映端粒酶阳性的以6碱基间距逐级递增的特征性梯度条带，最小碱基片段为50bp、其次为56、62及68片段。细胞传代超过80代后，检测端粒酶活性，同样可见特征性条带出现。

RT-PCR检测稳定转染的成纤维细胞hTERT的表达

提取第5代未转染人皮肤成纤维细胞、第5代转染人皮肤成纤维细胞和HeLa细胞的总RNA，HeLa细胞为阳性对照，逆转录反应合成cDNA hTERT上游引物：5′CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3’，下游引物：5’GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3’，PCR产物大小为145bp。内参照GAPDH上游引物：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC 3’，下游引物：5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’，PCR产物452bp。PCR反应条件：94℃预变性2min；PCR循环：94℃30s，53℃45s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

细胞形态观察

未转染的细胞随传代次数增加，细胞由长梭形变为扁平状，胞浆内出现较多颗粒。而转染细胞则一直呈长梭形，胞浆内很少见颗粒。

细胞倍增时间测定

经转染的细胞，传代次数已经超过80代，细胞的倍增时间约为3天，未出现细胞生长停滞现象。而未转染细胞在培养至30代左右即出现细胞生长停滞，细胞传代时间明显延长，约2周传代一次。

细胞衰老检测

β-半乳糖甘酶活性检测：未经转染的成纤维细胞传代至第25代就开始出现β-半乳糖苷酶阳性细胞，至30～40代，阳性细胞数达80％～90％，而转染细胞传代至80代后很少有β-半乳糖苷酶阳性细胞。

染色体核型分析

取处于对数生长期的第30代转染毛乳头细胞，加入终浓度为0.4g/ml的秋水仙素，37培养4h，收集细胞，经低渗、固定、制片后行Giemsa染色，油镜观察。现转染细胞已传代至80代，其细胞核型显示，共23对染色体，仍为2倍体细胞，染色体结构形态正常，未见断裂、异位和缺失等。

软琼脂克隆形成实验

采用软琼脂克隆形成实验观察细胞的悬浮生长能力。首先在24孔板中制备0.5％琼脂培养基的底层凝胶，取处于对数生长期的第3代未转染毛乳头细胞、第30代转染毛乳头细胞和HeLa细胞，制备单细胞悬液，按照500个/孔的密度制备0.3％琼脂培养基作为上层凝胶，培养2～3周，倒置显微镜下观察细胞克隆形成情况。

未转染细胞和转染培养90代细胞经3周培养后均不能在软琼脂内生长，而Hela细胞(人宫颈癌细胞株)则可经3周培养后在软琼脂内生长形成较大的细胞克隆。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>柯明哲

<120>端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法

<130>

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>1

CGGAAGAGTG TCTGGAGCAA                20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>

<400>2

GGATGAAGCG GAGTCTGGA                 19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>3

ACCACAGTCC ATGCCATCAC                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>4

TCCACCACCC TGTTGCTGTA                  20

Claims (9)

1.一种端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)传代培养皮肤成纤维细胞；

(2)用pCIneo-hTERT质粒转染正常成纤维细胞；

(3)筛选稳定转染的pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞阳性克隆并扩大培养。

2.根据权利要求1所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(1)中传代培养的皮肤成纤维细胞是对人体皮肤采用植块法进行分离皮肤成纤维细胞。

3.根据权利要求1所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(3)中筛选阳性克隆是采用G418药物进行筛选。

4.根据权利要求3所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(3)中筛选是在转染24小时后进行。

5.根据权利要求3所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述开始筛选时采用的G418药物的浓度为400μg/ml，挑单后维持浓度为200μg/ml。

6.根据权利要求1所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述方法还包括对稳定转染的pCIneo-hTERT质粒的人成纤维细胞阳性克隆的检测步骤。

7.根据权利要求6所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述的检测方法是通过RT-PCR法来进行的；其使用的逆转录反应合成cDNA hTERT上下游引物为：

上游引物：5′CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3’；

下游引物：5’GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3’；

PCR反应条件：94℃预变性2min；PCR循环：94℃30s，53℃45s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min；PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

8.根据权利要求6所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述检测方法中采用的内参照GAPDH上下游引物为：

上游引物：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC 3’；

下游引物：5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’。

9.一种权利要求1所述的端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系在用作人类皮肤疾病研究和治疗相关疾病的药物中的应用。

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