CN104694484B - 一种羊口疮病毒的快速分离方法 - Google Patents
一种羊口疮病毒的快速分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104694484B CN104694484B CN201510077329.2A CN201510077329A CN104694484B CN 104694484 B CN104694484 B CN 104694484B CN 201510077329 A CN201510077329 A CN 201510077329A CN 104694484 B CN104694484 B CN 104694484B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sheep
- virus
- cell
- culture
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种羊口疮病毒的快速分离方法，具体涉及利用牛睾丸细胞从患病羊及隐性带毒羊的外周血中分离羊口疮病毒的方法。其利用牛睾丸细胞，从羊口疮发病羊及隐性带毒羊的外周血中分离羊口疮病毒，为羊口疮病毒的分离提供了方便快捷的方法，为生产和科研提供便利。本发明一种羊口疮病毒的快速分离方法的步骤为：1）羊口疮病毒病料的采集与检测；2）病料的处理；3）羊口疮病毒的分离。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种羊口疮病毒的快速分离方法，具体涉及利用牛睾丸细胞从患病羊及隐性带毒羊的外周血中分离羊口疮病毒的方法。
二、背景技术
羊传染性脓疱俗称羊口疮（Orf ），是山羊和绵羊的一种由口疮病毒所致的人兽共患传染病，世界卫生组织（IOE）将该病列为需要申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病几乎分布于世界所有养羊的国家，自然情况下主要侵染山羊和绵羊，山羊较为易感。本病常呈群发性流行，3~6月龄羔羊最易感，成年羊发病较少，病羊和带毒羊是本病的传染源。病毒可随病羊的唾液、脓疱和水疱分泌物以及脱落的痂皮排出，其传播途径主要是经损伤的皮肤或粘膜而感染。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的饲槽、饲料、饮水、用具、垫草、牧场及厩舍等而感染。
目前，羊口疮病毒的分离都是从发病羊的结痂或者唇部皮屑，需要将结痂、唇部皮屑浸泡碾磨。结痂的采集必须等到羊群发病后，限制了病毒的分离，而且，采集结痂时会对羊的唇部造成破损，而且比较费时，严重时会导致出血，影响羊只采食；结痂碾磨过滤的过程中病毒的丢失会导致病毒分离的不成功，需要重新返工，并且传统的病毒分离方法需要将病毒盲传五代才会出现病变，比较费时费力。其他病毒的分离如，新城疫、禽流感，都是将发病动物的内脏组织剪碎、碾磨，若是同时处理多种组织极易造成交叉感染，影响病毒分离鉴定效果。因此，现在急需一种方便快捷的病毒分离方法为病毒的研究提供便利。
现有羊口疮病毒都是从结痂和患病羊的口唇皮屑中分离的，需要盲传5代后才会有病变，结痂和皮屑都需要进行浸泡和碾磨处理，比较费时费力。同时，结痂的采集比较费时，严重者会造成羊唇部出血，影响羊只采食。
三、发明内容
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种羊口疮病毒的快速分离方法，其利用牛睾丸细胞，从羊口疮发病羊及隐性带毒羊的外周血中分离羊口疮病毒，为羊口疮病毒的分离提供了方便快捷的方法，为生产和科研提供便利。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种羊口疮病毒的快速分离方法，其特征在于：所述的分离方法的步骤为：
1）羊口疮病毒病料的采集与检测；
2）病料的处理；
3）羊口疮病毒的分离。
所述的步骤1）中羊口疮病毒病料的采集来源于发病羊及隐性带毒羊的外周血，病料的检测方法为PCR检测，检测引物为F1L，目的片段437bp；
所述的步骤2）病料的处理的方法为反复冻融3次后，在3000r/min离心5min后, 取上清液，用等体积0.01M PBS（PH7.2-7.4）稀释，然后用0.22微孔滤膜过滤，得到滤液，在-20℃保存备用；
所述的步骤3）羊口疮病毒的分离方法为：病毒分离所使用的细胞为牛睾丸细胞，牛睾丸细胞的培养基为M199，培养基中添加体积比为10%的犊牛血清，牛睾丸细胞在37℃，5%CO2培养2-3天，待细胞铺满培养瓶底80%时，取1.5mL-2mL步骤2）所述滤液，接种牛睾丸细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1-1.5h后，加10mL细胞维持液，细胞维持液为含5%犊牛血清的M199培养基，换液后每隔24h轻轻晃动培养瓶，72h时将细胞培养物反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，为第1代无菌收集细胞培养物；取600uL第1代无菌收集细胞培养物接种牛睾丸细胞，按照第1代细胞培养物制备方法，制备第2代无菌细胞培养物；第2代无菌细胞培养物接种牛睾丸细胞后的第48h、72h可观察到细胞病变；收集第3代细胞病变培养物，该培养物中含有大量羊口疮病毒。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：病料采集于发病羊或者隐性带毒羊的外周血，病料采集省时，同时能保证病料的新鲜，不需要对病料进行浸泡碾磨处理，直接对血液反复冻融3次后使用，技术操作简单，省时；病毒经2次盲传之后就有病变，大大缩短了病毒分离的周期。
本发明尝试了从发病羊及隐性带毒羊外周血中分离羊口疮病毒，既能保证样品的新鲜度，又能及时采到样品、节约采样时间，
四、附图说明
图1为外周血PCR检测结果核酸电泳图；
图2为未接种羊口疮病毒细胞图；
图3为接种48h后病变，细胞变圆，脱落图；
图4为接种72h后大量细胞变圆，出现空斑图。
五、具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明为一种羊口疮病毒的快速分离方法，包括以下步骤：1）病料的采集与检测；2）病料的处理；3）羊口疮病毒的分离。采集患病羊的外周血1mL，NaI法提取外周血DNA，进行PCR检测，（PCR检测方法为本实验室建立），检测引物为F1L（片段大小：437bp）（PCR检测结果见图1）。取病毒阳性抗凝血反复冻融3次后，3000r/min离心5min，取上清液，用等体积无菌的0.01M PBS（PH7.2-7.4）稀释，0.22um滤膜过滤，得到滤液，滤液在-20℃保存备用；病毒分离所使用的细胞为牛睾丸细胞，牛睾丸细胞的培养基为M199，培养基中添加体积比为10%的犊牛血清，牛睾丸细胞在37℃，5%CO2培养2-3天，待细胞铺满培养瓶底80%时（见图2），取1.5mL～2mL滤液接种牛睾丸细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1-1.5h后弃去毒液，加10mL细胞维持液，细胞维持液为含5%犊牛血清的M199培养基，换液后每隔24h轻轻晃动培养瓶，72h时将细胞培养物反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，为第1代无菌收集细胞培养物。取600uL第1代无菌收集细胞培养物接种牛睾丸细胞，按照第1代细胞培养物制备方法，制备第2代无菌细胞培养物。第2代无菌细胞培养物接种牛睾丸细胞后的第48h、72h可观察到细胞病变（48h的细胞病变见图3，72h的细胞病变见图4）。取第2代细胞病变培养物600uL接种牛睾丸细胞，培养72h，培养条件同上述条件。收集72h时的培养上清和细胞，反复冻融3次，即获得第3代细胞病变培养物，该培养物中含有所需分离的羊口疮病毒。
以下实施利用与说明本发明，但不限制本发明的使用范围
羊口疮病毒的分离
1）病料的采集与检测：采集患病羊的外周血1mL，NaI法提取外周血DNA，PCR检测，检测引物为F1L（片段大小：437bp）。
2）病料的处理：取病毒阳性抗凝血反复冻融三次后，3000 r/min离心5 min，取上清液，用等体积无菌的0.01M PBS（PH7.2-7.4）稀释，0.22um滤膜过滤。
3）病毒分离与培养：取1.5 mL～2 mL滤液接种牛睾丸细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1-1.5h后弃去毒液，加10 mL细胞维持液，换液后每隔24h轻轻晃动培养瓶，72h后收毒，反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，为第1代无菌收集细胞培养物。取600uL第1代无菌收集细胞培养物接种牛睾丸细胞，按照第1代细胞培养物制备方法，制备第2代无菌细胞培养物。第2代无菌细胞培养物接种牛睾丸细胞后的第48h、72h可观察到细胞病变。收集第3代细胞病变培养物，该培养物中含有所需分离的羊口疮病毒。
本发明取10份羊口疮病原阳性外周血，都成功分离出羊口疮病毒，分离率100%，其中阴性带毒羊5只，发病羊5只。
Claims (1)
1.一种羊口疮病毒的快速分离方法，其特征在于：所述的分离方法的步骤为：
1）羊口疮病毒病料的采集与检测：
羊口疮病毒病料的采集来源于发病羊及隐性带毒羊的外周血，病料的检测方法为PCR检测；
2）病料的处理：
病料的处理的方法为反复冻融3次后，在3000r/min离心5min后, 取上清液，用等体积0.01M PBS稀释，然后用0.22微孔滤膜过滤，得到滤液，在-20℃保存备用；
3）羊口疮病毒的分离：
羊口疮病毒的分离方法为：病毒分离所使用的细胞为牛睾丸细胞，牛睾丸细胞的培养基为M199，培养基中添加体积比为10%的犊牛血清，牛睾丸细胞在37℃，5%CO2培养2-3天，待细胞铺满培养瓶底80%时，取1.5mL-2mL步骤2）所述滤液，接种牛睾丸细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1-1.5h后，加10mL细胞维持液，细胞维持液为含5%犊牛血清的M199培养基，换液后每隔24h轻轻晃动培养瓶，72h时将细胞培养物反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，为第1代无菌收集细胞培养物；取600uL第1代无菌收集细胞培养物接种牛睾丸细胞，按照第1代细胞培养物制备方法，制备第2代无菌细胞培养物；第2代无菌细胞培养物接种牛睾丸细胞后的第48h、72h可观察到细胞病变；收集第3代细胞病变培养物，该培养物中含有大量羊口疮病毒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510077329.2A CN104694484B (zh) | 2015-02-13 | 2015-02-13 | 一种羊口疮病毒的快速分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510077329.2A CN104694484B (zh) | 2015-02-13 | 2015-02-13 | 一种羊口疮病毒的快速分离方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104694484A CN104694484A (zh) | 2015-06-10 |
| CN104694484B true CN104694484B (zh) | 2018-04-06 |
Family
ID=53342041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510077329.2A Active CN104694484B (zh) | 2015-02-13 | 2015-02-13 | 一种羊口疮病毒的快速分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104694484B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533660A (zh) * | 2012-03-07 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | 一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法 |
| CN102533681A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | 一种山羊口疮病毒毒力弱化方法 |
-
2015
- 2015-02-13 CN CN201510077329.2A patent/CN104694484B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533681A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | 一种山羊口疮病毒毒力弱化方法 |
| CN102533660A (zh) * | 2012-03-07 | 2012-07-04 | 西北农林科技大学 | 一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 羊口疮病毒多重ＰＣＲ检测方法的建立;李前瑞等;《动物医学进展》;20131231;第34卷(第6期);36-38 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104694484A (zh) | 2015-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Steyer et al. | Hepatitis E virus in domestic pigs and surface waters in Slovenia: prevalence and molecular characterization of a novel genotype 3 lineage | |
| CN102816868B (zh) | 一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重pcr方法 | |
| Deka et al. | Detection of bovine herpesvirus-1 infection in breeding bull semen by virus isolation and polymerase chain reaction | |
| CN106591242B (zh) | 一株犬细小病毒毒株cpv-yh及其应用 | |
| CN103205511B (zh) | 一种用于检测鸽细环病毒的引物对及其应用 | |
| CN106367400A (zh) | 一株猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其分离培养方法和应用 | |
| CN106540249A (zh) | 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法 | |
| Kittigul et al. | A comparison of virus concentration methods for molecular detection and characterization of rotavirus in bivalve shellfish species | |
| CN103882018A (zh) | 一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用 | |
| Park et al. | Molecular detection and characterization of unclassified bovine enteric caliciviruses in South Korea | |
| CN104694484B (zh) | 一种羊口疮病毒的快速分离方法 | |
| CN107653230A (zh) | 一种ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用 | |
| CN104911153B (zh) | 一种分离禽偏肺病毒的方法 | |
| CN114196616B (zh) | 一种锦鲤鳍组织细胞系及其应用 | |
| Mahmoud et al. | An epidemiological study of sheep and goat pox outbreaks in the Sudan | |
| CN102876809A (zh) | 一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105886477A (zh) | 可用于制备vii型新城疫疫苗的病毒株及其编码基因 | |
| CN102242173A (zh) | 一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法 | |
| Jones et al. | Development of an optimized method for the recovery of infectious F-RNA coliphage MS2 from meat | |
| CN102680685B (zh) | 羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法 | |
| CN104745539B (zh) | 羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法 | |
| CN105779659A (zh) | 一种用于检测口蹄疫病毒o型的引物、试剂盒、使用方法及其应用 | |
| CN105925727A (zh) | 一种用于检测口蹄疫病毒a型和o型混合感染的引物、试剂盒、使用方法及其应用 | |
| CN108220254A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法 | |
| CN107236714B (zh) | 一种猪细小病毒的分离方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |