CN104099369A - 构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法，其是将编码至少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。该方法建立的饲养层细胞可以替代培养基中添加的细胞因子，一方面可以大大降低目前干细胞培养中因添加细胞因子造成的高成本，另外可针对不同物种干细胞的特性有针对性地建立表达特定细胞因子的饲养层细胞。本发明提供的方法操作简单，费用低廉，实用性强，可推广应用到各个物种不同类型干细胞的培养。

Description

构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域和干细胞领域，具体地说，涉及一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞（ES细胞，embryonic stem cells）是由早期胚胎内细胞团细胞（ICM细胞，Inner cell Mass）或原始生殖细胞（PGC细胞，Primordial germ cells）经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞,其具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。在体外抑制分化培养条件下可以对其进行各种遗传操作，通过胚胎嵌合和细胞核移植参与各种组织的发育，形成克隆动物。通过对体外ES的操作，除了克隆动物之外，ES细胞在生产转基因动物，药物筛选甚至在人类疾病治疗上都有不可比拟的用处。2006年，日本Yamanaka率先利用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子实现成纤维细胞向干细胞的转变。诱导多能干细胞（iPS细胞，induced pluripotent stem cells）具有和ES一样的干细胞特性。周琪课题组于2009年成功利用四倍体补偿技术证明了iPS细胞的全能性。

尽管应用前景广阔，但是ES细胞和iPS细胞的培养条件也相对苛刻。一方面要保证不断增殖，同时又要求不能分化。目前为止，无论是ES细胞系还在近年来兴起的iPS细胞，在体外培养过程中饲养层细胞和小分子例如白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor）、成纤维细胞生长因子（FGF，Fibroblast growthfactors）发挥了举足轻重的作用。

有关饲养层的不断探索发现，不同的饲养层在维持干细胞特性上存在差异，而且，MEF（小鼠胚胎成纤维细胞，Mouse Embryonic Fibroblast）作为国际上公认的最常用的饲养层细胞也有自身无法回避的缺点，例如，生命期有限，不能在体外长期传代，而且其产生促生长因子和抑制分化因子的能力也会随着传代时间的延长而逐渐减弱甚至丧失。再如，在人ES细胞培养过程中可能造成的交叉污染问题。无饲养层的培养体系虽然也有报道，但其对维持干细胞生长的稳定性还有待研究。

LIF是在干细胞培养中最常用的添加物。在干细胞体外培养过程中发挥着至关重要的作用。但是，LIF价格不菲。而且有相关的研究表明，小鼠和大鼠的LIF在序列上的同源性高达90%，但是，在大鼠ES的培养中发现，大鼠LIF要优于小鼠LIF。也就是说尽管不同物种的LIF同源性很高，但是差异依然存在。目前已经商品化的LIF仅有鼠源、人源和大鼠的，远远不能满足不同物种的需求。

基于上述原因，亟待建立一种能快速建立高效表达细胞因子饲养层细胞的方法。该方法使得饲养层和细胞因子都不再受物种来源的限制。一方面在研究中可用于优化体外培养体系，也可以建立同时表达多个细胞因子的饲养层细胞。另外，在实际应用中降低实验成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速构建能高效分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法，其是将编码至少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。

前述方法中，所述特定细胞因子包含白血病抑制因子（LIF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等。其中，LIF来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、猪、人等。

前述方法中，所述哺乳动物饲养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、猪胚胎成纤维细胞等。

前述方法中，将含有编码至少一种特定细胞因子的基因的质粒转化（优选电转化）到哺乳动物的饲养层细胞中，获得的转基因饲养层细胞可分泌表达特定细胞因子。

前述方法中，构建含有编码至少一种特定细胞因子的基因的表达载体，将构建的表达载体通过PB（PiggyBac）转座系统整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。

前述方法中，所述表达载体中含有启动子EF-1α（Human elongation factor-1alpha)或CAG（巨细胞病毒CMV的增强子和鸡β-actin启动子的组合体）。

前述方法中，所述表达载体中还含有药物筛选标记，如新霉素（neomycin)的抗药基因Neo等。

本发明的高效表达细胞因子的饲养层细胞的构建方法，通过建立表达细胞因子的转基因饲养层细胞，并通过饲养层细胞表达细胞因子的方式来替代细胞培养过程中培养基中添加的细胞因子。具体包括以下步骤：

1）构建PB转座系统的表达载体；

2）采用电转化的方式，将构建的表达载体整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中；

3）药物筛选得到阳性细胞；

4）阳性细胞扩繁，经Co-60照射细胞不再增殖，即得可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞。

由前述方法获得的可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞。

由前述方法获得的可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞在干细胞体外培养和分离中的应用。

本发明进一步提供用于检测权利要求8所述可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞的通用反向引物，所述引物为R：5′-GGGAGGTGTGGGAGGTTTT-3′。

具体地，本发明提供一种快速建立在猪成纤维细胞中分别表达小鼠、人和猪等物种LIF的方法。包括以下步骤：

1、构建表达不同物种LIF蛋白的表达载体。这些表达载体通过PB转座系统整合到基因组中表达。

2、转基因细胞的筛选。通过电转的方式将表达载体导入猪胚胎成纤维细胞中，通过氨基糖苷类抗生素（G418）筛选获得阳性转基因细胞群。

3、将转基因细胞制作成饲养层细胞。利用射线照射的方式处理细胞。

4、用制备的饲养层细胞培养细胞，观察培养的iPS细胞形态多能性等指标，以检测特制饲养层细胞的效果。

经过药物筛选后得到的细胞是成功转入外源表达载体的细胞。通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（western blots）可以从RNA水平和蛋白两个层面确认细胞因子的表达。阳性细胞用作饲养层细胞可以取代培养基中添加的细胞因子。

前述方法中，构建表达载体时，细胞因子的基因是合成序列，通过酶切连接的方式连入表达载体上。

前述方法中，建立转基因细胞的方法优选采用电转化的方式，电转使用Lonza公司（德国）电转仪，程序设置为A024。

前述方法中，每次电转使用的细胞数目为2×10⁶个，电击液用量为200μl。

前述方法中，电转时，表达载体和PB酶表达载体的重量比为3:1。每次电转用2×10⁶个细胞，相应使用6μg的表达载体和2μg的PB酶表达载体。

前述方法中，采用的表达系统是利用PB转座系统将外源表达载体整合到基因组中。

前述方法中，转基因饲养层细胞建系所用的培养基是普通小鼠胚胎成纤维细胞培养基，培养基中不添加LIF。

前述方法中，进行G418药物筛选，从而得到阳性细胞。

得到的阳性细胞在液氮中保存，待后续试验需要，可按需解冻扩繁使用。

前述方法中，将阳性细胞制备成饲养层细胞是通过Co-60射线照射的方式。

本发明提供了一种快速高效地建立能稳定表达特定细胞因子的饲养层细胞的方法，即将表达特定细胞因子的质粒电转到细胞中，通过药物筛选得到阳性细胞。该方法建立的饲养层细胞可以替代培养基中添加的细胞因子，一方面可以大大降低目前干细胞培养中因添加细胞因子造成的高成本，另外可针对不同物种干细胞的特性有针对性地建立表达特定细胞因子的饲养层细胞。本发明提供的方法操作简单，费用低廉，实用性强，可推广应用到各个物种不同类型干细胞的培养。

本发明的优点在于：

（一）本发明提供了一种高效、简便快速的方法，利用来源方便的细胞系制备表达所需的细胞因子的饲养层细胞，为干细胞的体外培养和大动物ES细胞的分离研究提供了一种优化的体外培养体系。有利于促进体外大动物ES细胞的分离研究，创建大动物ES细胞培养的最优条件。

（二）本发明的检测方法操作简单，费用低廉，实用性强，可广泛应用于不同物种各种类型干细胞的培养。

（三）可根据本发明的方法开发出相应的表达不同细胞因子的PB表达载体，按需表达所需的细胞因子。

（四）根据本发明的方法开发出的表达载体，其细胞因子的表达量显著高于普通商品化细胞中同种细胞因子的表达量，满足了干细胞培养基中对于特定细胞因子量的需求。

（五）可根据本发明的方法开发出相应的表达不同细胞因子的细胞系，为以后科研工作提供便利。

（六）本发明为体外干细胞培养体系的不断优化奠定了基础。

（七）通过设计合适的表达载体，还可以制备同时表达多个细胞因子的细胞系。

（八）本发明可以通过选用不同的启动子实现细胞因子表达量的调节。

附图说明

图1为本发明实施例1中从RNA转录水平和蛋白表达水平检测LIF的表达量；其中，A为本发明的饲养层细胞与商品化细胞STO和BRL中LIF的蛋白表达量对比以及使用不同启动子的PB载体LIF表达量与商品化饲养层细胞LIF表达量对比，B为本发明中饲养层细胞与商品化细胞STO和BRL中LIF的转录水平对比。

图2为本发明实施例2中使用本发明的饲养层细胞培养iPS细胞结果；其中，a为阳性对照，猪iPS克隆63312在添加LIF的2i中培养，使用普通饲养层细胞；b为阴性对照，猪iPS克隆63312在不添加LIF的2i培养基中培养，使用普通饲养层细胞；c为阴性对照，猪iPS克隆63312在2i不加LIF中培养，使用普通PEF（猪胚胎成纤维细胞）作为饲养层细胞；d为猪iPS克隆63312在2i不加LIF培养基中培养，使用PEF-mouse-LIF（过表达鼠源LIF的PEF）的饲养层细胞；e为猪iPS克隆63312在2i不加LIF培养基中培养，使用PEF-human-LIF（过表达人源LIF的PEF）的饲养层细胞；f为猪iPS克隆63312在2i不加LIF培养基中培养，使用PEF-pig-LIF（过表达猪源LIF的PEF）的饲养层细胞。

图3为本发明实施例3中使用本发明的饲养层细胞收集的条件培养基培养iPS细胞；其中，a为阳性对照，猪iPS克隆63312在添加LIF的2i培养基中培养；b为阴性对照，猪iPS克隆63312在未加LIF的2i培养基中培养；c为阴性对照，使用PEF（猪胚胎成纤维细胞）饲养层细胞收集的条件培养基（其中没有人工添加LIF），培养猪iPS克隆63312；d为使用PEF-小鼠-LIF饲养层细胞收集的条件培养基（其中没有人工添加LIF），培养猪iPS克隆63312；e为使用PEF-人-LIF饲养层细胞收集的条件培养基（其中没有人工添加LIF），培养猪iPS克隆63312；f为使用PEF-猪-LIF饲养层细胞收集的条件培养基（其中没有人工添加LIF），培养猪iPS克隆63312。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的培养基配方如下：

MEF培养基配方

成分	体积（单位：mL）
		DMEM(Gibco,11960)	82
FBS(Gibco,10099)	15
		NEAA(Gibco,11140)	1
GLuMAX(Gibco,35050)	0.5
		丙酮酸钠（Gibco,11360）	1
青霉素-链霉素(Gibco,15140)	0.5
		总计	100

mES培养基配方

成分	体积（单位：mL）
		DMEM(Gibco,11960)	82
ES FBS(Gibco,16141)	15
		NEAA(Gibco,11140)	1
GLuMAX(Gibco,35050)	0.5
		丙酮酸钠（Gibco,11360）	1
青霉素-链霉素(Gibco,15140)	0.5
		Vc（终浓度，0.050μg/mL)	0.1
LIF(Millpore,ESG1107，终浓度1000U/mL)	0.1
		2-巯基乙醇(Gibco,21985-023)	0.18
总计	100.38

2i培养基配方

成分	体积（单位：mL）
			N2（DMEM/F12,SKU#10565-042）	500
B27（Neurobasal,SKU#17502-048）	500
			青霉素-链霉素(Gibco,15140)	5
2-巯基乙醇(Gibco,21985-023)	1.8
			LIF(Millpore,终浓度1000U/mL)	1	1000×stock
PD0325901(Stemolecile,04-0006,终浓度1μM)	0.5	2000×stock
			CHIR99021(stemolecular,04-0004,终浓度3μM)	0.5	2000×stock
总计	1008.8

注：N2、B27培养基(Ying Q,Nature Biotechnology2003)

实施例1建立在猪成纤维细胞中分别表达小鼠、人和猪等物种LIF的方法

1实验材料：

表达因子选择的是在干细胞培养中的至关重要的LIF。

1.1载体

构建了6个表达载体，分别由EF1α启动子和CAG启动子起始表达人源、猪源和鼠源的LIF：

该系列表达载体是在质粒pEF1α-hOS的基础上构建得到的。原质粒用EF1α起始目的基因的表达，并且在表达基因下游有neo抗性基因作为筛选标记。通过酶切连接的方式将原质粒的表达基因替换为不同物种的LIF基因。不同物种LIF基因的编码序列由人工合成的方式克隆到pUc57质粒上，并且分别在上下游带有NheI和BamHI酶切位点。通过类似的酶切连接方法，又构建得到相应的由CAG启动子起始表达的LIF表达载体。不同物种LIF基因表达载体的核苷酸序列见序列表。

pEF1α-pLIF-neo（Seq ID No.3）、pCAG-pLIF-neo(表达猪源LIF，Seq ID No.6)

pEF1α-hLIF-neo（Seq ID No.2）、pCAG-hLIF-neo(表达人源LIF，Seq ID No.5)

pEF1α-mLIF-neo（Seq ID No.1）、pCAG-mLIF-neo(表达鼠源LIF，Seq ID No.4)

pCAG-4PBase（该载体表达PB酶，辅助载体整合到基因组中）

该系列表达载体在PB转座酶介导下整合到基因组中。由EF-1α启动子及CAG启动子起始LIF基因的表达。同时为了区分成功转LIF基因的细胞和不含外源LIF基因的细胞，该载体还加入了neo筛选基因。通过G418作用，杀死转基因失败的细胞。最终得到表达外源LIF的猪胚胎成纤维细胞。

1.2细胞系

筛选用的细胞是小香猪胚胎成纤维细胞（PEF），结合当前国内干细胞领域的研究重点猪iPS的研究情况。

2制备表达外源LIF的PEF细胞系

上述表达载体通过电转的方式转染细胞，使用Lonza公司（德国）电转仪。第一步是准备电转用的细胞，通常是选用状态好、代次低的细胞。本实施例中使用的是P1代PEF细胞，待到细胞长到80%以上即可用于实验。对于10cm培养皿培养的细胞，首先用真空泵吸出培养基，用PBS洗一次。然后加3mL TrypLE Express（Gibco）在37℃消化5min。加5mL MEF培养基终止消化。收集PEF细胞，计数。取2×10⁶个细胞离心，去上清。加200μl电击液重悬，按照3:1的比例加入6μg LIF表达载体和2μg PB酶表达载体，保证载体加入到电击液中，混匀。电击程序选用A024，电击后迅速向杯中加入1mL MEF培养基，混匀，转移到预先准备好的20mL培养基中，然后铺板到2个10cm培养皿中。24小时后用G418进行药物筛选，即在MEF培养基中加入G418至药物筛选浓度500μg/mL，持续5至8天。若表达载体成功整合到基因组中就会启动neo基因的表达，通过药筛，电转不成功或者整合失败的细胞将被杀死，余下生长的细胞都是有外源LIF基因表达的细胞。扩繁的细胞可以根据需要直接制备成饲养层用于细胞实验，也可在液氮中长期保存，以后根据实验需要复苏培养。药筛后得到的细胞可以通过RT-PCR和western blots从RNA水平和蛋白两个层面确认外源LIF的表达。从图1可以看出，本发明的饲养层细胞产生的LIF，无论是从RNA水平还是从蛋白水平，均有较高水平的表达。

3使用不同启动子PB载体的LIF表达量

EF-1α（Human elongation factor-1alpha)启动子是人类来源的组成型启动子，可用于驱动在各种体外和体内条件下的异位基因的稳定表达。在其他启动子如CMV（cytomegalovirus）启动子活性降低或者在胚胎干细胞中被沉默的时候，EF-1α启动子尤为有用。CAG（CMV early enhancer/chicken beta actin）启动子是CMV的增强子和鸡β-actin启动子的组合体，CAG启动子常用于驱动哺乳动物表达载体中基因的高水平表达。从western blots检测结果（图1B）可见，使用EF-1α启动子的表达量略低于商品化细胞STO和BRL，使用CAG启动子的载体其LIF的表达量明显高于商品化细胞STO和BRL中LIF的表达量。因此，可通过选择不同的启动子来调控细胞因子的表达量，满足不同的实验需要。在后续实验组中，一律选用LIF表达量更高的表达载体来进行后续的功能实验。

实施例2由表达LIF的猪成纤维细胞制成的饲养层细胞在细胞水平的功能验证

将实施例1中获得的表达LIF的猪成纤维细胞制备成的饲养层细胞来培养iPS细胞，阳性对照是用正常培养基（即添加商品化小鼠LIF的2i培养基）和小鼠饲养层细胞共同培养细胞克隆，阴性对照是用不加LIF的2i培养基和小鼠饲养层细胞共培养，实验组所用的培养基是不加LIF的2i培养基，饲养层细胞是制备的表达LIF的猪源饲养层。用于实验培养的猪iPS细胞是能稳定传代的细胞系，编号为63312。

1细胞复苏

1.1实验前准备

在37℃水浴锅中将细胞培养基预热；用75%酒精擦拭后，紫外照射超净台桌面20min；戴手套，喷洒酒精消毒；在超净台依次摆放已经消毒的吸管等用品，准备6孔板培养皿，并用Marker笔标记；

1.2迅速解冻

将细胞快速转移到37℃水浴锅中解冻，用夹子夹住快速摇动，避免缓慢融化对细胞造成伤害，直至内部还有少许冰碴，用75%的酒精喷洒消毒，放入超净台；

1.3加入培养液

（1）将解冻细胞加入到装有10mL培养基的15mL离心管中，轻轻吹打混匀。1000rpm离心5min，真空泵抽出上层废液。该步骤是为了避免DMSO伤害细胞。

（2）用适量预热的细胞液重悬细胞并轻轻吹打混匀。手持移液管上方防止污染，每个6孔板培养皿的孔加2-2.5mL培养基，防止晃动培养皿，造成细胞集中在中央，不均匀；静置半分钟后即可移至培养箱中培养。

（3）将细胞培养皿放置在37℃，5%-7.5%CO₂的培养箱培养。

1.4细胞培养换液

两天后，用真空泵弃上清，再轻轻加10mL培养液，以防止将贴壁细胞吹开。首先按照上述方法先铺合适密度的Co-60照射过的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞。饲养层细胞用的培养基是专门饲养成纤维细胞的MEF培养基。通常24小时后即可用于干细胞培养。

按照上述方法解冻猪iPS细胞，所用培养基是添加商品化小鼠LIF的2i培养基。

2细胞传代

1）真空泵抽出旧的培养基。

2）加入培养皿中适量PBS洗一次，PBS用量无严格要求。（2i培养基中无血清，该步骤可省）

3）6孔板每个孔加0.5-1mL TrypLE Express酶，放入培养箱中，37℃消化5-8min。

4）加入2倍TrypLE Express体积的含有血清的培养基（如MEF培养基）终止反应，吹打混匀。收集细胞消化液到15mL离心管中，1000rpm离心5min。

5）抽出废液，用适量体积的新鲜培养基重悬并混匀。

6）6孔板每个孔2.5-3mL，按照传代比例依次铺板。

将猪iPS细胞系63312按照1:20进行传代。大约4-5天后即可用于下次传代。图2结果表明，同样的iPS细胞在正常培养基中培养时，可见大量清晰的克隆，这些克隆致密，边界清楚，状态很好，表现出典型的干细胞的形态。如果培养基中不添加外源LIF时，则看不到有克隆或类似克隆的细胞团形成，而且有大量的死细胞漂浮，在正常培养基中长得很好的iPS细胞在缺少了LIF之后很难维持下去。而如果采用本发明制备的表达LIF的饲养层细胞来培养该iPS细胞时，大量形态很好的细胞克隆清晰可见，与2i培养基中培养的细胞类似，这些克隆表现出明显的干细胞的形态，而且生长状态良好。由此可见，本发明制备的饲养层细胞的确能代替外源LIF来维持干细胞的体外培养。

在实验组中，一样是用不添加LIF的培养基，但是，选择的饲养层细胞是事先制备的过表达不同物种LIF的饲养层细胞。结果发现，3个实验组中都有明显的克隆，而且这些克隆和阳性对照的克隆类似，边界清晰，状态良好。由此可知，无论表达的哪个物种的LIF，本发明制备的饲养层细胞都能够替代培养基中添加的LIF因子，起到维持iPS细胞的扩繁和增殖，并始终保持典型干细胞的形态。

其中，猪iPS细胞系63312的诱导建系方法如下：

1、细胞材料：小香猪胚胎成纤维细胞（PEF）

2、实验手段：采用电转的方式将表达载体转入细胞异位过表达诱导因子。电转仪购自Lonza公司，程序是按照相关说明设置的适合成纤维细胞的A024程序。

3、诱导因子表达载体为episomal表达系统，将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、Nr5a2七个诱导因子用2A序列串联表达。

4、诱导方法：

1）培养PEF（猪胚胎成纤维）细胞，使用的培养基为小鼠成纤维细胞培养基（MEF培养基）。

2）诱导电转前一天铺饲养层细胞，通常铺在10cm皿中。

3）PEF细胞长到80%以上时即可用于诱导。状态良好的PEF用TrypLE酶消化得到单细胞即可用于诱导。通常PEF细胞的胚胎在10cm中进行，以此为例，首先是用真空泵抽出培养基，加PBS约8mL洗1次，再用真空泵吸出PBS，然后加TrypLE酶2-3mL，37℃消化5min，然后用2倍TrypLE体积的带有血清的培养基终止消化，充分吹打混匀。对得到的细胞消化液计数。每次电转用2×10⁶个细胞，按照这个数目取相应体积的细胞消化液到15mL离心管中，在1000rpm条件下离心5min，小心的弃去上层废液，管底部的细胞准备电转。

4）电转过程：小心的用电击液重悬上述步骤离心收集的细胞，注意不要有气泡。2×10⁶个细胞需要200μL电击液。混匀之后，加入适量的诱导载体（通常诱导载体的量约1μg，浓度太低会影响电转效率）。按照3μg/10⁶个细胞来加诱导载体。确保一定加入。吹打几下混匀。将所得的细胞重悬液加到电击杯中，使用Lonza电转仪A024程序电转细胞。显示电转成功后，迅速加1mL培养基到电击杯中，小心吸打混匀转入事先准备的MEF培养基中，混匀准备铺板。

5）铺板：一次可电转2×10⁶个细胞，可进行不同密度细胞数的铺板。将饲养层细胞的培养基抽出，取特定细胞数相应体系的培养液，加MEF培养基补齐10mL。将饲养层细胞的培养基抽出，将电转后的细胞铺到有饲养层细胞的10cm皿中。

6）24小时后，换成mES培养基，并在培养基中加G418进行药物筛选。G418终浓度为5000μg/mL。

7）G418药物筛选持续5天。

8）停止G418筛选，换2i培养基继续培养，直至克隆长大。

9）约2周后，克隆清晰可见，挑单克隆消化成单细胞转至铺有饲养层细胞的24孔板中继续培养。

10）约1周后，克隆长大。可进行相关的细胞传代和冻存。获得是能稳定传代的猪iPS细胞系63312。

实施例3本发明的方法制备的饲养层细胞用作制备条件培养基

利用本发明制备的饲养层细胞来制备条件培养基。首先，选择未添加LIF的2i培养基来培养该发明制备的饲养层细胞。24小时后收集培养基，离心去除死细胞。将所收集的培养基在MEF饲养层的条件下直接用于培养iPS细胞。

选择本发明制备的3种不同的饲养层细胞用于条件培养基，这3个不同的细胞系分别过表达小鼠、人和猪源LIF。从细胞验证结果（图3）来看，不管是过表达哪种LIF，收集的条件培养基用于培养iPS细胞时，都能得到iPS边界清楚的iPS细胞。这些克隆均致密，保持典型的干细胞的状态。另外还发现，同是在MEF饲养层细胞上培养同一株iPS细胞，直接用不加LIF的培养基培养时，看不到克隆出现，甚至类似克隆的细胞团也看不到，相应地，大量的漂浮死细胞清晰可见。综上所述，利用本发明制备的细胞系并以此细胞系来制备条件培养基能维持iPS的生长，并且始终维持典型的干细胞形态。也就是说，利用该发明制备的细胞系能分泌足够量的LIF细胞因子来维持iPS生长，替代培养基中添加的LIF因子发挥作用。

在本发明中，通过药物筛选的方式来获得阳性转基因细胞。在此基础上，还从分子水平上进一步验证了外源基因的表达。通过RT-PCR验证了转入的外源基因确实被表达并且转录成了可以检测到的RNA。由于本发明中使用的载体是在同一个载体骨架上改造而来，选择的该反向引物位于原载体上表达基因后面的ployA尾巴上。因此，不管换成哪种外源因子，都可以用载体骨架上的一段共有的序列作为反向引物。而且，由于本发明的细胞实验中使用的PEF细胞本身是不含有这段ployA序列的，这也保证了外源基因的检测。以LIF为例，分别构建了表达人源、鼠源和猪源LIF的表达载体，在进行RT-PCR时，分别设计了3条引物针对人源LIF、鼠源LIF和猪源LIF的正向引物。实验结果表明，3种转基因细胞都检测到了相应的LIF外源基因的表达，但是，非转基因的PEF细胞不能得到相应的条带，也就是说只有转基因细胞才能有条带可见。同时，这条反向引物对该系列载体均适用。实验结果如图1.B所示，具体操作如下：

（一）RNA提取

按照Invitrogen Trizol使用说明书进行。

1、直接裂解筛选得到的阳性细胞：在培养皿中加Trizol,枪吸打几次裂解物。Trizol的用量是依据培养皿的面积而不是细胞数（约1mL/10cm²）Trizol用量不足会导致提取的RNA中污染DNA。

2、相分离

均质后的样品在15-30℃放置5min,使得核蛋白复合体充分解离。每使用1mLTrizol加0.2mL氯仿。盖上盖子，用手剧烈震荡15s,然后室温放置2-3min，2-8℃离心15min，转速不超过12000g，离心后分层3层。下层是红色的酚氯仿有机相，中间层和无色上层水相。RNA主要在水相。水相体积约为Trizol体积的60%。

3、沉淀RNA

转移水相到新的离心管中，用异丙醇沉淀RNA，每毫升Trizol加0.5mL异丙醇，室温放置10min。不超过12000g的转速，2-8℃离心10min。

4、洗RNA

弃上清。用75%乙醇洗RNA，每毫升Trizol至少用1mL乙醇。震荡混匀，不超过7500g的转速，2-8℃离心5min。

5、回溶RNA

风干或抽真空RNA，切勿在真空下离心，不要让RNA完全干了，这会影响它的溶解度。

部分溶解的RNAA260/280<1.6。用枪头吸打混匀。55-60℃孵育10min。

注意：在匀浆后加入氯仿之前，样品可以在-60～-70℃保存至少1个月，RNA沉淀在75%乙醇里2-8℃能保存至少1周，在-5～-20℃能保存1年。

（二）cDNA链第一条链的合成

M-MLV酶（promega,M1701,M-MLV）介导的逆转录操作过程：

1、在1支无核酸酶污染的小离心管中加入：

RNA                              2μg

引物                             1μg

无核酸酶水补齐至                 15μL

加热离心管到70℃，5min，打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构。

短暂离心，使溶液归于管底。

2、按以下顺序在复性的引物/模板管(即以上小离心管)中加入下列组分：

注意：不要改变引物与mRNA的比例。

3、轻弹离心管混合溶液。若使用随机引物，在37℃孵育60min进行反转录反应；若使用其它引物(Oligo(dT)或基因特异引物，则在42℃孵育60min，进行反应。

（三）RT-PCR检测外源基因表达

引物和PCR程序如下：

PCR程序：94℃30s,60℃30s,72℃45s;30个循环。

普通EB胶跑胶检测，即可观察到图1.B所示的结果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法，其特征在于，将编码至少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定细胞因子包含白血病抑制因子或成纤维细胞生长因子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物饲养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、猪胚胎成纤维细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建含有编码至少一种特定细胞因子的基因的表达载体，将构建的表达载体通过PB转座系统整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体中含有启动子EF-1α或CAG。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体中还含有药物筛选标记。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建PB转座系统的表达载体；

2）采用电转化的方式，将构建的表达载体整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中；

3）药物筛选得到阳性细胞；

4）阳性细胞扩繁，经Co-60照射细胞不再增殖，即得可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞。

8.由权利要求1-7任一项所述方法获得的可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞。

9.权利要求8所述可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞在干细胞体外培养和分离中的应用。

10.用于检测权利要求8所述可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞的通用反向引物，其特征在于，所述引物为R：5′-GGGAGGTGTGGGAGGTTTT-3′。