CN105518125A - 用于产生心外膜细胞的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于由hPSC获得心血管谱系细胞的方法和产物。用于由人类多能干细胞(hPSC)获得心肌细胞谱系或心外膜谱系细胞群体的方法包含以下步骤中的一个或多个：(a)使经过BMP组分预致敏的hPSC与适合于诱导所述hPSC分化成心血管中胚层细胞群体的心血管中胚层规划混合液在适合于所述规划混合液渗透所述hPSC的条件下接触，并且培养经过接触的hPSC持续一段时间以产生KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述心血管中胚层细胞群体与适合于指定NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续一段时间以产生NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体；以及(d)使所述心血管祖细胞群体与成熟混合液在适合于所述成熟混合液渗透所述心血管祖细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管祖细胞群体持续一段时间以产生心血管群体，任选地为表达心脏肌钙蛋白T(cTnT)和/或SIRPA的心肌细胞谱系细胞和/或表达WT1的心外膜谱系细胞。

Description

用于产生心外膜细胞的方法和组合物
相关申请
此是专利合作条约申请，其基于2013年9月13日提交的美国临时专利申请第61/877,618号的优先权要求35U.S.C.§119的权益，所述美国临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明提供用于由PSC(包括hPSC)产生心血管谱系细胞的方法和组合物，以及用于产生心肌细胞和心外膜谱系细胞群体的方法和组合物。
背景技术
在过去五年中，我们已经发展出引导人类胚胎干细胞(humanembryonicstemcell，hESC)和人类诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell，hiPSC)(统称为人类多能干细胞(humanpluripotentstemcell)；hPSC)分化成特定细胞类型，包括心血管谱系细胞类型的能力1、2。此成功很大程度上是基于将我们对模型生物体中谱系发育和组织形成的理解转换成hPSC分化培养物1。对于心血管系统，此方法已经引起建立复制发育关键阶段的分化方案，包括形成原条(primitivestreak，PS)样群体、诱导心血管中胚层以及由此中胚层指定心血管谱系3、4。发育生物学也已经告知我们控制此发育进程的关键调控途径，包括需要活化素A/结节素(nodal)和BMP4信号传导以产生PS/中胚层群体、和需要抑制β-连环蛋白(β-catenin)依赖性Wnt信号传导以指定中胚层最终成为心血管4。最近研究已经鉴别出对代表心血管发育不同阶段的细胞群体具有特异性的表面标记物。此标记物组包括见于心血管中胚层上的KDR和PDGFRα5和存在于心血管祖细胞和经分化心肌细胞上的SIRPA6。通过监测KDR+PDGFRα+群体的出现，已经展示不同hPSC系需要不同浓度的活化素A和BMP4以用于最佳中胚层诱导和心肌细胞发育5。
心外膜谱系来源于称为前心外膜器官(proepicardialorgan，PEO)的结构，所述结构在小鼠中大约在胚胎阶段(E)9.5时邻接于心脏发育7。特征在于表达转录因子维尔姆斯瘤1(WilmsTumor1，WT1)和TBX18的前心外膜细胞在循环过程期间从PEO迁移到早期心脏管，并且迅速地对其进行包封以形成外部上皮层，称为心外膜。心外膜对正常心脏发育而言至关重要，并且用于支持脑室细胞快速增殖和致密区心肌形成。其也是心脏中若干主要细胞类型的来源，包括心脏成纤维细胞、冠状血管平滑肌细胞和少量内皮细胞。这些经分化后代被称为心外膜源性细胞(epicardial-derivedcell，EPDC)，并且经由心外膜的上皮细胞向间叶细胞转化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)产生。谱系跟踪研究表明心外膜也是心肌细胞的来源8、9。然而，鉴于用于跟踪实验的基因的心外膜特异性不确定性，这些研究的解释已经受到质疑10。
心外膜产生多种因子，包括视黄酸(retinoicacid，RA)、成纤维细胞生长因子(fibroblast生长因，FGF)和胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，IGFs)，其中若干种对形成致密区心肌必需的脑室肌细胞增殖暂态阶段而言至关重要。最近的研究已经展示，IGF2是促进脑室增殖的关键性心外膜源性因子11，并且RA经由肝脏中促红细胞生成素(erythropoietin。EPO)的活化间接介导此功能，其随后在心外膜中诱导IGF212。也存在经由胸腺素β4(thymosinβ4，Tβ4)的活性进行心外膜心肌调控的证据，所述Tβ4是G-肌动蛋白单体结合蛋白13。Tβ4由发育中的心肌来产生，并且是正确心外膜发育和完整性所需的。
虽然正常成年人心外膜不表达WT1、TBX18或RALDH214，但如心肌梗塞的损伤将导致此‘胎儿’基因程序上调，以及导致群体内细胞增殖和EMT再活化。在梗塞期间注射Tβ4增强这些变化并且预防心肌死亡，很可能是经由从活化的心外膜细胞产生旁分泌因子14、15。成年人中的谱系跟踪研究表明，此活化的心外膜具有一定的产生新心肌细胞的能力，并且此心原性潜力通过用Tβ4使梗塞前的心脏预致敏来增强15。然而，与胎儿研究相同，此概念是有争议的，因为最近研究未能表明心外膜对梗塞后经Tβ4处理的心脏心肌的任何贡献14。
体外研究已经展示，外植体培养物中的心外膜细胞将经历EMT，并且响应于Notch16、TGFβ17-19和PDGFBB20或Tβ415而产生EPDC。来自用Tβ4预致敏的梗塞动物的心外膜细胞在体内分化成在外植体培养物中表达心肌细胞标记物的细胞15。
尽管这些进步已经使得能够由hPSC高效并可扩展地得到心肌细胞，但这些经分化群体对于许多应用不是最佳的，因为其含有不成熟的细胞并且不同心脏谱系细胞在其中包括心肌和心外膜的比例没有得到明确界定。为了实现hPSC在心血管研究和治疗性应用中的潜力，将很可能需要开发更准确表示人类心脏的培养系统和工程改造组织。
发明内容
一个方面包括一种由人类多能干细胞(hPSC)获得心血管谱系细胞群体，任选地心肌细胞谱系细胞群体或心外膜谱系细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)使经过BMP组分预致敏的hPSC与适合于诱导所述hPSC分化成心血管中胚层细胞群体的心血管中胚层规划混合液在适合于所述规划混合液渗透所述hPSC的条件下接触，并且培养经过接触的hPSC持续一段时间以产生KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述心血管中胚层细胞群体与适合于指定NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续一段时间以产生NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体；以及(d)使所述心血管祖细胞群体与成熟混合液在适合于所述成熟混合液渗透所述心血管祖细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管祖细胞群体持续一段时间以产生心血管群体，任选地为表达心脏肌钙蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)和/或SIRPA的心肌细胞谱系细胞和/或任选地表达WT1和/或包含心外膜源性细胞(EPDC)的心外膜谱系细胞。
本发明的其它特征和优点将由以下具体实施方式而变得显而易见。然而，应理解，具体实施方式和特定实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明方式给出，因为对于所属领域的技术人员，本发明的精神和范围内的各种变化和修改将由此具体实施方式而变得显而易知。
附图说明
现将与附图相关描述本发明的一个实施例，其中：
图1.由hESC变成心肌细胞的指定。用于使hESC朝向心肌细胞谱系分化的方案流程，其突出显示三个主要发育阶段：1)中胚层诱导，2)心血管指定和3)成熟。将来自活化素A/BMP4诱导第4天的胚状体(embryoidbody，EB)的细胞以单层形式接种在经明胶涂布的孔上。在VEGF(5ng/ml)、活化素/结节素(SB-4315425.4μM)和Wnt(DKK1150ng/ml)抑制剂的存在下，操控BMP路径持续48小时的时段(D4-D6)。在指定后，将培养物维持在VEGF中持续9天，并且随后通过流动式细胞测量术来分析cTnT+心肌细胞的存在。
图2.BMP4调控由hESC源性中胚层变成心肌细胞的指定。(a)流动式细胞测量术分析，其展示在无处理(对照组)、用BMP4(10ng/ml)或BMP4抑制剂头蛋白(Noggin)(400ng/ml)处理后，在第4天和第5天时存在KDR+和PDGFRα+群体，并且在培养第15天时存在cTnT+表达。(b)在如上处理的培养物中，在第15天时每孔的总细胞数目。误差条表示三个实验平均值的标准差。
图3.BMP信号传导剂量依赖性地由hESC源性中胚层指定心肌细胞。流动式细胞测量术分析的图形表示，其指示在由用指示量的BMP4或头蛋白处理的群体产生的第15天培养物中的cTnT+细胞百分比。NT＝无处理。条形表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，当与无处理相比较时**P≤0.01。
图4.心肌和心外膜标记物在BMP处理之后的qRT-PCR表达在由无处理(对照组)、经BMP4处理或经头蛋白(400ng/ml)处理的细胞产生的群体中，在培养第6、8、10、12和15天时对所指示的基因进行的基于qRT-PCR的表达。值是相对于管家基因TBP。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，当与无处理相比较时**P≤0.01。
图5.BMP4诱导的细胞表达心外膜标记物WT1.B。萤光免疫染色分析，其展示在培养第15天时，cTnT和WT1在无处理(对照组)、经BMP4(10ng/ml)和头蛋白(400ng/ml)处理的细胞中的存在。DAPI染色展示细胞核
图6.WT1+心外膜在传代后产生上皮细胞薄层。(a)相位衬度显微镜检查和荧光免疫染色，其展示在培养第15天时，经BMP4(10ng/ml)处理的心外膜细胞的形态以及ZO1和WT1的存在。DAPI染色展示细胞核。比例尺表示100μM。(b)相位衬度显微镜检查和荧光免疫染色，其展示在传代之后4天时(第15+4天)，经BMP4(10ng/ml)处理的心外膜细胞的形态以及ZO1和WT1的存在。DAPI染色展示细胞核。比例尺表示100μM。
图7.对第15天心肌细胞、第15天心外膜和传代后心外膜中细胞表面标记物表达的流动式细胞测量术分析。对在第15天心肌细胞、第15天心外膜和传代后4天(第15+4天)心外膜上所指示的标记物进行的流动式细胞测量术分析。灰色填充的直方图指示未染色的荧光强度。
图8.心肌细胞和心外膜细胞来源于第4天PDGFRα+中胚层。(a)由第4天EB分离PDGFR+和PDGFR-群体，并且在支持心肌细胞或WT1+细胞发育的条件下接种细胞。(b)流动式细胞测量术分析，其展示在于前心原性条件下接种的第15天培养物中的cTnT+细胞。(c)对WT1阳性细胞在前心外膜诱导条件(BMP4)下接种的第15天培养物中的存在进行的荧光免疫染色。DAPI染色展示细胞核。(d)在于前心外膜条件下培养后D15时，对在经过分选的群体中的心外膜标记物WT1和TBX18进行的基于qRT-PCR的表达分析。值是与未分选培养物相比较的倍数变化。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，未分选培养物**P≤0.01。
图9.BMP和Wnt信号传导调节心肌细胞和心外膜细胞指定。(a)流动式细胞测量术分析的图形描绘，其展示在由未经处理的细胞(对照组)或用BMP4(10ng/ml)或BMP抑制剂德索莫啡(Dorsomorphin，DM4μM)与指示量的DKK1或CHIR组合处理的细胞产生的第15天培养物中的cTnT+细胞百分比。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，当在对BMP路径进行所指示的操控的情形下与‘无Wnt处理’(NT)对照组相比较时**P≤0.01。(b)在由未经处理的细胞(对照组)或用BMP4(10ng/ml)或DM(4μM)与指示量的DKK或CHIR组合处理的细胞产生的第15天培养物上，对WT1表达进行的基于qRT-PCR的分析。值是相对于管家基因TBP。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，当在对BMP路径进行所指示的操控的情形下与‘无Wnt处理’(NT)对照组相比较时**P≤0.01。(c)流动式细胞测量术分析，其展示在由未经处理的细胞(对照组)或用BMP4(10ng/ml)或DM(4μM)与指示量的XAV939(XAV)组合处理的细胞产生的第15天培养物中的cTnT+细胞百分比和对WT1表达的qRT-PCR分析。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，当在特定BMP处理的情形下与无Wnt处理(参见图9a和9b)相比较时**P≤0.01。(d)流动式细胞测量术分析，其展示在由未经处理的细胞(对照组)或用BMP4(10ng/ml)或DM(4μM)与指示量的IWP2组合处理的细胞产生的第15天培养物中的cTnT+细胞百分比和对WT1表达的qRT-PCR分析。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，当在特定BMP处理的情形下与无Wnt处理(参见图9a和9b)相比较时**P≤0.01。
图10.由仙台病毒源性hiPSC和H7hESC产生WT1+心外膜细胞。(a)荧光免疫染色，其展示WT1和ZO1在hiPSC源性心外膜培养物中的表达。DAPI染色展示细胞核。流程指示操控和分析的时间安排。(b)荧光免疫染色，其展示WT1和ZO1在H7hESC源性心外膜培养物中的表达。DAPI染色展示细胞核。流程指示操控和分析的时间安排。
图11.WT1+心外膜细胞响应于TGFβ1和bFGF处理而进行EMT。(a)用于EMT诱导的方案流程。对第15天WT1+培养物进行传代，允许其静置1天，并且随后用TGFβ1(5ng/ml)处理4天接着无处理(TGFβ)，依序用TGFβ1(5ng/ml)处理4天接着用bFGF(10ng/ml)处理4天(TGFβ+bFGF)，或bFGF(10ng/ml)处理8天(bFGF)。培养物无处理充当对照组。(b)在EMT起始后8天时对培养物的细胞表面间叶细胞标记物CD90进行的流动式细胞测量术分析。灰色填充的直方图指示对照组培养物荧光强度。(c)在EMT起始之后第2、4、6和8天时对心外膜基因WT1和EMT诱导的基因SNAI1和SNAI2进行的基于qRT-PCR的表达。值表示为相对于实验匹配的第15天传代前WT1+培养物的倍数变化。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，与无处理对照组相比较**P≤0.01。
图12.WT1和ZO1表达响应于EMT而损失相位衬度和荧光免疫染色，其展示在使用所指示的因子进行EMT起始之后8天时，在心外膜培养物中的细胞形态和ZO1和WT1蛋白质的表达。DAPI染色展示细胞核。
图13.EPDC通过荧光免疫染色来显示成纤维细胞和血管平滑肌细胞标记物的特征表达。荧光免疫染色，其展示在使用所指示的因子进行EMT起始之后8天时，处于培养物中的α-平滑肌肌动蛋白(Smoothmuscleactin，SMA)和波形蛋白(Vimentin，VIM)蛋白质。DAPI染色展示细胞核。
图14.EPDC通过qRT-PCR来显示成纤维细胞和血管平滑肌细胞标记物的特征表达。在EMT起始之后8天时，在所指示的培养物中对平滑肌基因CCN1、MYH11、TAGLN和SMTN以及心外膜/心脏成纤维细胞基因TCF21进行的基于qRT-PCR的表达分析。值表示为相对于实验匹配的第15天传代前WT1+心外膜培养物的倍数变化。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，与无处理对照组培养物相比较**P≤0.01。
图15.hESC心外膜源性平滑肌样细胞在受刺激时产生作用电位。
(a)对于所指示得处理，测量EMT诱导的培养物中主动循环细胞的总比例。用TGFβ+bFGF处理产生响应于激动剂而具有最大比例主动循环细胞的群体。条形表示平均值的标准误差；N＝3/组；*P<0.05，由单向方差分析(one-wayANOVA)与图克事后测试(Tukeyposthoctest)比较时**P<0.01。
(b)在如基线处所指示的条件中和在NE和PE添加之后，在主动循环细胞中的钙循环频率。堆叠条形表示在基线记录(影线)期间和在NE(白色)或PE(黑色)处理之后对钙循环频率的贡献。
(c)在EMT诱导的培养物中，在NE和PE添加之后的钙瞬变振幅。无处理NEN＝6个细胞，PEN＝4个细胞；TGFβNEN＝6个细胞，PEN＝12个细胞；TGFβ+bFGFNEN＝13个细胞，PEN＝25个细胞。由单向方差分析与图克事后测试比较时*P<0.05。
(d)在EMT诱导的培养物中，在NE和PE添加之后的钙瞬变持续时间。无处理NEN＝6个细胞，PEN＝4个细胞；TGFβNEN＝6个细胞，PEN＝12个细胞；TGFβ+bFGFNEN＝13个细胞，PEN＝25个细胞。由单向方差分析与图克事后测试比较时**P<0.01。
图16.hESC心外膜源性成纤维细胞样细胞侵入3D凝胶。
(a)在EMT诱导之后D8时，在基质胶侵入分析的XY平面(俯视图)和3D重构(侧视图)中的代表性视野。
(b)在EMT起始后D8时的最大基质胶侵入深度。条形表示来自三个独立实验的值的平均值的标准误差(N＝3)；如由斯图登氏T检验(Student'sT-test)所分析，与未处理对照组相比较**P≤0.01。
图17.WT1+心外膜细胞在传代后上调ALDH1A2表达并且显示醛脱氢酶活性。(a)在D15WT+心外膜培养物和传代后第15+8天未处理心外膜培养物中对ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3进行的基于qRT-PCR的表达分析。值是相对于管家基因TBP。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，与ALDH1A2表达水平相比较**P≤0.01。(b)在EMT起始后第2、4、6和8天时对ALDH1A2进行的基于qRT-PCR的表达分析。值表示为相对于实验匹配的第15天传代前WT1+心外膜培养物的倍数变化。误差条表示来自三个独立实验的值的平均值的标准差(N＝3)；*P≤0.05，与无处理对照组培养物相比较**P≤0.01。(c)在由在第4到6天用DM(非心脏，非心外膜)、BMP4+XAV(心肌细胞)或BMP4+CHIR(WT1+心外膜细胞)处理的细胞产生的第15天群体上进行的Aldefluor流动式细胞测量术分析。(d)在使用所指示的处理起始EMT后8天时，在WT1+心外膜源性培养物上进行的Aldefluor流动式细胞测量术分析。
图18.展示由hPSC源性中胚层开始的心肌细胞、心外膜和EPDC发育分化流程。
具体实施方式
I.定义
如本文所用的术语“活化素组分”意味着包含使结节素信号转导活化的分子(任选地活化素A活性，如活化素A和/或结节素)的一种或多种组分、或包含所述组分的组合物、任选地培养基。
如本文所用的术语“活化素”或“ActA”是指“活化素A”(例如基因ID：3624)，例如人类活化素A，以及其活性结合物和片段，任选地包括天然存在的活性结合物和片段，其可以例如使结节素信号转导以及其活性结合物和片段(包括天然存在的活性结合物和片段)活化。
如本文所用的术语“活化素/结节素抑制剂”和/或“活化素/结节素/TGF-βR抑制剂”意味着抑制活化素/结节素路径信号的任何分子，并且尤其意味着抑制受体ALK4、ALK7和/或TGF-βRI的任何分子，包括(但不限于)SB431542(西格玛阿尔德里奇公司(SigmaAldrich))A83-01(托克里斯公司(Tocris)，2929)、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、SB505124、SB525334(西格玛阿尔德里奇公司)以及SD208。
如本文所用的术语“wnt抑制剂”意味着抑制wnt信号传导的任何试剂(包括任何化合物和/或蛋白质)，包括(但不限于)结合于Wnt配位体自身或Wnt受体的wnt拮抗剂，如Dickkopf(Dkk)蛋白质、Wnt抑制因子-1(WntInhibitoryFactor-1，WIF-1)和分泌性卷曲相关蛋白质(secretedFrizzled-RelatedProtein，sFRP)；以及wnt反向激动剂(例如与激动剂结合于相同受体但诱导与激动剂药理学响应相反的响应的试剂)。Wnt抑制剂的实例包括XAV939、IWP2(wnt加工抑制剂)和iCRT14(其是β-连环蛋白反应性转录(catenin-responsivetranscription，CRT)的强力抑制剂)，其中两者都可购自托克里斯生物科学公司(TocrisBioscience)，以及其组合。
如本文所用的术语“wnt组分”意味着在心血管细胞中使wnt/β-连环蛋白受体信号传导活化的任何分子，并且包括例如Wnt3a和以及GSK3选择性抑制剂，如CHIR99021(StemoleculeTMCHIR99021，干细胞试剂公司(Stemgent))、6-溴靛红-3'-肟(6-BromoIndirubin-3'-Oxime，BIO)(开曼化学品公司(CaymanChemical)(目录号：13123))或来自干细胞试剂公司的StemoleculeTMBIO(目录号：04003)。CHIR99021是GSK3的选择性抑制剂。所涵盖的GSK3选择性抑制剂是例如针对Wnt信号传导路径中GSK-3α/β的选择性抑制剂。
如本文所用的术语“FGF组分”意味着使FGF信号传导路径活化(例如结合FGF受体并使之活化)的分子，如细胞因子，包括例如FGF或小分子。如本文所用的术语“FGF”是指任何成纤维细胞生长因子，例如人类FGF1(基因ID：2246)、FGF2(也被称作bFGF；基因ID：2247)、FGF3(基因ID：2248)、FGF4(基因ID：2249)、FGF5(基因ID：2250)、FGF6(基因ID：2251)、FGF7(基因ID：2252)、FGF8(基因ID：2253)、FGF9(基因ID：2254)以及FGF10(基因ID：2255)，任选地包括其活性结合物和片段，包括天然存在的活性结合物和片段。在某些实施例中，FGF是bFGF、FGF10、FGF4和/或FGF2。
如本文所用的术语“BMP组分”意味着使BMP4受体活化的任何分子，任选地任何BMP或生长和分化因子(growthanddifferentiationfactor，GDF)，包括例如BMP4和BMP2，
如本文所用的术语“BMP抑制剂”意味着BMP信号传导的任何抑制剂，并且包括例如1型BMP受体抑制剂、BMP配位体和/或可溶性BMP受体。任选地选自德索莫啡(dorsomorphin，DM)、头蛋白、脊索蛋白(Chordin)、LDN-193189、可溶性BMPR1a和/或可溶性BMPR1b。
如本文所用的术语“BMP4”(例如基因ID：652)是指骨形态生成蛋白4，例如人类BMP4，以及其活性结合物和片段，任选地包括天然存在的活性结合物和片段，其可以例如使BMP4受体信号传导活化。
如本文所用的术语“经过BMP组分预致敏的hPSC”意味着已经与BMP组分接触至少12小时、优选地至少24小时或更优选地至少48小时的hPSC。典型地，这些细胞处于胚状体或单层培养物中。
术语“心血管谱系细胞”是指以下细胞：其表达心血管中胚层、心肌细胞或心外膜基因表达谱，例如表达KDR、PDGFRα、NK2同源盒5(NK2homeobox5，NKX2-5)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、信号调控蛋白α(signal-regulatoryproteinalpha，SIRPA)或维尔姆斯瘤1(WT1)，并且经过预致敏或具有如本文所描述的分化成心肌细胞谱系细胞和/或心外膜谱系细胞或心外膜源性细胞(EPDC)、如血管平滑肌样细胞或成纤维细胞样细胞的能力。
如本文所用的术语“心血管中胚层规划混合液”是包含BMP组分和活化素组分和任选地FGF组分的组合，并且使所述心血管中胚层规划混合液与hPSC接触约3到约5天。
如本文所用的术语“心血管祖细胞指定混合液”意味着用于指定NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的一种或多种组分、包含所述组分的组合物，例如用于指定NKX2-5+心肌细胞谱系祖细胞群体的心肌细胞促进组分或用于指定WT1+心外膜谱系祖细胞群体的心外膜促进组分。
如本文所用的术语“心肌细胞促进组分”意味着以下一种或多种组分或包含所述组分的组合物，所述一种或多种组分包含：1)任选地选自DKK1、XAV939和IWP2的Wnt抑制剂与BMP组分的组合，任选地其中所述BMP组分是浓度为至少0.01ng/mL、至少0.05ng/mL、至少0.1ng/mL、至少0.5ng/mL、至少1.25ng/mL、至少2.5ng/mL、至少5ng/mL但小于10ng/ml或小于15ng/mL或优选地为约0.5ng/mL的BMP4；或2)BMP抑制剂，如头蛋白或德索莫啡，例如浓度小于200ng/mL、小于150ng/mL、小于100ng/mL、小于50ng/mL或小于25ng/mL且/或大于12.5ng/mL的头蛋白；3)Wnt抑制剂，例如其中产生有足够内源性BMP4；和/或4)心肌细胞谱系浓度的BMP组分，任选地BMP4，例如其中所述BMP4的浓度小于0.63ng/mL、小于0.5ng/mL、小于0.4ng/mL或小于0.3ng/mL。有效浓度和/或组合可以通过监测和优化NKX2-5表达和/或TNNT2/cTnT表达来确定。
如本文所用的术语“心外膜谱系促进组分”意味着以下一种或多种组分或包含所述组分的组合物，所述一种或多种组分包含心外膜谱系促进浓度的BMP组分(任选地BMP4)和任选地Wnt组分。任选地，BMP4的浓度是至少1.25ng/mL、至少2.5ng/mL、至少5ng/mL或至少10ng/mL，且/或Wnt组分是CHIR99021。有效浓度和/或组合可以通过监测和优化WT1表达、碱核蛋白1(basonuclin1，BNC1)表达、膜联蛋白A8(annexinA8，ANXA8)表达和/或T盒18(T-box18，TBX18)表达来确定。
如本文所用的术语“心肌细胞谱系细胞”是指本身为NKX2-5+并且可以例如使用本文所描述的方法来分化成心肌细胞的细胞。
如本文所用的术语“心外膜谱系细胞”是指本身为WT1+并且可以例如使用本文所描述的方法来分化成心外膜细胞的细胞和/或心外膜源性细胞(EPDC)。
如本文所用的术语“培养”包括维持和/或繁殖细胞群体(包括单层、珠粒、烧瓶或3D培养物)的任何体外方法，任选地其中环境条件如在培育箱中受控并且任选地涉及细胞传代。
如本文所用的术语“上皮细胞向间叶细胞转化(EMT)混合液”意味着用于诱导EMT的一种或多种组分或包含所述组分的组合物，所述一种或多种组分包括TGFβ组分(如TGFβ)或包含TGFβ组分与FGF组分(如bFGF)的组合。
如本文所用的术语“TGFβ组分”意味着促进TGFβ信号传导的组分或包含所述组分的组合物，并且包括例如TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。
如本文所用的“KDR+细胞”意味着展现“含激酶插入域的受体”(kinase-insertdomain-containingreceptor，KDR)细胞表面表达的细胞，并且“KDR+细胞群体”意味着其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多的细胞展现KDR细胞表面表达的细胞群体。
如本文所用的“PDGFRα+细胞”意味着展现“血小板源性生长因子受体α”细胞表面表达的细胞，并且PDGFRα+细胞群体意味着其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多的细胞展现PDGFRα细胞表面表达的细胞群体。
术语“浓度”意味着在细胞培养基中的稀释浓度。
相对于如本文所用的细胞群体，如本文所用的术语“经纯化群体”是指已经从混合或异质性细胞群体和/或如培养基的其它组分中移出并且分开(例如分离)的细胞群体。在一些实施例中，与由其分离细胞或富集细胞的异质性群体相比较，经纯化群体是大体上纯的细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“大体上纯”是指关于构成总细胞群体的细胞，至少约65％、优选地至少约75％、至少约85％、更优选地至少约90％并且最优选地至少约95％纯的细胞群体。类似地，关于“大体上纯”的例如WT1+细胞群体，其是指所含有的并非WT1+的细胞少于约30％、少于约20％、更优选地少于约15％、10％、8％、7％、最优选地少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的群体。
如本文所用的术语“个体”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，并且适合地是指人类。
应用于细胞的术语“处理/治疗(treat/treating/treatment)”等包括使细胞经受任何类别的方法或条件，或对细胞进行任何类别的操控或程序。在应用于个体时，所述术语是指向个体提供医学或手术关注、照护或管理。
如本文所用的术语“治疗”在应用于个体时是指旨在获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法，并且包括医学程序和应用，包括例如医药干预、手术、放射线疗法和自然疗法干预以及用于治疗癌症的测试治疗。有益或所需临床结果可以包括(但不限于)缓解或改善一个或多个症状或病状，减轻疾病程度，稳定(即，没有恶化)疾病状态，预防疾病扩散、延迟或减缓疾病进程，改善或缓和疾病病况以及缓解(不论部分或全部)，不论可检测或不可检测。“治疗”还可以意味着存活期与未接受治疗时的预期存活期相比较延长。
如本文中所用，术语“施加”、“引入”和“移植”在向个体中递送细胞的情形下可互换地使用，所述递送通过使得所引入的细胞在所需位点处至少部分定位的方法或途径来进行。
术语“接触”打算包括将组分和细胞一起在体外培育(例如，将化合物添加到培养物中的细胞中)，并且接触的步骤可以任何合适的方式进行。举例来说，细胞可以在粘着培养物中或在悬浮培养物、3D培养物中进行处理，或在于珠粒上培养细胞的情况下，在时间上可以大体上同时或依次(例如在距离添加第一组分1小时内)添加混合液组分。例如在实例中进一步描述的，也可以使细胞与另一种试剂(如生长因子)或其它分化剂或环境接触以使所述细胞稳定或使所述细胞进一步分化，并且包括将所述细胞在所属领域中已知的条件下培养，例如用于培养多能(和/或经分化)群体。
如本文中所提到的术语“细胞培养基”(在本文中也称为“培养基(culturemedium/medium)”是含有维持细胞存活率的养分的用于培养细胞的培养基，并且支持增殖并任选地支持分化。细胞培养基可以适当组合含有以下中的任一种：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其它糖、抗生素、血清或血清替代品、以及其它组分，如肽生长因子、维生素等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是所属领域的技术人员已知的。
如本文所用的术语“多能干细胞”是指具有在不同条件下分化成超过一种经分化细胞类型的能力和例如分化成具有三种胚细胞层特征的细胞类型的能力的细胞，并且包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。使用例如裸鼠畸胎瘤形成分析，多能细胞的特征在于其分化成超过一种细胞类型的能力。多能性也由胚胎干(embryonicstem，ES)细胞标记物的表达证明。如本文所用，多能干可以包括有包括诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)和胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)的细胞系。在一个实施例中，多能干细胞不是人类胚胎干细胞。
如本文中所用，术语“iPSC”和“诱导多能干细胞”可互换地使用，并且是指人工来源(例如，诱导或通过完全反转)于非多能细胞(典型地成年人身体细胞)的多能干细胞，其例如通过诱导一种或多种基因(包括POU4F1/OCT4(基因ID；5460)与以下(但不限于以下)组合：SOX2(基因ID；6657)、KLF4(基因ID；9314)、cMYC(基因ID；4609)、NANOG(基因ID；79923)、LIN28/LIN28A(基因ID；79727))的表达来进行。
术语“胚胎干细胞”用于指胚胎囊胚的内部细胞团块的多能干细胞(参见例如美国专利第5,843,780号、第6,200,806号)。此类细胞也可以获自来源于身体性细胞核转移的囊胚的内部细胞团块(参见例如美国专利第5,945,577号、第5,994,619号、第6,235,970号)。胚胎干细胞的区别性特征定义胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有使得胚胎干细胞可以与其它细胞区别的独特特征中的一个或多个，那么所述细胞具有胚胎干细胞的表型。例示性胚胎干细胞区别性特征包括(但不限于)基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的响应性等等。
术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质和视需要分泌蛋白质以及细胞表面表达的细胞过程，在可适用的情况下包括(但不限于)例如转录、转译、折叠、修饰以及加工。「表达产物」包括由基因转录的RNA和通过转译由基因转录的mRNA而获得的多肽。
在理解本发明的范围时，如本文所用的术语“包含”和其派生词打算是指定所陈述特征、要素、组分、群组、整数和/或步骤的存在但不排除其它未陈述特征、要素、组分、群组、整数和/或步骤的存在的开放式术语。前述也适用于具有类似含义的词语，如术语“包括”、“具有”和其派生词。最后，如本文所用的如“大体上”、“约”和“大约”的程度术语意味着所修饰术语的使得最终结果并无显著改变的合理偏差量。这些程度术语应解释为在此偏差将不抵消其所修饰词语的含义的情况下包括所修饰术语的至少±5％的偏差。
在理解本发明的范围时，如本文所用的术语“组成”和其派生词打算是指定所陈述特征、要素、组分、群组、整数和/或步骤的存在并且还排除其它未陈述特征、要素、组分、群组、整数和/或步骤的存在的封闭式术语。
本文中由端点进行的数值范围叙述包括包含在所述范围内的所有数字和分数(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。也应理解，假定所有数字和其分数都由术语“约”修饰。此外，应理解除非内容另外清楚指示，否则“一个/一种(a/an)”和“所述”包括多个指示物。术语“约”意味着所提及的数字的加或减0.1％到50％、5％-50％或10％-40％，优选地10％-20％，更优选地10％或15％。
此外，如由所属领域的技术人员所理解的，在特定部分中所描述的定义和实施例打算可适用于本文中所描述的其所适用的其它实施例。举例来说，在以下段落中，更详细地定义本发明的不同方面。除非相反地清楚指示，否则如此定义的每个方面都可以与任何其它一个或多个方面组合。确切地说，任何指示为优选或有利的特征都可以与任何其它指示为优选或有利的特征组合。
II.方法和产物
本文描述用于产生心血管谱系细胞的的方法，所述心血管谱系细胞包括心肌细胞谱系细胞、心外膜谱系细胞和心外膜源性细胞。描述用于指定这些细胞类型的组分和条件以及用于监测这些细胞类型的出现的标记物。
因此，一个方面包括一种由多能干细胞(PSC)、任选地人类PSC(hPSC)获得心血管谱系细胞群体、任选地心肌细胞谱系细胞群体或心外膜谱系细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)使经过BMP组分预致敏的hPSC与适合于诱导所述hPSC分化成心血管中胚层细胞群体的心血管中胚层规划混合液在适合于所述规划混合液渗透所述hPSC的条件下接触，并且培养经过接触的hPSC持续一段时间以产生KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述心血管中胚层细胞群体与适合于指定NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续一段时间以产生NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体；以及(c)使所述心血管祖细胞群体与成熟混合液在适合于所述成熟混合液渗透所述心血管祖细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管祖细胞群体持续一段时间以产生心血管谱系群体，任选地为表达心脏肌钙蛋白T(cTnT)和/或SIRPA的心肌细胞谱系细胞和/或任选地表达WT1和/或包含EPDC的心外膜谱系细胞。
KDR和PDGFRα可以用于监测心血管中胚层细胞群体的发育。KDR的表达可以使用对KDR具有特异性的抗体来监测，且/或PDGFRα的表达可以使用对PDGFRα具有特异性的抗体来监测。由于两者都是细胞表面表达的，故KDR和PDGFRα表达可以通过测量细胞表面表达来监测。举例来说，KDR和PDGFRα的表达可以使用流动式细胞测量术来监测。
在一个实施例中，所述经过BMP组分预致敏的hPSC通过使所述hPSC与BMP组分接触约1到约2天来制备，任选地其中所述BMP组分是BMP4和/或BMP2。
在一个实施例中，所述心血管中胚层规划混合液包含BMP组分和活化素组分和任选地FGF组分，并且使所述心血管中胚层规划混合液与所述hPSC接触约3到约5天。
在一个实施例中，所述FGF组分包含bFGF。
在一个实施例中，所述BMP组分包含BMP4和/或BMP2。
在一个实施例中，所述活化素组分包含活化素A。
活化素组分和BMP组分的浓度可以如所描述进行优化。5
在一个实施例中，所述PSC包含于胚状体中。
使用例如上文步骤a)和b)，本文表明可以获得NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体。
因此，另一个方面包括一种用于由PSC、任选地hPSC获得NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)任选地如上文所描述，由hPSC获得KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体与心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续足以产生NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的一段时间。
在一个实施例中，使所述KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体在与所述心血管祖细胞指定混合液接触之前解离。
在一些实施例中，所述表达KDR+PDGFRα+的细胞在与所述心血管祖细胞指定混合液接触之前经过纯化。
在另一个实施例中，使所述心血管中胚层细胞群体与所述心血管祖细胞指定混合液接触至少12小时到约48小时，或介于12与48小时之间的任何时间量。
在一个实施例中，所述心血管祖细胞指定混合液包含心肌细胞谱系促进组分，其中所述心肌细胞促进组分处于适合于促进心肌细胞发育的浓度中并且指定NKX2-5+心血管祖细胞群体。
在一个实施例中，所述心肌细胞促进组分包含BMP抑制剂，例如与内源性表达抑制心肌细胞指定的BMP水平的心血管中胚层细胞群体一起使用。
在一个实施例中，所述心肌细胞促进组分包含浓度小于200ng/mL、小于150ng/mL、小于100ng/mL、小于50ng/mL或小于25ng/mL且/或大于12.5ng/mL的头蛋白。
在另一个实施例中，所述心肌细胞促进组分是浓度小于1μM、小于0.5μM、小于0.25微米或小于0.1μM的德索莫啡。
在另一个实施例中，所述心肌细胞促进组分是浓度小于0.63ng/mL、小于0.5ng/mL、小于0.4ng/mL或小于0.3ng/mL的BMP4。
在另一个实施例中，所述心血管祖细胞指定混合液包含：1)任选地选自DKK1、XAV939和IWP2的Wnt抑制剂与BMP组分的组合，任选地其中所述BMP组分是浓度为至少0.01ng/mL、至少0.05ng/mL、至少0.1ng/mL、至少0.5ng/mL、至少1.25ng/mL、至少2.5ng/mL、至少5ng/mL但小于10ng/ml或小于15ng/mL或优选地为约0.5ng/mL的BMP4；或2)BMP抑制剂，如头蛋白或德索莫啡，例如浓度小于200ng/mL、小于150ng/mL、小于100ng/mL、小于50ng/mL或小于25ng/mL且/或大于12.5ng/mL的头蛋白；3)Wnt抑制剂，例如其中产生有足够内源性BMP4；和/或4)心肌细胞谱系浓度的BMP组分，任选地BMP4，例如其中所述BMP4的浓度小于0.63ng/mL、小于0.5ng/mL、小于0.4ng/mL或小于0.3ng/mL。有效浓度和/或组合可以通过监测和优化NKX2-5表达和/或TNNT2/cTnT表达来确定。
Wnt抑制剂可以在无BMP的情况下用于诱导心肌细胞指定，例如当中胚层细胞群体产生足够内源性BMP组分时。
可以使用其浓度促进心肌细胞指定的BMP组分，例如当中胚层细胞群体产生不足内源性BMP组分时。
所分泌内源性组分(如BMP4或BMP2)的水平可以通过ELISA或其它定量免疫分析或定量RT-PCR来测量。
在另一个实施例中，纯化/分离KDR+PDGFRα+心血管中胚层群体和/或NKX2-5+心血管祖细胞群体。
在另一个实施例中，使所述NKX2-5+心血管祖细胞群体进一步与任选地包含VEGF组分的成熟混合液接触。所述成熟混合液可以是适合于所述细胞类型的培养基且/或包括额外组分。
另一个方面包括一种用于产生心脏肌钙蛋白T+(cTnT)心肌细胞谱系细胞群体的方法，其包含：(a)根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法来获得NKX2-5+心血管祖细胞群体；(b)使所述心血管祖细胞群体与包含VEGF组分的成熟混合液在适合于所述成熟混合液渗透所述心血管祖细胞群体的条件下接触；以及(b)培养经过接触的心血管祖细胞群体持续足以产生表达心脏肌钙蛋白T(cTnT)的心肌细胞的一段时间。
在一个实施例中，使所述NKX2-5+心血管祖细胞群体与所述成熟混合液接触约4天或更多天，例如至少约4、任选地约5、约9、约15或约20天，任选地直到产生成熟的收缩性心肌细胞为止。所述细胞可以保存在培养物中以成熟，直到获得所需细胞群体为止。
另一个方面是一种产生WT1+心外膜谱系细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)任选地如上文所定义，由hPSC获得KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述心血管中胚层细胞群体与包含心外膜谱系促进组分的心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续足以产生WT1+心血管祖细胞群体的一段时间。
在一个实施例中，所述心血管祖细胞指定混合液包含心外膜细胞促进组分，任选地其中所述心外膜细胞促进组分以适合于促进心外膜细胞发育的浓度包含BMP4。
在另一个实施例中，所述心外膜细胞促进组分包含浓度为至少1.25ng/mL、至少2.5ng/mL、至少5ng/mL或至少10ng/mL的BMP4。
在另一个实施例中，所述心外膜细胞促进组分进一步包含Wnt组分，任选地CHIR99021。
在又另一个实施例中，所述心外膜细胞促进组分包含BMP4和Wnt组分，任选地CHIR99021。
在另一个实施例中，使所述WT1+心血管祖细胞群体与包含VEGF组分的成熟混合液接触。
在另一个实施例中，使所述WT1+心血管祖细胞群体与所述成熟混合液接触约4天或更多天，任选地约5、约9、约15或约20天以产生经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体。
在另一个实施例中，纯化/分离所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体。
在另一个实施例中，培养所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体以获得带状闭锁蛋白1(zonaoccludins1，ZO1)+WT1+心外膜谱系细胞群体，任选地其中分离所述ZO1+WT1+心外膜谱系细胞群体。
在另一个实施例中，使所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体和/或所述ZO1+WT1+心外膜谱系细胞群体与上皮细胞向间叶细胞转化(EMT)混合液接触并且培养持续一段时间。
在另一个实施例中，所述EMT混合液包含：1)TGFβ组分；2)TGFβ组分和FGF组分，任选地其中依次施加所述TGFβ组分和所述FGF组分；或3)FGF组分。
在一个实施例中，所述TGFb组分是TGFb-1。在一个实施例中，所述FGF组分是bFGF。
如实例2中所示，用包含TGFb的EMT混合液处理WT1+细胞产生功能性平滑肌细胞，并且用包含TGFb和bFGF的EMT混合液处理WT1+细胞产生更高百分比的平滑肌细胞。
在一个实施例中，使所述WT1+细胞与EMT混合液接触约1天到至多3周，例如约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或约10天或约1周、2周或3周。举例来说，在EMT混合液包含依次施加的组分的情况下，可以施加每个组分持续约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或约10天、或约1周、约2周或约3周。
在一个实施例中，所述TGFb组分是TGFβ-1，并且所述浓度是约0.25ng/ml到约10ng/ml或介于0.25ng/ml与10ng/ml之间的任一0.1ng/ml增量。可以使用相当浓度的产生类似TGFb信号传导路径活化的其它TGFb组分。
在一个实施例中，所述FGF组分是bFGF，并且所述浓度是约1ng/ml到约50ng/ml或介于1ng/ml与50ng/ml之间的任何1ng/ml增量。可以使用相当浓度的产生类似FGF信号传导路径活化的其它FGF组分。
在又另一个实施例中，根据以下时程使所述EMT混合液与所述WT1+细胞群体接触：1)与TGFβ-1(例如约0.25到约10ng/ml)接触约四天，接着不与额外因子接触约四天(TGFβ)，2)与TGFβ-1(例如约0.25到约10ng/ml)接触约四天，接着与bFGF(例如约1到约50ng/ml)接触约四天(TGFβ+bFGF)，或3)与bFGF(例如约1到约50ng/ml)接触约八天(bFGF)。
在另一个实施例中，所述EMT混合液包含：1)TGFβ组分；或2)TGFβ组分和FGF组分；并且培养所述细胞群体持续一段时间以产生如SNAI1或SNAI2的EMT标记物(可例如通过测量SNAI1和/或SNAI2转录表达水平来检测)、如波形蛋白(vimentin)和/或CD90的间叶细胞标记物、和/或如SMA的平滑肌标记物的表达，其任选地通过流动式细胞测量术来测量；或平滑肌基因(任选地CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN)的表达。
如实例2中所表明，在EMT后产生的平滑肌样细胞展现NE和PE诱导的钙瞬变。显示钙瞬变的细胞比例在由TGFβ+bFGF诱导的群体中最高(70％)，指示此信号传导途径组合有效地促进能够收缩的平滑肌细胞的发育(图16a)。在一个实施例中，培养细胞群体持续足以产生其中至少50％、至少60％或至少70％的群体细胞在NE或PE刺激后显示钙瞬变的细胞群体的一段时间。
在另一个实施例中，培养所述细胞群体直到所述细胞群体表达平滑肌标记物或转录以获得血管平滑肌谱系细胞群体为止；任选地直到所述细胞群体表达其水平增加的间叶细胞标记物，任选地波形蛋白和/或CD90为止。
在另一个实施例中，所述EMT混合液包含：FGF组分，并且培养所述细胞群体以产生表达心外膜源性成纤维细胞标记物、任选地TCF21的成纤维细胞谱系细胞群体，其任选地通过qRT-PCR来测量。
在实例2中进一步表明，EMT诱导的hPSC源性心外膜细胞可以获取侵入力。举例来说，在诱导EMT后八天内监测侵入，并且用bFGF单独诱导的细胞最具迁移性并且侵入基质胶达到最大深度。bFGF处理也引起关注区(regionsofinterest，ROI；例如其中进行记录的区)内总细胞数目增加。因此，在另一个实施例中，培养细胞群体持续足以产生其中一定比例的群体细胞获取侵入力的细胞群体的一段时间。如实例2中所描述，侵入力包括例如在基质胶分析中可以迁移至少100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm、500μm或600μm的细胞。
在一个实施例中，任选地使用流动式细胞测量术来纯化/分离细胞群体，包括荧光激活细胞分选(fluorescence-activatedcellsorting。FACS)、磁性分离、亲和色谱、免疫染色和/或对细胞毒性剂的抗性。在其它实施例中，纯化/分离是基于检测非表面表达的标记物，其可以通过例如用定量RT或其它PCR和基于免疫的分析(如蛋白质印迹)监测等分试样来实现。
在另一个实施例中，培养细胞群体来表达TCF21以获得成纤维细胞谱系细胞群体。
在另一个实施例中，培养所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体和/或所述WT1+ZO1+心外膜谱系细胞群体持续一段时间以获得表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体，任选地其中所述表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体表达ALDH1A2或是Aldefluor阳性染色的，任选地其中所述细胞群体是至少50％Aldefluor阳性的。
在另一个实施例中，分离所述血管平滑肌谱系细胞群体、成纤维细胞谱系细胞群体和/或表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体。
在另一个实施例中，心血管祖细胞指定混合液进一步包含活化素/结节素抑制剂，任选地SB431542。举例来说，在心血管指定阶段期间添加的SB431542可以促进心肌细胞和心外膜指定。
在另一个实施例中，PSC是人类PSC。在又另一个实施例中，所述PSC是诱导多能干细胞(iPSC)系，任选地人类iPSC和/或胚胎干细胞(ESC)系，任选地人类ESC(hESC)。在一个实施例中，所述iPSC是成纤维细胞源性iPSC系。
另一个方面包括一种心血管谱系细胞或细胞群体和/或由其分化的细胞或细胞群体的经纯化群体，其根据本文所描述的方法来产生。举例来说，此处表明，心肌细胞或心外膜谱系细胞可以用污染性细胞类型来指定。在一个实施例中，经纯化群体包含在凝胶，任选地基质胶中。因此，所需群体可以在最少干预的情况下进行纯化。
在一个实施例中，将细胞粘附到固体载体上，如培养皿或烧瓶。
另一个方面包括一种组合物，其包含根据本文所描述的方法来产生的经纯化/经分离心血管谱系细胞或细胞群体和/或由其分化的细胞或细胞群体；和合适的稀释剂。
合适的稀释剂包括例如合适的培养基或冷冻培养基，其含有例如血清、血清取代物或血清补充剂和/或合适的低温保护剂，如二甲亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)、甘油甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮。
另一个方面包括一种培养基补充剂，其包含心血管祖细胞指定混合液，所述心血管祖细胞指定混合液任选地包含其浓度用于指定心肌细胞的BMP组分或包含用于心外膜指定的BMP组分和Wnt组分。所述组分可以呈液体或用于复水的粉末形式。
所述组分可以包含于待向基础培养基中添加的单个补充剂中，所述补充剂如生命技术公司(生命技术)StemPro-34。补充剂中的组分量可以例如是当稀释于培养基中时(例如当稀释于450mL基础培养基中时)产生本文所描述的浓度的量。
另一个方面包括一种培养基，其包含指定混合液，所述指定混合液任选地包含其浓度用于指定心肌细胞的BMP组分或包含用于心外膜指定的BMP组分和Wnt组分。也可以包括典型培养基组分，如
在另一个方面还包括一种试剂盒，其包含：1)用于测量在心血管谱系细胞或由其分化的细胞上表达的标记物的表达的试剂，所述标记物选自KDR、PDGFRα、NKX2-5+、WT1、ZO1、如SNAI1和/或SNAI2的EMT标记物、如波形蛋白和/或CD90的间叶细胞标记物、和/或如SMA的平滑肌标记物、平滑肌基因(任选地CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN)、TCF21、视黄醇脱氢酶和/或Aldefluor活性；和/或2)用于诱导心血管谱系细胞群体分化的组分或组合物，如包含所述组分的培养基，所述组分选自任选地包含其浓度用于指定心肌细胞的BMP组分或包含用于心外膜指定的BMP组分和Wnt组分的混合液。
试剂可以例如是用于免疫分析和基于流动的方法的抗体或其片段、用于检测特定转录的引物、和/或用于通过基于探针的方法来检测表达的探针，所述基于探针的方法如RT-PCR、qRT-PCR、原位杂交和密理博公司(Millipore)SmartFlare。
组合物和试剂盒组分可以包括本文中其它地方所描述的组分中的任一种和任选地使用说明书。举例来说，在一个实施例中，所述试剂盒包含有包含诱导本文所描述的一个或多个阶段或谱系分化的组分等的补充剂(例如，包括实例中所描述的组分)。在一个实施例中，所述试剂盒包含基础培养基，任选地本文所描述的基础培养基和本文所描述的培养基补充剂。
根据本文所描述的方法产生的细胞可以用于筛选促进和/或抑制心血管谱系细胞分化的试剂。
因此，另一个方面包括一种用于鉴别心血管细胞分化促进剂的方法，其包含以下步骤：(a)使测试细胞群体与测试剂在本文所描述的方法中的步骤时接触；(b)在所述测试细胞群体和对照组中监测选自以下的标记物的表达：KDR、PDGFRα、NKX2-5+、WT1、ZO1、如波形蛋白和/或CD90的间叶细胞标记物、和/或如SMA的平滑肌标记物、平滑肌基因(任选地CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN)、TCF21、视黄醇脱氢酶和/或Aldefluor活性水平；以及(c)当所述测试剂诱导和/或增加所述心血管标记物的表达和/或诱导心肌细胞、心外膜或EPDC的指定时，将所述测试剂鉴别为心血管细胞分化促进剂。
举例来说，可以进行共培养物分析，其中可以混合hPSC源性心外膜和心肌细胞并且以聚集体或单层形式接种。在预定量的时间之后，可以通过qRT-PCR、流动式细胞测量术或基与免疫的方法来分析培养物中基因和蛋白质表达的变化。可以评估培养物的以下方面，例如肌原纤维节形态，其通过对α辅肌动蛋白、心房利钠因子(atrialnatriureticfactor，ANF)和/或脑利钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)进行染色来评估；粒线体成熟度，其可以例如使用流动式细胞测量术和/或免疫方法来评估；肌球蛋白调控轻链7(myosinregulatorylightchain7，MYL7)，其主要表达在成年人心房肌肉和/或WT1下调中(例如指示心外膜成熟期)。流动式细胞测量术和免疫方法的实例提供于实例中。.
在一个实施例中，所述方法用于药物筛选例如用于促进和/或干扰心脏和/或血管重构的心血管药物。
在一个实施例中，对使用本文所描述的方法产生的HPSC源性心肌细胞和心外膜谱系细胞和/或组织进行：1)共培养，任选地与内皮细胞组合；2)使之与测试剂接触；以及3)评估其任选地在内皮细胞数目中的i)细胞死亡或ii)增殖增加；和/或ⅲ)与对照组相比较的组织结构改变，其中一个或多个细胞谱系的细胞死亡减少、增殖增加和/或与对照组相比较的细胞结构I)减少或II)增加指示所述测试剂是推定的心血管药物。内皮细胞数目可以例如通过对CD31进行染色来评估；细胞死亡和/或增殖可以例如通过流动式细胞测量术、细胞计数方法和/或流动式细胞测量术来评估；并且细胞结构以肉眼进行评估。
在一个实施例中，所述方法用于鉴别用于促进心外膜分化、替换疤痕组织、使缺血性区域血管再形成等的推定试剂。在一个实施例中，对使用本文所描述的方法产生的HPSC源性心肌细胞和心外膜谱系细胞和/或组织进行：1)共培养，任选地与内皮细胞组合；2)使之与测试剂在低氧或其它心脏毒性条件下接触；以及3)评估其任选地在内皮细胞数目中的i)细胞死亡或ii)增殖增加；和/或ⅲ)在低氧条件下与对照组相比较的组织结构改变，其中一个或多个细胞谱系的细胞死亡减少、增殖增加和/或与对照组相比较的细胞结构I)减少或II)增加指示所述测试剂是用于促进心外膜分化、替换疤痕组织、使缺血性区域血管再形成的推定试剂。内皮细胞数目可以例如通过对CD31进行染色来评估；细胞死亡和/或增殖可以例如通过流动式细胞测量术、细胞计数方法和/或流动式细胞测量术来评估；并且细胞结构以肉眼进行评估。
也可以诱导心肌梗塞，可以将多种模型生物体和hPSC源性心外膜细胞移植到心脏外层中。可以分析心脏功能恢复、肌细胞增殖/存活率以及EPDC的贡献。
因此，另一个方面包括一种将心血管细胞群体引入有需要的个体中的方法，其包含根据本文所描述的方法产生细胞群体、纯化所述细胞群体以及向所述有需要的个体施加所述细胞群体。
细胞群体任选地包含于适合于向个体施加的等张组合物中。
另一个方面包括一种治疗有需要的个体的方法，其包含向所述个体移植根据本文所描述的方法产生的细胞群体，任选地经纯化细胞群体。
在一个实施例中，所述个体已经患有或正患有短暂缺血性发作。在一个实施例中，所述个体患有缺血性心脏病。
在一个实施例中，向个体施加由hPSC产生的群体，其中所述hPSC是自体iPSC。
本文描述多种基因和基因产物。基因和基因产物的所有参考登录号参见包括TNNT2-NM_001276345.1、NKX2-5-NM_004387.3、WT1-NM_024426.4、TBX18-NM_001080508.2、GATA4-NM_002052.3、GATA5-NM_080473.4、ISL1-NM_002202.2、TBX5-NM_000192.3、BNC1-NM_001717.3、ANXA8-NM_001271702.1、SNAI1-NM_005985.3、SNAI2-NM_003068.4、CCN1-NM_001299.4、MYH11-NM_001040113.1、TAGLN-NM_001001522.1、SMTN-NM_001207017.1、TCF21-NM_198392.2、ALDH1A1-NM_000689.4、ALDH1A2-NM_003888.3以及ALDH1A3-NM_000693.2，与其关联的序列以全文引用的方式并入本文中。
以上公开内容一般描述本申请。更完全的理解可以参考以下具体实例来获得。这些实例仅仅出于图解说明的目的来加以描述，并且并不打算限制本申请的范围。在情形可能表明或赋予有利条件的情况下，涵盖形式变化和等效物取代。尽管本文已经采用特定术语，但此类术语打算为描述含义而非出于限制目的。
以下非限制性实例说明本发明：
实例
实例1
培养基由补充有10ng/ml青霉素/链霉素、2mML-谷氨酰胺、1mM抗坏血酸和4310-4M单硫代甘油(monothioglycerol，MTG)(西格马公司(Sigma))的StemPro-34(生命技术公司)组成。在所指示的时间点并且以所指示的浓度添加人类BMP4、人类bFGF、人类活化素A、人类DKK1以及人类VEGF(安迪生物公司(R&DSystems))。分别用SB-431542(密苏里州埃利斯维尔的托克里斯公司(Tocris,Ellisville,MO)和德索莫啡(西格马公司)来进行活化素/结节素/TGF-b和BMP抑制实验。对于涉及Wnt信号传导的实验，以所指示的浓度使用CHIR-99021(干细胞试剂公司)、XAV-939(安迪生物公司)或IWP2(安迪生物公司)。将培养物首先维持在5％CO2、5％O2、90％N2环境中持续10-12天，并且随后转移到5％CO2空气环境中持续剩余培养时段。在所指示的时间点，收集细胞，并且通过流动式细胞测量术来分析或进行细胞分选。
结果
心肌细胞指定.由hPSC开始的心血管谱系发育经由至少三个独特步骤进行，诱导KDR+PDGFR+心血管中胚层，和指定此中胚层最终成为心血管以引起NKX2-5+心血管祖细胞的发育，以及随后成熟为收缩性心肌细胞(图1)。虽然活化素A和BMP4是第一阶段的关键调控子5，但控制心脏指定的途径没有得到很好理解并且很可能不同于诱导步骤。为了研究指定步骤，确立使得我们能够在发育的此阶段期间容易地操控信号传导途径的模型(图1)。使用此方法，如所描述，在EB中用最佳浓度的活化素和BMP4诱导心血管中胚层5。在中胚层诱导的第4天时，使EB解离，将细胞以单层形式接种在微量滴定孔(每孔1×105个)中，并且用不同路径激动剂和拮抗剂处理24-48小时。在此指定步骤后，将培养物维持在VEGF的存在下，并且在第15天时分析表达心脏肌钙蛋白T(cTnT)和/或SIRPA的收缩性细胞的存在。初始研究展示，心肌细胞在Wnt抑制剂DKK1和活化素/结节素/TGFβ抑制剂SB431542的存在下常规地发育，指示这些途径不是指定所需的。另一方面，BMP信号传导在此阶段具有深远影响，因为添加高水平的BMP4或抑制剂头蛋白或德索莫啡完全阻断心肌细胞发育(图2a)。操控都不显著影响中胚层发育，尽管头蛋白确实在某一程度上降低KDR水平。心肌细胞发育的抑制不归因于大量细胞死亡，因为在48小时处理后，每一组中的细胞数没有明显不同(图2b)。
C.2.心外膜细胞的产生.在此指定步骤期间对激动剂和拮抗剂的滴定揭示，心肌细胞发育需要低水平的BMP信号传导，其通过内源性水平(由分化中的细胞产生)或经由添加低水平的头蛋白(12.5-200ng/ml)或低水平的BMP4(0.31ng/ml)来实现(图3)。高浓度的头蛋白以及以0.63ng/ml或更大的浓度添加BMP4抑制心肌细胞指定。由于所有组中的细胞数目都相当(图2b)，这些观察表明在不存在信号传导的情况下或在存在较高水平信号传导的情况下产生其它谱系。作为鉴别这些细胞的第一方法，我们分析其在6-15天时程内对一组心肌和心外膜基因的表达。正如预期的，指示心肌细胞发育的基因(包括TNNT2和NKX2-5)仅在对照组培养物中表达(图4)。有趣的是，两个心外膜标记物(WT1和TBX18)在由经BMP4处理的中胚层产生的细胞中排他性地(WT1)或占优势地(TBX18)表达，提升其表示发育中的心外膜谱系的可能性。最近鉴别的心外膜标记物BNC1和ANXA822也在经BMP4处理的细胞中高度表达。其它心脏谱系标记物(包括GATA4、GATA5、ISL1以及TBX5)的表达在一定程度上在对照组和经BMP4处理的培养物两者中表达。经头蛋白处理的培养物并不表达显著水平的任何这些基因。免疫染色揭示，仅在用BMP4诱导的细胞中检测到WT1(核)，而cTnT仅存在于未处理组的细胞中(图5)，证实RT-qPCR分析(图4)。在体内，心外膜细胞形成围绕发育中的心脏的上皮层18。除其独特形态之外，培养物中的上皮细胞的特征在于其形成紧密连接的能力，所述紧密连接可以通过带状闭锁蛋白1(ZO1)蛋白质的存在来监测。在培养D15时，表达WT1的培养物并不展示典型上皮细胞形态，并且未观察到ZO1表达(图6a)。然而，在传代并且以更大形式(由96孔到6孔培养板)培养4天后，WT1+细胞扩增以产生具有上皮细胞形态的汇合单层(图6b)。共同地，这些观察强有力地表明，经BMP4处理的细胞表示hPSC源性心外膜(epicardial，Epi)细胞。在斑马鱼(Zebrafish)中，已经观察到BMP路径是PEO发育所必需的23。
为了进一步表征WT1+心外膜细胞，通过流动式细胞测量术来分析第15天群体和经传代群体对各种表面抗原的表达。将这些群体的表达谱与第15天心肌细胞的表达谱相比较(图7)。心肌细胞和两个表达WT1的心外膜群体都对平足蛋白(podoplanin，PDPN)呈染色阳性，所述平足蛋白是见于发育中小鼠心肌细胞和成年小鼠心外膜上的跨膜糖蛋白22、24并且被认为与细胞迁移相关联。有趣的是，两个心外膜群体也对SIRPα呈阳性，所述SIRPα是先前展示在hPSC源性和胎儿心肌细胞上表达的受体6。WT1+心外膜群体确实表达间叶细胞/成纤维细胞标记物CD90，尽管水平随着传代而下调。与我们先前的发现相符，心肌细胞并不表达CD906。在两个心外膜群体中都以低水平检测到在小鼠中胚胎心外膜上表达的PDGFRβ25。与此对比，中胚层祖细胞标记物PDGFRα不在任何所述群体上表达，指示其随着谱系指定而下调。泛上皮细胞标记物EPCAM存在于心肌细胞上，但不存在于任一心外膜群体上。EPCAM表达未被报导为在心外膜中表达，最可能归因于其简单鳞状形态26、27。没有群体表达CD31、VE-钙粘素或cKIT，指示污染性内皮和造血细胞类型的缺乏。共同地，来自这些流动式细胞测量术分析的发现表明，由使用BMP的中胚层处理产生的心外膜细胞在表型上类似小鼠中的心外膜。
为了表明推定的Epi细胞来源于中胚层，分离并且分析来自第4天群体的PDGFRα+(中胚层)和PDGFRα-(非中胚层)部分。如图8中所示，心肌细胞(图7b)和WT1+TBX18+心外膜细胞(图7c、7d)仅由阳性群体产生，指示其来源于中胚层。这些观察表示第一论证，有可能由人类多能干细胞产生心外膜细胞。
BMP4可以在Wnt和活化素/结节素抑制剂的存在下指定心肌细胞和WT1+心外膜样谱系的发现表明，这些途径在心血管发育的此阶段并不起作用。然而，此解释并不符合以下观察：与野生型同窝幼畜相比较，Dkk1-/-Dkk2-/-剔除小鼠的心脏中心外膜厚度增加并且心肌大小减小，表明Wnt信号传导实际上确实在此谱系的发育中起一定作用28。为了调和这些差异，在阶段2期间进一步操控Wnt信号传导，尤其集中在通过在BMP4、BMP小分子抑制剂德索莫啡29(DM，代替头蛋白)存在下或在无BMP路径调控子对照组(无处理)下滴定DKK1或小分子拮抗剂XAV939或IWP2来抑制路径。如图9a中所示，增加DKK1的量确实改变经BMP4处理的培养物的最终结果，并且促进心肌细胞而非WT1+心外膜群体的发育。添加XAV939或IWP2具有与高浓度DKK1类似的作用(图9c和9d)。经DM处理和非BMP培养物的心肌细胞潜力在很大程度上不受这些操控影响(图9a、9c和9d)。正如预期的，通过添加小分子Wnt激动剂CHIR99021(CHIR)的Wnt路径活化在内源性BMP对照组中抑制心肌细胞发育，而经DM处理的培养物不受CHIR添加影响(图9a)。
表达分析展示，添加较高浓度的DKK1或小分子拮抗剂XAV939和IWP2在经BMP4处理的细胞中降低WT1表达，指示心外膜群体的损失并且取而代之指定心肌细胞谱系(图9b-9d)。通过CHIR的Wnt路径活化并不影响经BMP4处理的细胞中的WT1表达，但确实引起内源性BMP群体水平增加，而经DM处理的培养物在WT1表达中不展示变化(图9b)。综合在一起，这些观察展现Wnt信号传导是心外膜谱系指定所需的。
对于所有其余研究，通过向D4中胚层中添加BMP4和XAV939来产生心肌细胞，而BMP4和CHIR的组合用于诱导WT1+心外膜谱系。用BMP抑制剂DM处理的细胞用作非心肌细胞、非心外膜对照组群体。使用此方案，有可能由其它hPSC系产生WT1+心外膜样细胞，所述其它hPSC系包括人类成纤维细胞源性iPSC系(仙台hiPSC)和hESC系H7(图10a和10b)。
为了确定hESC源性WT1+心外膜样细胞是否可以进行EMT，设计以下分析，其中对D15心外膜细胞进行传代，允许一天进行恢复，并且随后用四个处理方案中的一个处理总计八天。方案由以下组成：1)TGFβ-1四天，接着不用额外因子四天(TGFβ)；2)TGFβ-1四天，接着用bFGF四天(TGFβ+bFGF)，3)bFGF八天(bFGF)；或4)不用额外因子八天(图11a)。在不同条件下培养后，收集细胞并且通过qRT-PCR和流动式细胞测量术来分析。
WT1的表达水平在传代后立即下调，并且随后在八天培养时段内逐渐上调(图11c)。用TGFβ或TGFβ+bFGF处理的细胞展示WT1表达随时间的稳定降低，指示心外膜标记的损失(图11c)。与此对比，在经bFGF处理的细胞中，WT1表达的水平并不下降到低于对照组的水平。EMT标记物SNAI1和SNAI2的表达也在经处理的群体中增加，尽管变化水平取决于细胞因子组合。TGFβ、TGFβ+bFGF和bFGF都引起SNAI2表达增加，而仅bFGF诱导SNAI1的表达(图11c)。免疫染色分析展示，ZO1表达在TGFβ或bFGF处理后内化或损失(图12)通过免疫染色的WT1表达与通过qRT-PCR测定的转录表达相符。在经TGFβ+bFGF处理的细胞中观察到WT1和ZO1表达的最显著损失，尽管其在形态上与仅用TGFβ处理的细胞不可区别。流动式细胞测量术分析展示，与未经处理的对照组相比较，在所有经处理组中的细胞上调间叶细胞标记物CD90(图11b)，支持TGFβ和bFGF已经起始EMT的解释。综合在一起，这些发现指示，WT1+细胞可以在TGFβ和bFGF途径活化后进行EMT，并且因此提供其表示发育心外膜的体外等效物的进一步证据。
为了鉴别在EMT诱导期间指定的细胞类型，通过免疫染色来分析衍生物群体中的间叶细胞标记物波形蛋白(VIM)和平滑肌标记物α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达，并且通过qRT-PCR来分析衍生物群体中的平滑肌基因、CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN30以及心外膜源性成纤维细胞标记物TCF2131的转录物。虽然VIM在一定程度上在所有群体中表达，但在经TGFβ和TGFβ+bFGF处理的细胞中观察到比在用bFGF单独处理的细胞中大体上更亮的染色(图13)。与用bFGF或在不存在因子的情况下培养的细胞相比较，也在经TGFβ和TGFβ+bFGF处理的经处理中检测到更高水平的SMA。这些谱表明，用TGFβ或TGFβ+bFGF处理的细胞沿着血管平滑肌谱系进行。支持此的是以下观察结果：用TGFβ或TGFβ+bFGF处理的细胞上调CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN的表达但不上调TCF21的表达(图14)。与此对比，bFGF诱导的群体除CNN1、TAGLN和SMTN之外还表达TCF21(图14)。然而，这些细胞并不表达MYH11。共同地，这些发现指示，TGFβ指定hESC源性WT1+心外膜细胞朝向平滑肌样最终结果，而bFGF促进成纤维细胞样细胞的发育。如由CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN在这些细胞中的表达增加所观察到的，在TGFβ后的bFGF处理似乎增强平滑肌样最终结果。
为了测试在用TGFβ和TGFβ+bFGF诱导的EMT后产生的平滑肌样细胞的收缩功能，使用先前所描述的方法在用去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)和苯肾上腺素(phenylephrine，PE)刺激后测量钙瞬变32。显示钙瞬变的细胞比例在由TGFβ+bFGF诱导的群体中最高(70％)，指示此信号传导途径组合有效地促进能够收缩的平滑肌细胞的发育(图15a)。在展现钙瞬变的细胞中，在PE刺激后，在TGFβ和TGFβ+bFGF诱导的细胞中观察到类似循环速率。来自两个群体的细胞展现比非诱导对照组培养物中的细胞更快的钙循环速率(图15b)。与对照组培养物相比较，钙响应的幅度在经PE处理的TGFβ细胞中最大(图15c)。最后，钙瞬变在PE处理后的持续时间在TGFB+bFGF诱导的细胞中比在用TGFβ处理的细胞或对照组群体中的细胞中明显更长(图15d)。综合在一起，这些发现展现，用TGFβ+bFGF的组合(或在较少情况下，TGFb)诱导心外膜细胞促进能够响应于激动剂的平滑肌细胞发育，所述激动剂引起可能有助于平滑肌作用电位和收缩性的钙处理增加。
良好确立在心脏发育期间，EPDC并且尤其心脏成纤维细胞侵入心肌层33。为了评估hPSC源性心外膜细胞的此潜力，测量其在用不同因子诱导EMT后侵入基质胶3D层的能力。为了使得我们能够容易地跟踪细胞迁移，由表达GFP的hESC产生心外膜群体48。在诱导EMT后八天内通过共聚焦显微镜来监测基质胶侵入，并且使用3D图像重构来评估(图16a)。用bFGF单独诱导的细胞最具迁移性，并且侵入基质胶达到最大深度(图16b)，支持其在自然界中是成纤维细胞的解释。与侵入一起，bFGF处理也引起关注区(ROI)内总细胞数目增加。没有其它组展示此扩增(无处理，每ROI73.8±6.1个细胞；TGFβ，每ROI56.8±9.5个细胞；bFGF，每ROI379.7±40.5个细胞，p＝0.0017；TGFβ+bFGF，每ROI80.3±17.1个细胞)。值得注意地，用TGFβ单独诱导的群体展示极小的侵入基质胶的能力，甚至小于未处理对照组，所述未处理对照组可能含有一些已经进行自发EMT而变成成纤维细胞谱系的细胞(白色箭头)。用TGFβ+bFGF的组合诱导的细胞表现类似于对照组群体，并且其侵入性比用BFGF单独诱导的细胞明显更小。为了进一步量化侵入程度，计算每一群体中迁移到不同深度的细胞比例。在非诱导、TGFβ诱导和TGFβ+bFGF诱导群体中的几乎所有细胞都在凝胶的最初200μm内检测到。与此对比，bFGF诱导的群体中大约一半的细胞迁移超出此深度，一些达到600μm。共同地，这些发现展现，bFGF诱导的群体显示其迁移性行为与对体内EPDC所预测的相符。具有平滑肌特征的细胞并不展示此潜力的观察表明，此谱系的成熟很可能在迁移到组织中后进行。
广泛公认的是心外膜在发育期间和在心脏损伤后经由上调视黄醇脱氢酶ALDH1A2而产生视黄酸。在分化D15时，WT1+心外膜细胞并不表达ALDH1A2(图17a)，其也不对通过流动式细胞测量术的Aldefluor呈染色阳性，所述Aldefluor是醛脱氢酶活性的标记物(图17c)。然而，在传代后群体展示ALDH1A2表达的稳定增加(图17a和17b)。也涉及视黄酸合成但不与心外膜相关联的视黄醇脱氢酶ALDH1A1和ALDH1A3仅以低水平进行表达(图17a)。在传代后八天时，如由Aldefluor染色所测量的，心外膜样群体大体上已经上调醛脱氢酶活性，其中大于78％的细胞是阳性(图17d)。其中已经用TGFβ、bFGF或TGFβ+bFGF诱导EMT的培养物展示显著较低水平的ALDH1A2表达和Aldefluor染色，与其不再是心外膜细胞的解释相符(图17b)。
综合在一起，这些研究展示，经传代WT1+心外膜细胞具有响应于TGFβ和bFGF信号传导而进行朝向平滑肌样和成纤维细胞样细胞的EMT的能力。在不存在诱导EMT的信号的情况下，WT+细胞经由上调ALDH1A2而获取上皮细胞样形态和醛脱氢酶活性，指示其合成RA的能力(图18)。
虽然本申请已经参考目前被认为是优选实例的内容来进行描述，但应理解，本申请不限于所公开的实例。相反，本申请打算涵盖包括于所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效安排。
所有公开、专利和专利申请都以全文引用的方式并入本文中，其引用程度如同每一个别公开、专利或专利申请特定并且个别地指示为以全文引用的方式并入一般。具体来说，与本文所提供的每一登录号相关联的序列，包括例如提供于表或其它地方中的登录号和/或生物标记序列(例如蛋白质和/或核酸)以全文引用的方式并入。
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Claims (43)

1.一种由人类多能干细胞(humanpluripotentstemcell，hPSC)获得心肌细胞谱系或心外膜谱系细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)使经过BMP组分预致敏的hPSC与适合于诱导所述hPSC分化成心血管中胚层细胞群体的心血管中胚层规划混合液在适合于所述规划混合液渗透所述hPSC的条件下接触，并且培养经过接触的hPSC持续一段时间以产生KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述心血管中胚层细胞群体与适合于指定NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续一段时间以产生NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体；以及(d)使所述心血管祖细胞群体与成熟混合液在适合于所述成熟混合液渗透所述心血管祖细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管祖细胞群体持续一段时间以产生心血管群体，任选地为表达心脏肌钙蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)和/或SIRPA的心肌细胞谱系细胞和/或表达WT1的心外膜谱系细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经过BMP组分预致敏的hPSC通过使所述hPSC与BMP组分接触约1-2天来制备，任选地其中所述BMP组分是BMP4和/或BMP2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述心血管中胚层规划混合液包含BMP组分和活化素组分和任选地FGF组分，并且使所述心血管中胚层规划混合液与所述hPSC接触约3-5天。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述FGF组分是bFGF。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述BMP组分是BMP4。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述活化素组分是活化素A。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述hPSC包含于胚状体中。
8.一种用于由hPSC获得NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)任选地如在根据权利要求1所述的步骤a中所定义，由hPSC获得KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体与心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续足以产生NKX2-5+或WT1+心血管祖细胞群体的一段时间。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中使所述KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体在与所述心血管祖细胞指定混合液接触之前解离。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中使所述心血管中胚层细胞群体与所述心血管祖细胞指定混合液接触至少12小时至约48小时。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其中所述心血管祖细胞指定混合液包含心肌细胞谱系促进组分，其中所述心肌细胞促进组分处于适合于促进心肌细胞发育的浓度中并且指定NKX2-5+心血管祖细胞群体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述心肌细胞促进组分是浓度小于200ng/mL、小于150ng/mL、小于100ng/mL、小于50ng/mL或小于25ng/mL且/或大于12.5ng/mL的头蛋白(noggin)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述心肌细胞促进组分是小于1μM、小于0.5μM、小于0.25微米或小于0.1μM的德索莫啡(dorsomorphin)。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述心肌细胞促进组分是浓度小于0.63、小于0.5ng/mL、小于0.4ng/mL或小于0.3ng/mL的BMP4。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述心血管祖细胞指定混合液包含：1)任选地选自DKK1、XAV939和IWP2的Wnt抑制剂与BMP组分的组合，任选地其中所述BMP组分是浓度为至少0.01ng/mL、至少0.05ng/mL、至少0.1ng/mL、至少0.5ng/mL、至少1.25ng/mL、至少2.5ng/mL、至少5ng/mL，但小于10ng/ml或小于15ng/mL或优选地为约0.5ng/mL的BMP4；或2)BMP抑制剂，如头蛋白或德索莫啡，任选地浓度小于200ng/mL、小于150ng/mL、小于100ng/mL、小于50ng/mL或小于25ng/mL且/或大于12.5ng/mL的头蛋白；3)Wnt抑制剂；和/或4)心肌细胞谱系浓度的BMP组分，任选地BMP4，例如其中所述BMP4的浓度小于0.63ng/mL、小于0.5ng/mL、小于0.4ng/mL或小于0.3ng/mL。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中分离所述KDR+PDGFRα+心血管中胚层群体和/或所述NKX2-5+心血管祖细胞群体。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法，其中使所述NKX2-5+心血管祖细胞群体进一步与包含VEGF组分的成熟混合液接触。
18.一种用于产生心脏肌钙蛋白T+(cTnT)心肌细胞谱系细胞群体的方法，其包含：(a)根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法来获得NKX2-5+心血管祖细胞群体；(b)使所述心血管祖细胞群体与包含VEGF组分的成熟混合液在适合于所述成熟混合液渗透所述心血管祖细胞群体的条件下接触；以及(b)培养经过接触的心血管祖细胞群体持续足以产生表达心脏肌钙蛋白T(cTnT)的心肌细胞的一段时间。
19.根据权利要求18所述的方法，其中使所述NKX2-5+心血管祖细胞群体与所述成熟混合液接触约4天或更多天，任选地约4、约5、约9、约15或约20天，任选地直到产生成熟的收缩性心肌细胞为止。
20.一种产生WT1+心外膜谱系细胞群体的方法，其包含以下步骤：(a)任选地如在根据权利要求1所述的步骤a中所定义，由hPSC获得KDR+和PDGFRα+心血管中胚层细胞群体；(b)使所述心血管中胚层细胞群体与包含心外膜谱系促进组分的心血管祖细胞指定混合液在适合于所述指定混合液渗透所述心血管中胚层细胞群体的条件下接触，并且培养经过接触的心血管中胚层细胞群体持续足以产生WT1+心血管祖细胞群体的一段时间。
21.根据权利要求1到10或20中任一权利要求所述的方法，其中所述心血管祖细胞指定混合液包含心外膜细胞促进组分，任选地其中所述心外膜细胞促进组分以适合于促进心外膜细胞发育的浓度包含BMP4。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述心外膜细胞促进组分包含浓度为至少1.25ng/mL、至少2.5ng/mL、至少5ng/mL或至少10ng/mL的BMP4。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述心外膜细胞促进组分进一步包含Wnt组分，任选地CHIR99021。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述心外膜细胞促进组分包含BMP4和Wnt组分，任选地CHIR99021。
25.根据权利要求1-10和20-24中任一权利要求所述的方法，其中使所述WT1+心血管祖细胞群体与包含VEGF组分的成熟混合液接触。
26.根据权利要求25所述的方法，其中使所述WT1+心血管祖细胞群体与所述成熟混合液接触4天或更多天，任选地约4、约5、约9、约15或约20天以产生经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中分离所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体。
28.根据权利要求25或26所述的方法，其中培养所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体以获得带状闭锁蛋白1(zonaoccludins1，ZO1)+WT1+心外膜谱系细胞群体，任选地其中分离所述ZO1+WT1+心外膜谱系细胞群体。
29.根据权利要求26到28中任一权利要求所述的方法，其中使所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体和/或所述ZO1+WT1+心外膜谱系细胞群体与上皮细胞向间叶细胞转化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)混合液接触并且培养持续一段时间。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述EMT混合液包含：1)TGFβ组分；2)TGFβ组分和FGF组分，任选地其中依次施加所述TGFβ组分和所述FGF组分；或3)FGF组分。
31.根据权利要求中任一权利要求所述的方法，其中根据以下时程使所述EMT混合液与所述WT1+细胞群体接触：1)与TGFβ-1接触约四天，接着不与额外因子接触约四天(TGFβ)，2)与TGFβ-1接触约四天，接着与bFGF接触约四天(TGFβ+bFGF)，或3)与bFGF接触约八天(bFGF)。
32.根据权利要求29到31中任一权利要求所述的方法，其中所述EMT混合液包含：1)TGFβ组分；或2)TGFβ组分和FGF组分；并且培养所述细胞群体持续一段时间以产生如SNAI1或SNAI2的EMT标记物、如波形蛋白(vimentin)和/或CD90的间叶细胞标记物、和/或如SMA的平滑肌标记物的表达，其任选地通过流动式细胞测量术来测量；或平滑肌基因(任选地CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN)的表达。
33.根据权利要求29到32中任一权利要求所述的方法，其中培养所述细胞群体直到所述细胞群体表达平滑肌标记物或转录以获得血管平滑肌谱系细胞群体为止；任选地直到所述细胞群体表达其水平增加的间叶细胞标记物，任选地波形蛋白和/或CD90为止；或直到一部分细胞在刺激后展现钙瞬变为止。
34.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述EMT混合液包含：FGF组分，并且培养所述细胞群体持续一段时间以产生表达心外膜源性成纤维细胞标记物、任选地TCF21的成纤维细胞谱系细胞群体，其任选地通过qRT-PCR来测量。
35.根据权利要求34所述的方法，其中培养所述细胞群体来表达TCF21和/或获得侵入力以获得成纤维细胞谱系细胞群体。
36.根据权利要求1-10和26-28中任一权利要求所述的方法，其中培养所述经过成熟混合液接触的WT1+心外膜谱系细胞群体和/或所述WT1+ZO1+心外膜谱系细胞群体持续一段时间以获得表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体，任选地其中所述表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体表达ALDH1A2或是Aldefluor阳性染色的，任选地其中所述细胞群体是至少50％AldefluorTM阳性的。
37.根据权利要求33到36中任一权利要求所述的方法，其中分离所述血管平滑肌谱系细胞群体、成纤维细胞谱系细胞群体和/或表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体。
38.根据权利要求1到37中任一权利要求所述的方法，其中心血管祖细胞指定混合液进一步包含活化素/结节素(nodal)抑制剂，任选地SB431542。
39.根据权利要求1到38中任一权利要求所述的方法，其中所述hPSC是诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)系和/或人类胚胎干细胞(humanembryonicstemcell，hESC)系。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述iPSC是成纤维细胞源性iPSC系。
41.一种心血管谱系细胞群体和/或心外膜细胞源性细胞(cellsepicardialderivedcell，EPDC)群体，其根据权利要求1到40中任一权利要求所述的方法来产生。
42.一种试剂盒，其包含：1)用于测量在心血管谱系细胞或EPDC上表达的标记物的表达的试剂，所述标记物选自KDR、PDGFRα、NKX2-5+、WT1、ZO1、如SNAI1和/或SNAI2的EMT标记物、如波形蛋白和/或CD90的间叶细胞标记物、和/或如SMA的平滑肌标记物、平滑肌基因(任选地CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN)、TCF21、视黄醇脱氢酶和/或Aldefluor活性；和/或2)用于诱导心血管谱系细胞群体分化的组分，所述组分选自其浓度用于指定心肌细胞的BMP组分或包含用于心外膜指定的BMP组分和Wnt组分。
43.一种用于鉴别心血管细胞分化促进剂的方法，其包含以下步骤：(a)使测试细胞群体与测试剂在权利要求1到40中任一权利要求中的步骤中接触；(b)在所述测试细胞群体和对照组中监测选自以下的标记物的表达：KDR、PDGFRα、NKX2-5+、WT1、ZO1、如波形蛋白和/或CD90的间叶细胞标记物、和/或如SMA的平滑肌标记物、平滑肌基因(任选地CNN1、MYH11、TAGLN和SMTN)、TCF21、视黄醇脱氢酶和/或Aldefluor活性水平；以及(c)当所述测试剂诱导和/或增加所述心血管标记物的表达时，将所述测试剂鉴别为心血管细胞分化促进剂。
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