JP7348997B1 - 毛細胆管領域の特定又は評価の方法、装置及びプログラム - Google Patents
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Abstract
【課題】毛細胆管領域を非侵襲的に特定及び評価する方法を提供すること。【解決手段】肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法、及び肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する方法。【選択図】なし
Description
本開示は、毛細胆管領域を特定又は評価する方法、装置及びプログラムに関する。
毛細胆管（胆汁細管、ｂｉｌｅ ｃａｎａｌｉｃｕｌｉ又はＢＣとも表記する。）は、隣接する肝細胞間に形成される細管である。毛細胆管の管腔は、肝細胞間の密着結合により密閉されており、肝細胞の細胞膜上のトランスポーターを介して、物質の授受が行われている。毛細胆管には、肝細胞において合成された胆汁酸が分泌され、また、肝細胞において代謝された薬物等が排泄される。毛細胆管に面する肝細胞の表面には、微絨毛(ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ又はＭＶとも表記する。)と呼ばれる長さサブマイクロメートルから数マイクロメートル程度の微細な突起が多数存在する。
薬物性肝障害（ＤＩＬＩ：Ｄｒｕｇ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ）は、患者に投与された薬物及び／又はその代謝物に起因する肝疾患の総称であり、既承認薬の市場撤退及び使用制限並びに新薬が安全性に関して承認に至らないことの主要因の１つである（非特許文献１）。
毛細胆管と薬物に関し、肝細胞の培養方法に係る特許文献１では、培養された肝細胞の評価の指標として毛細胆管の面積及び数が用いられている。特許文献２には、肝細胞による胆汁中又は血液中排泄感受性の候補化合物及び該候補化合物の肝代謝物の評価装置であって、肝代謝物の毛細胆管様構造への蓄積と排泄を促進することを特徴とする評価装置が開示されている。特許文献３には、毛細胆管機能障害を誘発する候補化合物をスクリーニングするインビトロ方法であって、その評価指標として胆管空間の形態変化並びに細管及び細管腔内に蓄積することができる小分子又は大分子の最大量が用いられる方法が開示されている。
Watkins, "Drug safetysciences and the bottleneck in drug development.", Clin. Pharmacol. Ther.,89, 788-790 (2011).
Gissen et al., "Structuraland functional hepatocyte polarity and liver disease", Journal ofHepatology, 63, 1023-1037 (2015).
毛細胆管は、肝細胞塊及び肝組織の評価指標並びに薬物代謝の解析対象として有用である。しかし、代表的な組織染色法であるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）によっては、毛細胆管領域の特定は困難であることが報告されている（非特許文献２）。また、現状用いられている毛細胆管領域の特定方法及び評価方法は電子顕微鏡法及び蛍光顕微鏡法であるが、電子顕微鏡法は生細胞観察及び経時観察が困難であるため薬物評価との併用には不適であり、蛍光顕微鏡法は蛍光標識が必須である。
したがって、本開示の一側面の目的は、毛細胆管領域を非侵襲的に特定又は評価する方法、装置及びプログラムを提供することである。
発明者らは、観察対象物の屈折率分布データを用いると、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定可能であること、及び特定した毛細胆管領域の評価が可能であることを見出した。
すなわち、本開示の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法である。
他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する方法である。
他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法により特定された毛細胆管領域の数、及び／又は肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて毛細胆管領域を評価する方法により得られた毛細胆管領域の評価、に基づいて、肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法である。
他の一側面は、肝細胞を培養するステップと、屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法により特定された毛細胆管領域の数、及び／又は屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータによって毛細胆管領域を評価する方法により得られた毛細胆管領域の評価、に基づいて肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法を用いて、培養によって得られた観察対象物を評価するステップと、を含む、肝細胞の培養方法を評価する方法である。
他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物に薬物を添加するステップと、屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法により特定された毛細胆管領域の数、及び／又は屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータによって毛細胆管領域を評価する方法により得られた毛細胆管領域の評価、に基づいて肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法を用いて、薬物を添加された観察対象物を評価するステップと、を含む、薬物のスクリーニング方法である。
他の一側面は、肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、を備える、毛細胆管領域の特定装置である。
他の一側面は、肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて毛細胆管領域を評価する評価部と、を備える、毛細胆管領域の評価装置である。
他の一側面は、肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、をコンピュータに実行させるプログラムである。
他の一側面は、肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて毛細胆管領域を評価する評価ステップと、をコンピュータに実行させるプログラムである。
より詳細には、本開示は以下の［１］～［２０］に関する。
［１］肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法。
［２］毛細胆管領域の特定が、観察対象物中の領域が毛細胆管の特徴を有することに基づいて行われる、［１］に記載の方法。
［３］上記毛細胆管の特徴が、肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴からなる群より選択される１つ以上の特徴を含む、［２］に記載の方法。
［４］上記毛細胆管の特徴が、肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴を含む、［２］に記載の方法。
［５］上記毛細胆管の特徴が、さらに、微絨毛に由来する領域であって、領域全体の屈折率よりも屈折率の高い領域を有する特徴を含む、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］上記屈折率分布データが、所定の方向における屈折率断層データである、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する方法。
［８］前記毛細胆管のパラメータが、管流軸に垂直な断面若しくは断層面視の断面の面積、屈折率、微絨毛の本数並びに微絨毛の平均長さからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含む、［７］に記載の方法。
［９］［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定するステップを含み、特定された毛細胆管領域における毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法により特定された毛細胆管領域の数及び／又は［７］～［９］のいずれか１つに記載の方法により得られた毛細胆管領域の評価に基づいて、肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法。
［１１］肝細胞を培養するステップと、［１０］に記載の方法を用いて、培養によって得られた観察対象物を評価するステップと、を含む、肝細胞の培養方法を評価する方法。
［１２］肝細胞を含有する観察対象物に薬物を添加するステップと、［１０］に記載の方法を用いて、薬物を添加された観察対象物を評価するステップと、を含む、薬物のスクリーニング方法。
［１３］上記肝細胞を含有する観察対象物が２次元肝培養体、肝細胞塊及び肝臓組織試料からなる群より選択される、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］上記肝細胞を含有する観察対象物が肝細胞塊及び肝臓組織試料からなる群より選択される、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］上記肝細胞を含有する観察対象物が肝細胞塊である、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］肝臓の臨床検体の屈折率分布データを取得するステップと、［７］～［１０］のいずれか１つに記載の方法を用いて上記臨床検体に含まれる毛細胆管領域又は上記臨床検体を評価するステップと、を含む、肝疾患の診断方法、肝疾患の診断を補助する方法又は肝疾患の診断のためのデータを取集する方法。
［１７］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、を備える、毛細胆管領域の特定装置。
［１８］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、［７］～［９］のいずれか１つに記載の方法によって毛細胆管領域を評価する評価部と、を備える、毛細胆管領域の評価装置。
［１９］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、をコンピュータに実行させるプログラム。
［２０］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、［７］～［９］のいずれか１つに記載の方法によって毛細胆管領域を評価する評価ステップと、をコンピュータに実行させるプログラム。
［１］肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法。
［２］毛細胆管領域の特定が、観察対象物中の領域が毛細胆管の特徴を有することに基づいて行われる、［１］に記載の方法。
［３］上記毛細胆管の特徴が、肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴からなる群より選択される１つ以上の特徴を含む、［２］に記載の方法。
［４］上記毛細胆管の特徴が、肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴を含む、［２］に記載の方法。
［５］上記毛細胆管の特徴が、さらに、微絨毛に由来する領域であって、領域全体の屈折率よりも屈折率の高い領域を有する特徴を含む、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］上記屈折率分布データが、所定の方向における屈折率断層データである、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する方法。
［８］前記毛細胆管のパラメータが、管流軸に垂直な断面若しくは断層面視の断面の面積、屈折率、微絨毛の本数並びに微絨毛の平均長さからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含む、［７］に記載の方法。
［９］［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定するステップを含み、特定された毛細胆管領域における毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法により特定された毛細胆管領域の数及び／又は［７］～［９］のいずれか１つに記載の方法により得られた毛細胆管領域の評価に基づいて、肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法。
［１１］肝細胞を培養するステップと、［１０］に記載の方法を用いて、培養によって得られた観察対象物を評価するステップと、を含む、肝細胞の培養方法を評価する方法。
［１２］肝細胞を含有する観察対象物に薬物を添加するステップと、［１０］に記載の方法を用いて、薬物を添加された観察対象物を評価するステップと、を含む、薬物のスクリーニング方法。
［１３］上記肝細胞を含有する観察対象物が２次元肝培養体、肝細胞塊及び肝臓組織試料からなる群より選択される、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］上記肝細胞を含有する観察対象物が肝細胞塊及び肝臓組織試料からなる群より選択される、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］上記肝細胞を含有する観察対象物が肝細胞塊である、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］肝臓の臨床検体の屈折率分布データを取得するステップと、［７］～［１０］のいずれか１つに記載の方法を用いて上記臨床検体に含まれる毛細胆管領域又は上記臨床検体を評価するステップと、を含む、肝疾患の診断方法、肝疾患の診断を補助する方法又は肝疾患の診断のためのデータを取集する方法。
［１７］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、を備える、毛細胆管領域の特定装置。
［１８］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、［７］～［９］のいずれか１つに記載の方法によって毛細胆管領域を評価する評価部と、を備える、毛細胆管領域の評価装置。
［１９］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、をコンピュータに実行させるプログラム。
［２０］肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、［７］～［９］のいずれか１つに記載の方法によって毛細胆管領域を評価する評価ステップと、をコンピュータに実行させるプログラム。
本開示の方法、装置又はプログラムによれば、屈折率分布データを用いて、観察対象物中の毛細胆管領域を非侵襲的に特定及び評価することができる。また、本開示の方法によれば、屈折率分布データを用いて、肝細胞塊の培養方法の評価又は薬物のスクリーニングを行うことができる。
以下、実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。実際の形態は、これらの例示に限定されるものではない。
一実施形態に係る観察対象物は、肝細胞を含有する。肝細胞とは、肝臓由来であり、隣接する肝細胞同士の密着結合により毛細胆管を形成し得る細胞を示す。一実施形態に係る観察対象物は、毛細胆管を形成した肝細胞及び毛細胆管を形成していない肝細胞の両者を含有し得る。肝細胞は、肝臓由来の培養細胞（セルライン及び初代培養細胞を含む）であっても、単離された肝臓組織に含まれる肝細胞であってもよく、肝細胞の由来となる動物種は特に限定されない。観察対象物が細胞の培養体である場合、培養体は１種の肝細胞からなってもよく、少なくとも１種の肝細胞を含む２種以上の細胞を含んでもよい。
一実施形態に係る観察対象物は、細胞を主成分として構成される物体であるが、細胞の他にも組織試料に含有されることがあるコンポーネント、例えば細胞外マトリックス及び中性脂肪など、を含んでいてもよい。一実施形態に係る観察対象物は、肝細胞同士が密着結合を形成する観点から、２次元肝培養体、肝細胞塊及び肝臓組織試料であってもよい。また、同様の観点並びに判定及び評価対象となりうる毛細胆管の量及び質の担保の観点から、２次元肝培養体、肝細胞塊及び肝臓組織試料であってもよい。さらに、一実施形態に係る観察対象物は、生理的環境に近い環境、再現性の高さ及び試料調製の容易性を並立する観点から、肝細胞塊であってもよい。２次元肝培養体とは、平板ディッシュ上で２次元培養された肝細胞により形成された単層のコロニーである。肝細胞塊とは、３次元培養された肝細胞により形成された細胞塊である。肝臓組織試料とは、ヒトを含む動物より単離された肝臓組織より作成された生体試料であり、例えば組織スライド、組織ブロック、組織パネル及び組織アレイなどが挙げられる。観察対象物が肝細胞塊である場合、その最大径は１００～２００μｍであるとよい。
屈折率分布データとは、観察対象物を含む空間中のボクセル毎の屈折率の３次元分布を示すデータ又は観察対象物を含む空間の所定の方向における断層面内のピクセル毎の屈折率の２次元分布を示すデータである。また、屈折率断層データとは、屈折率分布データのうち、観察対象物を含む空間の所定の方向における断層面内のピクセル毎の屈折率の２次元分布を示すデータである。
一実施形態に係る屈折率分布データを取得する方法（以下、「屈折率分布測定方法」ともいう。）は特に限定されないが、一例である方法について以下に詳述する。観察対象物の屈折率分布を非染色・非侵襲で測定する方法として、光回折トモグラフィ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＤＴ）が知られている。ＯＤＴは、定量位相イメージング（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｈａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ、ＱＰＩ）を３次元イメージング可能な技術に発展させたものであり、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
さらに以下に説明する屈折率分布測定方法Ａ～Ｃが用いられる。屈折率分布測定方法Ａには屈折率分布測定方法Ａ１～Ａ３の態様がある。屈折率分布測定方法Ａ１～Ａ３を総称して屈折率分布測定方法Ａという。これらの屈折率分布測定方法Ａ～Ｃは、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
なお、他の染色・非侵襲のイメージング技術として、光コヒーレンス・トモグラフィ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＣＴ）も知られている。しかし、ＯＣＴの分解能は１０μｍ程度であるのに対して、ＯＤＴ及び屈折率分布測定方法Ａ～Ｃの分解能は１μｍ程度である。また、ＯＣＴは、屈折率分布を求めるものではなく、イメージングにより得られた信号の生物学的な解釈が難しい。これらの点で、ＯＤＴ及び屈折率分布測定方法Ａ～Ｃは、ＯＣＴより優位である。
先ず、屈折率分布測定方法Ａ（Ａ１～Ａ３）について説明する。図Ａ０１～図Ａ０３は、屈折率分布測定方法Ａによる屈折率分布を測定する際に用いることができる観察装置１Ａ～１Ｃの各構成を示す図である。
図Ａ０１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３及び解析部５０などを備える。
光源１１は、空間的・時間的にコヒーレントな光を出力するものであり、例えばレーザ光源である。レンズ１２は、光源１１と光学的に接続されており、光源１１から出力された光を光ファイバ１４の光入射端１３に集光して、その光を光入射端１３に入射させる。光ファイバ１４は、レンズ１２により光入射端１３に入射された光をファイバカプラ１５へ導光する。ファイバカプラ１５は、光ファイバ１４と光ファイバ１６，１７との間で光を結合するものであり、光ファイバ１４により導光されて到達した光を２分岐して、一方の分岐光を光ファイバ１６により導光させ、他方の分岐光を光ファイバ１７によりさせる。光ファイバ１６により導光された光は光出射端１８から発散光として出射される。光ファイバ１７により導光された光は光出射端１９から発散光として出射される。
レンズ２１は、光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。コンデンサレンズ２４は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３及びコンデンサレンズ２４は、例えば４ｆ光学系を構成している。レンズ２３及びコンデンサレンズ２４は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４と光学的に接続されている。対物レンズ２５とコンデンサレンズ２４との間に観察対象物Ｓが配置される。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４から出力されて観察対象物Ｓを経た光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。
ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光及び参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。
解析部５０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部５０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部５０は、コンピュータであってよい。解析部５０は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６、表示部５７及び記憶部５８を備える。
干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部５１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５及び屈折率分布算出部５６は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰ又はＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部５７は、処理すべき画像、処理途中の画像及び処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部５８は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６及び記憶部５８は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
記憶部５８は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５及び屈折率分布算出部５６に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ａの製造時又は出荷時に記憶部５８に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部５８に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部５８に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ＢＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５及び屈折率分布算出部５６それぞれの処理の詳細については後述する。
図Ａ０２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。この図Ａ０２に示される観察装置１Ｂは、図Ａ０１に示された観察装置１Ａの構成に加えて、レンズ３１、ミラー３２、駆動部３３及びレンズ３４などを備える。
レンズ３１は、光出射端１９と光学的に接続されており、光出射端１９から発散光として出力された光（参照光）をコリメートする。ミラー３２は、レンズ３１と光学的に接続されており、レンズ３１から到達した光をレンズ３４へ反射させる。レンズ３４は、ミラー３２と光学的に接続されており、ミラー３２から到達した光をビームスプリッタ４１へ出力する。レンズ３４から出力された光は、ビームスプリッタ４１の手前で一旦集光された後、発散光としてビームスプリッタ４１に入力される。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、レンズ３４から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光を同軸にしてレンズ４２へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行である。
駆動部３３は、ミラー３２の反射面に垂直な方向にミラー３２を移動させる。駆動部３３は例えばピエゾアクチュエータである。このミラー３２の移動により、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光及び参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させる。この光路長差が異なると、撮像部４３により撮像される干渉強度画像も異なる。
観察装置は、図Ａ０１及び図Ａ０２の構成例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。観察装置１Ａ及び観察装置１Ｂの構成では観察対象物Ｓを透過した物体光を観察したが、以下に説明する観察装置１Ｃの構成のように観察対象物Ｓで反射された物体光を観察してもよい。
図Ａ０３は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。観察装置１Ｃは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３及び解析部５０などを備える。以下では、観察装置１Ａ（図Ａ０１）と相違する点について主に説明する。
レンズ２１は、光ファイバ１６の光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。対物レンズ２５は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３と対物レンズ２５との間にビームスプリッタ４１が配置されている。レンズ２３及び対物レンズ２５は、例えば４ｆ光学系を構成している。レンズ２３及び対物レンズ２５は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、観察対象物Ｓで反射された光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。
ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光ファイバ１７の光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光及び参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。
観察装置１Ｃ（図Ａ０３）の構成において、観察装置１Ｂ（図Ａ０２）と同様に参照光の光路長を変化させる機構（図Ａ０２中のレンズ３１、ミラー３２、駆動部３３及びレンズ３４）を設けて、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光及び参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させてもよい。この場合、撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行であってよい。
図Ａ０４は、屈折率分布測定方法Ａのフローチャートである。この屈折率分布測定方法Ａは、観察装置１Ａ～１Ｃの何れを用いた場合においても可能なものである。この屈折率分布測定方法Ａは、干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６を備える。
干渉強度画像取得ステップＳ１の処理は干渉強度画像取得部５１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ２の処理は第１複素振幅画像生成部５２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ３の処理は第２複素振幅画像生成部５３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ４の処理は２次元位相画像生成部５４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ５の処理は３次元位相画像生成部５５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６の処理は屈折率分布算出部５６により行われる。
干渉強度画像取得ステップＳ１において、干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
図Ａ０１～図Ａ０３それぞれにおいて説明の便宜のためにｘｙｚ直交座標系が示されている。ｚ軸は対物レンズ２５の光軸に対し平行である。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。この位置をｚ＝０とする。観察対象物Ｓへの光照射方向は、その照射光の波数ベクトル（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）のうちのｋｘ及びｋｙにより表すことができる。
図Ａ０５（ａ）～（ｃ）は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。この図では、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。光照射方向の走査は、図Ａ０５（ａ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において矩形格子状に配置されるようなものであってもよいし、図Ａ０５（ｂ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において同心の複数の円それぞれの周上に配置されるようなものであってもよいし、また、図Ａ０５（ｃ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において螺旋状に配置されるようなものであってもよい。何れの場合にも、コンデンサレンズ２４の開口数（ＮＡ：Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ）の許す限りで光照射方向の走査が可能である。ラスタスキャン及びランダムスキャンの何れであってもよい。ラスタスキャンの場合には、戻りスキャンが有ってもよいし無くてもよい。
第１複素振幅画像生成ステップＳ２において、第１複素振幅画像生成部５２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部５１により取得された基準位置の干渉強度画像に基づいて、基準位置の複素振幅画像を生成する。観察装置１Ａ（図Ａ０１）及び観察装置１Ｃ（図Ａ０３）の場合には、第１複素振幅画像生成部５２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｂ（図Ａ０２）の場合には、第１複素振幅画像生成部５２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。
第２複素振幅画像生成ステップＳ３において、第２複素振幅画像生成部５３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部５２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。基準位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，０）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋｘ，ｋｙ，０）とすると、ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）、及び、この複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）の２次元フーリエ変換Ｕ（ｋｘ，ｋｙ，ｄ）は、下記式で表される。ｉは虚数単位であり、ｋ０は観察対象物中における光の波数である。
２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細については後述する。
なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、２次元位相画像生成ステップＳ４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ４において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部５８が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる点でよい。
３次元位相画像生成ステップＳ５において、３次元位相画像生成部５５は、２次元位相画像生成部５４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙ及び該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
屈折率分布算出ステップＳ６において、屈折率分布算出部５６は、３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。観察対象物の屈折率分布をｎ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、電気感受率分布をｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、背景の媒質の屈折率をｎｍとすると、両者の間には下記（３）式の関係がある。３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（４）式のとおり、カーネル関数ｇ（ｘ，ｙ，ｚ）と電気感受率分布ｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とのコンボリューションで表される。したがって、観察対象物の３次元屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）に基づいてデコンボリューションにより求めることができる。
なお、カーネル関数ｇは、波動方程式の解に対応するグリーン関数に基づくものである。図Ａ０６は、カーネル関数ｇを説明する図である。この図において、カーネル関数ｇの値が最も大きい中心位置が原点であり、縦方向がｚ軸であり、横方向がｚ軸に垂直な方向である。
また、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６の各処理は、所定の数の光照射方向それぞれの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に行われてもよいし（図Ａ０７）、１つの光照射方向の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に行われてもよい（図Ａ０８）。
図Ａ０７及び図Ａ０８は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。これらの図では、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。これらの図に示される光照射方向の走査の例では、光照射方向を順次変更していき、第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像取得時の光照射方向を第ｎの干渉強度画像取得時の光照射方向と一致させている。ｎは正の整数であり、Ｎは２以上の整数である。
図Ａ０７に示される例では、第１～第Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第１～第Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０７（ａ））。次に、第（Ｎ＋１）～第２Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第（Ｎ＋１）～第２Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０７（ｂ））。次に、第（２Ｎ＋１）～第３Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第（２Ｎ＋１）～第３Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる。以降も同様である。
図Ａ０８に示される例では、第１～第Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第１～第Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０８（ａ））。次に、第（Ｎ＋１）の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第（Ｎ＋１）の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第２～第（Ｎ＋１）の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０８（ｂ））。次に、第（Ｎ＋２）の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第（Ｎ＋２）の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第３～第（Ｎ＋２）の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図Ａ０８（ｃ））。以降も同様にして、第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第（１＋ｎ）～第（Ｎ＋ｎ）の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる。
図Ａ０７に示された例と比較すると、図Ａ０８に示された例では、１つの光照射方向の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に、その干渉強度画像を含む直近の複数の干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われるので、ステップＳ２～Ｓ６の各処理により単位時間当たりに得られる各画像の数が多い。
次に、屈折率分布測定方法Ａにおける２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細について説明する。２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。２次元位相画像生成ステップＳ４は、屈折率分布測定方法Ａ１～Ａ３の何れであるかによって異なる。
図Ａ０９は、屈折率分布測定方法Ａ１における２次元位相画像生成ステップＳ４のフローチャートである。屈折率分布測定方法Ａ１における２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ１１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ１２において、この複素振幅総和画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
ステップＳ１１の処理は、ＣＡＳＳ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｓｕｎｇｓａｍ Ｋａｎｇ， ｅｔ ａｌ， “Ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｅｐ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｗａｖｅｓ，” ＮＡＴＵＲＥ ＰＨＯＴＯＮＩＣＳ， Ｖｏｌ．９， ｐｐ．２５３－２５８ （２０１５）．）技術によるものである。或る光照射方向に沿って対象物に照射されて該対象物を経た光のうち、対象物と一回のみ相互作用した単一散乱光の空間周波数分布は光照射方向に応じてシフトしているのに対して、対象物と複数回相互作用した多重散乱光の空間周波数分布は光照射方向によってランダムに変化する。ＣＡＳＳ技術は、このような単一散乱光及び多重散乱光それぞれの空間周波数分布の光照射方向依存性の相違を利用する。
すなわち、ステップＳ１１では、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正する（つまり、空間周波数領域において複素振幅画像の空間周波数分布を光照射方向に応じて平行移動する）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分の空間周波数分布を光照射方向に依存しない形状及び配置とし、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分の空間周波数分布をランダムな形状及び配置とする。そして、ステップＳ１１では、これら補正後の複数の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成する（つまり、合成開口処理をする）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分をコヒーレントに足し合わせ、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分を互いに相殺させる。
したがって、ステップＳ１１で生成される複素振幅総和画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制され、単一散乱－多重散乱比（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｔｏ Ｍｕｌｔｉ－ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｒａｔｉｏ、ＳＭＲ）が改善されたものとなる。
図Ａ１０は、屈折率分布測定方法Ａ２における２次元位相画像生成ステップＳ４のフローチャートである。屈折率分布測定方法Ａ２における２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２１で生成される複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は下記（５）式で表される。δｘ及びδｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、ｘ方向及びｙ方向の何れとも異なる方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。なお、複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は、複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）を下記（６）式のように変換した後に（５）式で求めてもよい。
複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像ｑの総和をｑｓｕｍ（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２２で生成される位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、ｑｓｕｍ（ｘ，ｙ，ｄ）の位相として下記（７）式で表される。ステップＳ２３では、この位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）を積分又はデコンボリューションすることにより、２次元位相画像を生成することができる。
なお、ステップＳ２１において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数のシアー方向それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
ステップＳ２２で複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて生成される位相微分画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されたものとなる。また、ステップＳ２１において複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成する場合には、ステップＳ２３で得られる２次元位相画像にライン状のノイズが現れるのを抑制することができる。
ここでは、ステップＳ２３において位相微分画像を積分又はデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ２３を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６７のデコンボリューションにおいて、ステップＳ２３のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネル（図Ａ１１）を用いることにより、ステップＳ２２で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。図Ａ１１に示されるカーネルは、図Ａ０６に示したカーネルとステップＳ２３のデコンボリューションで用いるカーネルとを畳み込み積分することにより得られる。
図Ａ１２は、屈折率分布測定方法Ａ３における２次元位相画像生成ステップＳ４のフローチャートである。屈折率分布測定方法Ａ３における２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ３１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
屈折率分布測定方法Ａ３のステップＳ３１の処理は、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分した上で、複数のバッチそれぞれについて屈折率分布測定方法Ａ１のステップＳ１１の処理を行うことに相当する。屈折率分布測定方法Ａ３のステップＳ３２，Ｓ３３の処理は、複数のバッチそれぞれについて屈折率分布測定方法Ａ２のステップＳ２１，Ｓ２２の処理を行うことに相当する。屈折率分布測定方法Ａ３のステップＳ３４の処理は、屈折率分布測定方法Ａ２のステップＳ２３の処理を行うことに相当する。
なお、ステップＳ３２において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のシアー方向それぞれについて、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
屈折率分布測定方法Ａ３におけるスペックルの抑制は、屈折率分布測定方法Ａ１及び屈折率分布測定方法Ａ２と同程度である。屈折率分布測定方法Ａ３におけるＳＭＲの改善は、屈折率分布測定方法Ａ１と屈折率分布測定方法Ａ２との中間の程度である。
ここでも、ステップＳ３４において位相微分画像を積分又はデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ３４を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６のデコンボリューションにおいて、ステップＳ３４のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネルを用いることにより、ステップＳ３３で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。
次に、屈折率分布測定方法Ｂについて説明する。図Ｂ０１～図Ｂ０３は、屈折率分布測定方法Ｂによる屈折率分布を測定する際に用いることができる観察装置１Ｄ～１Ｆの各構成を示す図である。図Ｂ０１に示される観察装置１Ｄは、図Ａ０１に示された観察装置１Ａの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。図Ｂ０２に示される観察装置１Ｅは、図Ａ０２に示された観察装置１Ｂの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。図Ｂ０３に示される観察装置１Ｆは、図Ａ０３に示された観察装置１Ｃの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。
解析部６０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部６０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部６０は、コンピュータであってよい。解析部６０は、干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６、屈折率分布算出部６７、表示部６８及び記憶部６９を備える。
干渉強度画像取得部６１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部６１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部６１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６及び屈折率分布算出部６７は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰ又はＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部６８は、処理すべき画像、処理途中の画像及び処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部６９は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６、屈折率分布算出部６７及び記憶部６９は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
記憶部６９は、干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６及び屈折率分布算出部６７に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ｄ～１Ｆの製造時又は出荷時に記憶部６９に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部６９に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部６９に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ＢＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６及び屈折率分布算出部６７それぞれの処理の詳細については後述する。
図Ｂ０４は、屈折率分布測定方法Ｂのフローチャートである。この屈折率分布測定方法Ｂは、観察装置１Ｄ～１Ｆの何れを用いた場合においても可能なものである。この屈折率分布測定方法Ｂは、干渉強度画像取得ステップＳ６１、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４、２次元位相画像生成ステップＳ６５、３次元位相画像生成ステップＳ６６及び屈折率分布算出ステップＳ６７を備える。
干渉強度画像取得ステップＳ６１の処理は干渉強度画像取得部６１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ６２の処理は第１複素振幅画像生成部６２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理は第２複素振幅画像生成部６３により行われる。位相共役演算ステップＳ６４の処理は位相共役演算部６４により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ６５の処理は２次元位相画像生成部６５により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ６６の処理は３次元位相画像生成部６６により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６７の処理は屈折率分布算出部６７により行われる。
干渉強度画像取得ステップＳ６１において、干渉強度画像取得部６１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部６１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
第１複素振幅画像生成ステップＳ６２において、第１複素振幅画像生成部６２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部６１により取得された基準位置の干渉強度画像に基づいて、基準位置の複素振幅画像を生成する。観察装置１Ｄ（図Ｂ０１）及び観察装置１Ｆ（図Ｂ０３）の場合には、第１複素振幅画像生成部６２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｅ（図Ｂ０２）の場合には、第１複素振幅画像生成部６２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。
第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、第２複素振幅画像生成部６３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部６２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。
屈折率分布測定方法Ｂにおける干渉強度画像取得ステップＳ６１、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２及び第２複素振幅画像生成ステップＳ６３は、それぞれ、屈折率分布測定方法Ａにおける干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２及び第２複素振幅画像生成ステップＳ３と同様の処理を行う。
位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の後に行われる。位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前に行われてもよい（後述）。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３が基準位置の複素振幅画像から複数段階を経て或るｚ位置の複素振幅画像を生成する場合には、その複数段階のうちの或る段階と次の段階との間において位相共役演算ステップＳ６４が行われてもよい（後述）。位相共役演算ステップＳ６４において、位相共役演算部６４は、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する。
なお、位相共役演算は、位相共役法（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）に基づく複素振幅画像に対する演算であり、対象物における光照射と光出力との関係を表すトランスミッション行列を計算し、その逆行列計算と座標変換と含む演算である。位相共役法は、位相共役（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、時間反転法（ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、時間反転（ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓａｌ）、デジタル位相共役（ｄｉｇｉｔａｌ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、デジタル位相共役法（ｄｉｇｉｔａｌ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）等と呼ばれる場合もある。詳細については後述する。
２次元位相画像生成ステップＳ６５において、２次元位相画像生成部６５は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部６３又は位相共役演算部６４により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。
２次元位相画像生成ステップＳ６５において、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行って求められた複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、複数の位置のうち、撮像部に対し相対的に近い位置については主として第１位相画像に基づいて２次元位相画像を生成し、撮像部に対し相対的に遠い位置については主として第２位相画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、位相共役演算ステップＳ６４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ６５において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部６９が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる点でよい。
３次元位相画像生成ステップＳ６６において、３次元位相画像生成部６６は、２次元位相画像生成部６５により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙ及び該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
屈折率分布算出ステップＳ６７において、屈折率分布算出部６７は、３次元位相画像生成部６６により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。
屈折率分布測定方法Ｂにおける２次元位相画像生成ステップＳ６５、３次元位相画像生成ステップＳ６６及び屈折率分布算出ステップＳ６７は、それぞれ、屈折率分布測定方法Ａにおける２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６と同様の処理を行う。
図Ｂ０５は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３及び２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序及び画像を説明する図である。この図は、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行わない態様を示す。この態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ２，ｚ３）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
図Ｂ０６～図Ｂ０８は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４及び２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序及び画像を説明する図である。これらの図は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前、途中又は後で位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う態様を示す。
図Ｂ０６に示される第１態様は、図Ｂ０４のフローチャートに対応するものである。この第１態様では、位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の後に行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ２，ｚ３）それぞれの複素振幅画像が生成される。
第１態様では、続いて、位相共役演算ステップＳ６４において、複数の位置それぞれについて、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、位相共役演算ステップＳ６４で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
図Ｂ０７に示される第２態様では、位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前に行われる。位相共役演算ステップＳ６４において、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。
第２態様では、続いて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、位相共役演算ステップＳ６４で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ２，ｚ３）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
図Ｂ０８に示される第３態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３が基準位置の複素振幅画像から２つの段階を経て複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する場合に、その２つの段階のうちの第１段階と第２段階との間において位相共役演算ステップＳ６４が行われる。
第３態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の第１段階において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ１，ｚ３，ｚ５）それぞれの複素振幅画像が生成される。続いて、位相共役演算ステップＳ６４において、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。
第３態様では、更に続いて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の第２段階において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１）式及び（２）式の自由伝搬の式により、位相共役演算ステップＳ６４で生成されたｚ方向位置（ｚ＝ｚ１，ｚ３，ｚ５）の複素振幅画像に基づいて、ｚ方向位置（ｚ＝ｚ２，ｚ４，ｚ６）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。
これらの第１態様、第２態様及び第３態様の間では、位相共役演算ステップＳ６４における複素振幅画像に対する位相共役演算の回数が異なる。位相共役演算ステップＳ６４の全体の処理時間は、第１態様より第３態様の方が短く、第２態様では更に短い。
図Ｂ０９は、３次元位相画像生成ステップＳ６６及び屈折率分布算出ステップＳ６７の各処理の順序及び画像を説明する図である。３次元位相画像生成ステップＳ６６において、２次元位相画像生成ステップＳ６５で生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像が生成される。このとき、撮像部に対し相対的に近い位置については、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成された２次元位相画像（図Ｂ０５の態様で生成された２次元位相画像）が主として採用される。一方、撮像部に対し相対的に遠い位置については、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行った後の複素振幅画像に基づいて生成された２次元位相画像（図Ｂ０６～図Ｂ０８の何れかの態様で生成された２次元位相画像）が主として採用される。続いて、屈折率分布算出ステップＳ６７において、３次元位相画像生成ステップＳ６６で生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布が求められる。なお、３次元屈折率分布を構成する各屈折率分布データ（例えば、図Ｂ０９において、３次元屈折率分布を構成する２次元の屈折率分布データ）は、屈折率断層データとなりえる。
ｚ方向の各位置の２次元位相画像の生成は、次のような３つの態様がある。位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像（図Ｂ０５の態様で生成される位相画像）を第１位相画像φ１とする。位相共役演算ステップＳ６４の処理を行った後の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像（図Ｂ０６～図Ｂ０８の何れかの態様で生成される位相画像）を第２位相画像φ２とする。光伝搬経路に沿った撮像部からの距離を表す変数ｚに対する微係数が０以下である重み関数αを用いる。重み関数の値は０以上１以下である。
第１態様では、重み関数αは、ｚが閾値ｚｔｈ以下である範囲において正値（例えば１）であり、それ以外の範囲において値が０であるとする。すなわち、２次元位相画像は下記（８）式で表される。
第２態様では、重み関数αは、ｚ方向の少なくとも一部範囲において連続的に値が変化するものとする。すなわち、２次元位相画像は下記（９）式で表される。
第３態様では、重み関数αは、光軸（ｚ方向）に直交する面における位置（ｘ，ｙ）に応じた値を有するものとする。すなわち、２次元位相画像は下記（１０）式で表される。
次に、図Ｂ１０及び図Ｂ１１を用いて、位相共役演算ステップＳ６４による位相共役演算の内容について説明する。
図Ｂ１０は、撮像部により干渉強度画像を撮像するときの入力光Ｕｉｎ（ｋｉｎ）及び出力光ｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）を示す図である。Ｕｉｎ（ｋｉｎ）は、観察対象物へ照射される光の波数ｋｉｎの複素振幅を表す。ｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）は、観察対象物から出力される光の位置ｒｏｕｔの複素振幅を表す。Ｕｉｎ（ｋｉｎ）とｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）との間の関係は、下記（１１）式で表される。列ベクトルＵｉｎの第ｎ要素Ｕｉｎ（ｋｉｎ
ｎ）は、波数ｋｉｎ
ｎの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕｏｕｔの第ｎ要素ｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ
ｎ）は、位置ｒｏｕｔ
ｎで観測される光の複素振幅を表す。Ｎ行Ｎ列の行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）は、Ｕｉｎ（ｋｉｎ）とｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）との間の線形な関係を表すものであって、トランスミッション行列と呼ばれる。このようなトランスミッション行列により、観察対象物における光の散乱過程を表すことができる。行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）の第ｎ１行第ｎ２列の要素Ｔｎ１，ｎ２は、波数ｋｉｎ
ｎ２で振幅１の平面波が入力されたときに位置ｒｏｕｔ
ｎ１で観測される光の複素振幅を表す。
図Ｂ１１は、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の入力光Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）及び出力光ｕｉｎ（ｒｉｎ）を示す図である。この場合、Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）は、観察対象物へ照射される光の波数ｋｏｕｔの複素振幅を表す。ｕｉｎ（ｒｉｎ）は、観察対象物から出力される光の位置ｒｉｎの複素振幅を表す。Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）とｕｉｎ（ｒｉｎ）との間の関係は、下記（１２）式で表される。列ベクトルＵｏｕｔの第ｎ要素Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ ｎ）は、波数ｋｏｕｔ ｎの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕｉｎの第ｎ要素ｕｉｎ（ｒｉｎ ｎ）は、位置ｒｉｎ ｎで観測される光の複素振幅を表す。Ｎ行Ｎ列の行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）は、Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）とｕｉｎ（ｒｉｎ）との間の線形な関係を表すものであって、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列である。
Ｕｉｎ（ｋｉｎ）は、下記（１３）式のようにｕｉｎ（ｒｉｎ）のフーリエ変換で表される。Ｕｏｕｔ（ｋｏｕｔ）は、下記（１４）式のようにｕｏｕｔ（ｒｏｕｔ）のフーリエ変換で表される。（１１）式～（１４）式を用いると、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）は、逆フーリエ変換を表す行列とトランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）を用いて下記（１５）式で表される。
位相共役演算ステップＳ６４では、まず、複素振幅画像に基づいて、撮像部により干渉強度画像を撮像したときのトランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）を求める。次に、このトランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）及び上記（１５）式に基づいて、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）を求める。そして、このトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）に基づいて、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅画像を求める。
複数の光照射方向それぞれについて撮像部により干渉強度画像を撮像するときの第ｎの光照射方向の入力光のベクトルＵｉｎ
ｎ（ｋｉｎ）は、下記（１６）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この入力光Ｕｉｎ
ｎ（ｋｉｎ）に対して、出力光ｕｏｕｔ
ｎ（ｒｏｕｔ）は、下記（１７）式で表される。この（１７）式は、第ｎの光照射方向の際に得られた複素振幅に対応する。
この（１６）式及び上記（１１）式から、下記（１８）式が得られる。そして、複数の光照射方向それぞれについて同様に求めると、下記（１９）式が得られる。このようにして、トランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）を求めることができる。さらに、この（１９）式及び上記（１５）式から、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）を求めることができる。
光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向のうちの第ｎの光照射方向の入力光Ｕｏｕｔ ｎ（ｋｏｕｔ）は、下記（２０）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この式から、この入力光Ｕｏｕｔ ｎ（ｋｏｕｔ）に対する出力光ｕｉｎ ｎ（ｒｉｎ）は、下記（２１）式で表される。この（２１）式は、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅を表す。このようにして、光照射及び撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅画像を求めることができる。
光照射及び撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒｉｎ，ｋｏｕｔ）を求める際に、上記（１５）式に示されるとおり、トランスミッション行列Ｔ（ｒｏｕｔ，ｋｉｎ）の逆行列を計算する必要がある。したがって、トランスミッション行列Ｔは、行要素の数と列要素の数とが互いに等しい正方行列であることが必要である。すなわち、干渉強度画像取得ステップＳ６１の際の観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元（ｍａｔｒｉｘ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）と、複素振幅画像の画素数とは、互いに等しいことが必要である。
両者を互いに等しくするには、干渉強度画像取得ステップＳ６１の際の観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元を画素数に一致させるか、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像のみを爾後の処理に用いるかすればよい。しかし、一般には、撮像部により得られる画像の画素数は例えば１０２４×１０２４であることから、観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元を画素数と同じにすることは容易ない。また、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像のみを爾後の処理に用いることは、解像度の低下につながる。
そこで、図Ｂ１２に示されるように、位相共役演算ステップＳ６４において、観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元と同じ画素数を各々有する複数の部分画像に複素振幅画像を分割し、これら複数の部分画像それぞれに対して位相共役演算を行い、その後に複数の部分画像を結合するのがよい。このとき、複数の部分画像のうち何れか２以上の部分画像が共通の領域を有していてもよい。
次に、屈折率分布測定方法Ｃについて説明する。図Ｃ０１～図Ｃ０３は、屈折率分布測定方法Ｃによる屈折率分布を測定する際に用いることができる観察装置１Ｇ～１Ｉの各構成を示す図である。図Ｃ０１に示される観察装置１Ｇは、図Ａ０１に示された観察装置１Ａの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。図Ｃ０２に示される観察装置１Ｈは、図Ａ０２に示された観察装置１Ｂの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。図Ｃ０３に示される観察装置１Ｉは、図Ａ０３に示された観察装置１Ｃの構成と比較すると、光源１１から撮像部４３に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。
解析部７０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部７０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部７０は、コンピュータであってよい。解析部７０は、干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６、第３複素振幅画像生成部７７、表示部７８及び記憶部７９を備える。
干渉強度画像取得部７１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部７１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部７１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６及び第３複素振幅画像生成部７７は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰ又はＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部７８は、処理すべき画像、処理途中の画像及び処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部７９は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭ及びＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６、第３複素振幅画像生成部７７及び記憶部７９は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
記憶部７９は、干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６及び第３複素振幅画像生成部７７に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ｇ～１Ｉの製造時又は出荷時に記憶部７９に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部７９に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部７９に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ＢＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５及び屈折率分布算出部７６及び第３複素振幅画像生成部７７それぞれの処理の詳細については後述する。
図Ｃ０４及び図Ｃ０５は、屈折率分布測定方法Ｃのフローチャートである。図Ｃ０５は、図Ｃ０４のフローチャートの一部を示す。この屈折率分布測定方法Ｃは、観察装置１Ｇ～１Ｉの何れを用いた場合においても可能なものである。この屈折率分布測定方法Ｃは、干渉強度画像取得ステップＳ７１、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７を備える。
干渉強度画像取得ステップＳ７１の処理は干渉強度画像取得部７１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ７２の処理は第１複素振幅画像生成部７２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ７３の処理は第２複素振幅画像生成部７３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ７４の処理は２次元位相画像生成部７４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ７５の処理は３次元位相画像生成部７５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ７６の処理は屈折率分布算出部７６により行われる。第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理は第３複素振幅画像生成部７７により行われる。
干渉強度画像取得ステップＳ７１において、干渉強度画像取得部７１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部７１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
第１複素振幅画像生成ステップＳ７２において、第１複素振幅画像生成部７２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部７１により取得された干渉強度画像に基づいて、複素振幅画像を生成する。観察装置１Ｇ（図Ｃ０１）及び観察装置１Ｉ（図Ｃ０３）の場合には、第１複素振幅画像生成部７２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｈ（図Ｃ０２）の場合には、第１複素振幅画像生成部７２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。第１複素振幅画像生成ステップＳ７２において生成される複素振幅画像は、干渉強度画像と同じ基準位置のものであってもよいし、基準位置の複素振幅画像に基づいて生成された他の位置のものであってもよい。
第２複素振幅画像生成ステップＳ７３において、第２複素振幅画像生成部７３は、複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った撮像部４３からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。
２次元位相画像生成ステップＳ７４において、２次元位相画像生成部７４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部７３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。
３次元位相画像生成ステップＳ７５において、３次元位相画像生成部７５は、２次元位相画像生成部７４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙ及び該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
屈折率分布算出ステップＳ７６において、屈折率分布算出部７６は、３次元位相画像生成部７５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより、第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める。
屈折率分布測定方法Ｃにおける干渉強度画像取得ステップＳ７１、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５及び屈折率分布算出ステップＳ７６は、それぞれ、屈折率分布測定方法Ａにおける干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５及び屈折率分布算出ステップＳ６と略同様の処理を行う。
第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第３複素振幅画像生成部７７は、複数の光照射方向それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３で用いた第１位置の複素振幅画像、及び、屈折率分布算出ステップＳ７６で算出した第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布に基づいて、第２位置の複素振幅画像を生成する。
第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５及び屈折率分布算出ステップＳ７６を含むステップＳ８３では、光伝搬経路に沿った撮像部４３からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める。ステップＳ８３及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理は繰り返し行われる。このことについて、図Ｃ０４～図Ｃ０７を用いて説明する。
図Ｃ０６は、観察対象物を含む領域と第１～第Ｊのブロックとの関係を説明する図である。この図に示されるように、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて観察対象物を含む領域を順に第１～第Ｊのブロックに区分する。この図では、Ｊ＝３としている。第１～第Ｊのブロックのうちの第ｊブロックは、ｚ＝ｚｊ－１からｚ＝ｚｊまでの領域である。各第ｊブロックにおいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚｊの位置（遠端）を第２位置とする。
図Ｃ０７は、第１～第Ｊのブロックにおける処理の手順を説明する図である。この図に示されるように、各第ｊブロックについて、ステップＳ８３で、第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像及び２次元位相画像を生成し、第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成し更に３次元屈折率分布を求める。各第ｊブロックについて、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で、第１位置の複素振幅画像、及び、ステップＳ８３で算出した３次元屈折率分布に基づいて、第２位置の複素振幅画像を生成する。
第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で生成された第（ｊ＋１）ブロックの第２位置の複素振幅画像は、次の第ｊブロックの第１位置の複素振幅画像として用いられて、第ｊブロックについてステップＳ８３及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理が行われる。第１～第Ｊのブロックそれぞれについて３次元屈折率分布が得られたら、これらを結合することで観察対象物の全体の３次元屈折率分布が得られる。なお、第１～第Ｊのブロックそれぞれの３次元屈折率分布（例えば、図Ｃ０７の第１ブロックの屈折率分布、第２ブロックの屈折率分布及び第３ブロックの屈折率分布）は、屈折率断層データとなりえる。
図Ｃ０４及び図Ｃ０５に示されるように、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２の後のステップＳ８１においてｊ＝０とされ、続くステップＳ８２においてｊの値が１増されてｊ＝１とされて、第１ブロックについてステップＳ８３及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理が行われる。すなわち、撮像部に対し最も近い第１ブロックについては、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２で生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚ０の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚ１の位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理が順に行われる。その後、ステップＳ８２に戻る。
第ｊブロック（ここでは、ｊは２以上Ｊ未満）については、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で第（ｊ－１）ブロックについて生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚｊの位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理が順に行われる。その後、ステップＳ８２に戻る。
撮像部に対し最も遠い最終段ブロックである第Ｊブロックについては、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で第（Ｊ－１）ブロックについて生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚＪ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚＪの位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）の処理が行われる。
第Ｊブロックについては、ステップＳ８３の後のステップＳ８４において、最終段ブロックであると判断されて、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７に進むことなく終了すればよい。なお、第Ｊブロックについては、３次元位相画像生成ステップＳ７５の後において、最終段ブロックであると判断されて、屈折率分布算出ステップＳ７６に進むことなく終了してもよく、この場合には、観察対象物の全体の３次元位相画像が得られる。
なお、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて観察対象物を含む領域を順に２個のブロックに区分してもよく、その場合には、上述した第１ブロックについての処理及び最終段の第Ｊブロックについての処理を行えばよい。また、観察対象物を含む領域を複数のブロックに区分しなくてもよく、その場合には、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）及び第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理を順に１回のみ行ってもよい。
次に、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の詳細について説明する。観察対象物に光を照射して干渉強度画像を取得する際に、各第ｊブロックにおいて、第２位置（ｚ＝ｚｊ）の光波面は、第ｊブロックの内部を伝搬して第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）に到達し更に撮像部まで伝搬する。そこで、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第ｊブロックの屈折率分布を考慮した数値計算により、第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）の光波面を第ｊブロックの内部を逆伝搬させることで、第２位置（ｚ＝ｚｊ）の光波面を求める。すなわち、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、複数の光照射方向それぞれについて、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）の複素振幅画像及び第ｊブロックの屈折率分布に基づいて、第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）の複素振幅画像を生成する。この処理に際して、媒質の屈折率分布を考慮して光波面の伝搬を数値計算する手法が用いられる。このような不均一媒質伝搬の数値計算手法として、ＢＰＭ（Ｂｅａｍ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）及びＳＳＮＰ（Ｓｐｌｉｔ－Ｓｔｅｐ Ｎｏｎ－Ｐａｒａｘｉａｌ）等が知られている。以下では、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７においてＢＰＭを用いた処理について説明する。
図Ｃ０８は、ＢＰＭの処理内容を説明する図である。この図は、任意の第ｊブロックを示している。この図に示されるように、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて第ｊブロックをＭ個（この図では７個）のスライス（第１～第Ｍのスライス）に区分する。各スライスの厚みは波長程度である。
各スライスの厚みは一定であってもよい。ここでは、各スライスの厚みを一定値のΔｚとする。第ｊブロックの第１～第Ｍのスライスのうちの第ｍスライスは、位置（ｚｊ－１＋（ｍ－１）Δｚ）から位置（ｚｊ－１＋ｍΔｚ）までである。第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）から第２位置（ｚ＝ｚｊ）へ向かって順に、第１～第Ｍのスライスにおいて順次に、屈折率分布に応じた位相変化を与えて光波面をΔｚだけ逆伝搬させる。
なお、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理における各スライスの厚みΔｚは、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３の処理で第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する際の位置間隔と、異なっていてもよいし、一致していてもよい。
位置ｚにある厚みΔｚのスライスを逆伝搬する際に光波面に与えられる位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（２２）式で表される。この（２２）式中のｋｖは真空中での光の波数である。δｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、位置ｚにおける観察対象物の屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）と背景（媒質）の屈折率ｎｂとの差分であり、下記（２３）式で表される。また、ｃｏｓθは下記（２４）式で表される。
第ｍスライスの位置（ｚ＝ｚｊ－１＋（ｍ－１）Δｚ）における光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚ）とすると、第ｍスライスの内部を光が逆伝搬した後の位置（ｚ＋Δｚ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）は、下記（２５）式で表される。この（２５）式中のＰ（ｋｘ，ｋｙ；Δｚ）は、下記（２６）式で表される。（２５）式は、光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ）と位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）との積をフーリエ変換し、このフーリエ変換の結果とＰ（ｋｘ，ｋｙ；Δｚ）との積を逆フーリエ変換することで、厚みΔｚのスライスを伝搬した後の位置（ｚ＋Δｚ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）を求めることを表している。ＰΔｚは、Δｚの光伝搬の演算を行う関数である。
第ｊブロックの各スライスにおける光波面の伝搬は、下記（２７）式～（２９）式で表される。すなわち、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）における光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１）とすると、第ｊブロックの第１スライスを伝搬した後の光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋Δｚ）は、下記（２７）式で表される。第ｊブロックの第（ｍ－１）スライスを伝搬した後の光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋（ｍ－１）Δｚ）とすると、第ｊブロックの第ｍスライスを伝搬した後の光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋ｍΔｚ）は、下記（２８）式で表される。第ｊブロックの第（Ｍ－１）スライスを伝搬した後の光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ－１＋（Ｍ－１）Δｚ）とすると、第ｊブロックの第Ｍスライスを伝搬した後の第２位置（ｚ＝ｚｊ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚｊ）は、下記（２９）式で表される。
このようにして、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第ｊブロックの屈折率分布を考慮した数値計算により、第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）の光波面を第ｊブロックの内部をスライス毎に順次に逆伝搬させることで、第２位置（ｚ＝ｚｊ）の光波面を求めることができる。
図Ｃ０９は、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７のフローチャートである。ステップＳ４１において、位置ｚを、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚｊ－１）に初期化する。ステップＳ４２において、位置ｚにおける光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ）と位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）との相互作用を求める。ステップＳ４３において、その相互作用後の光の波面を距離Δｚだけ伝搬させて、位置ｚ＋Δｚにおける光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）を求める。ステップＳ４４において、Δｚを加算したｚを新たなｚとする。ステップＳ４４において、位置ｚが第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）に未だ到達していないと判断されれば、ステップＳ４２に戻って、ステップＳ４２～Ｓ４４を繰り返す。ステップＳ４４において、位置ｚが第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）に到達したと判断されれば、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理を終了する。終了時に取得された光の複素振幅が第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚｊ）における複素振幅となる。
以上に説明した屈折率分布測定方法Ａ～Ｃの何れも、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。屈折率分布測定方法Ａ～Ｃの何れも、観察対象物としての３次元培養体の屈折率分布を測定するのによい。
なお、自己干渉を用いる観察装置及び屈折率分布測定方法でもよい。例えば、図Ｃ１０に示される観察装置１Ｊは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ミラー４４、レンズ４２、撮像部４３及び解析部７０などを備える。これまでに説明した観察装置の構成と比較すると、観察装置１Ｊでは、光源１１から出力された光は、光ファイバ１４により導光された後、２分岐されることなく光出射端１８から出射される点で相違する。また、観察装置１Ｊは、ビームスプリッタ４１に替えてミラー４４が設けられている点で相違する。観察装置１Ｊは、干渉光学系を備えていない。撮像部４３は、複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た光の自己干渉による基準位置の干渉強度画像を撮像することができる。解析部７０は、このような自己干渉による干渉強度画像を用いて、これまでに説明したと同様の画像処理を行うことができる。
また、第１位置から第２位置までの間の観察対象物Ｓの３次元屈折率分布は、３次元位相画像に基づく屈折率分布でなくてもよく、屈折率分布を取得できる屈折率分布取得装置を別途用いて取得してもよい。この場合、観察装置は、（１） 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光の基準位置の干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの基準位置の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得部と、（２） 複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、（３） 光伝搬経路に沿った撮像部からの距離に関し第１位置から第２位置までの間の、観察対象物の３次元屈折率分布を取得する屈折率分布取得部と、（４） 複数の光照射方向それぞれについて、第１位置の複素振幅画像及び３次元屈折率分布に基づいて第２位置の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部（観察装置１Ａ～１Ｄの第３複素振幅画像生成部に相当）と、を備えればよい。
また、この場合、屈折率分布測定方法は、（１） 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光の基準位置の干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの基準位置の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得ステップと、（２） 複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、（３） 光伝搬経路に沿った撮像部からの距離に関し第１位置から第２位置までの間の、観察対象物の３次元屈折率分布を取得する屈折率分布取得ステップと、（４） 複数の光照射方向それぞれについて、第１位置の複素振幅画像及び３次元屈折率分布に基づいて第２位置の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、を備えればよい。
本開示の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法である。一実施形態において、毛細胆管領域の特定は、観察対象物中の領域が毛細胆管の特徴を有することに基づいて行われる。すなわち、一実施形態において、観察対象物中の領域であって、毛細胆管の特徴を有する領域が、毛細胆管領域であると特定される。また、一実施形態において、毛細胆管領域の特定は、観察対象物中の領域が毛細胆管の特徴を有することに対応する特徴量を利用した機械学習モデルによって行われてもよい。
一実施形態に係る毛細胆管の特徴は、領域が肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴からなる群より選択される１つ以上の特徴を含み、一実施形態に係る毛細胆管の特徴は、領域が肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴を含む。領域の屈折率とは、当該領域における屈折率の平均値、中央値、最小値又は最大値等の統計値を指す。また、肝細胞の屈折率とは、肝細胞全体又は一部における屈折率の平均値、中央値、最小値又は最大値等の統計値を指す。略円形領域とは、真円度が閾値以上である領域のことを表す。上記閾値は、観察対象物の種類及び状態並びに観察対象物に含まれる肝細胞の種類及び含有量などに応じて定めることができ、毛細胆管の特定を行う観察対象物（サンプル）とは別の観察対象物（リファレンス）の屈折率分布データにおいて他の毛細胆管の特徴を有する領域が毛細胆管領域と特定されるように定めることもできる。例えば、サンプルが肝細胞塊である場合には、リファレンスとして別の肝細胞塊を用いることができ、２次元肝培養体を用いることもできる。上記閾値は、例えば６５％であってよく、７０％であってもよく、７５％であってもよく、８０％であってもよく、８５％であってもよい。略円管形領域とは、管状の領域であって、領域の管流軸に垂直な断面又は屈折率断層データにおける断層面視の断面が略円形となる領域のことである。管流軸とは、管の断面中心（重心）の集合により形成される軸線からなる軸である。領域の周縁部とは、領域に含まれない観察対象物の部分のうち、領域に隣接する部分（隣接部分）及び隣接部分から所定距離だけ離れた部分を含む概念であり、密着結合により毛細胆管の管壁を形成する肝細胞の占める部分のうち、管腔近傍の部分に相当する。
一実施形態において、毛細胆管の特徴は、さらに、微絨毛に由来する領域であって、領域全体の屈折率よりも屈折率の高い領域を有する特徴を含む。一般に、微絨毛に由来する領域は、屈折物分布データが３次元である場合には略直線形状又は曲線形状（湾曲形状、螺旋形状など）となり、屈折物分布データが屈折率断層データ等の２次元である場合には、略直線形状、曲線形状又は点形状になる。微絨毛に由来する領域が略直線形状又は曲線形状である場合、その長さは例えば１～２μｍ程度であるが、観察対象物の種類及び状態並びに観察対象物に含まれる肝細胞の種類及び含有量などに応じて、より長くなることもあり、より短くなることもある。
他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する方法である。一実施形態において、毛細胆管領域の評価は、毛細胆管のパラメータに基づいて行われる。すなわち、一実施形態において、観察対象物中の毛細胆管領域であって、毛細胆管のパラメータがより優れた値である毛細胆管領域が、より質が高い毛細胆管であると評価される。また、一実施形態において、毛細胆管領域の評価は、毛細胆管のパラメータに対応する特徴量を利用して、パラメータがより優れた値である毛細胆管領域が、より質が高い毛細胆管であるとして学習された機械学習モデルによって行われてもよい。
一実施形態において、毛細胆管のパラメータは、管流軸に垂直な断面若しくは断層面視の断面の面積若しくは周囲長、屈折率、屈折率の中央値、微絨毛の本数並びに微絨毛の平均長さからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、一実施形態において、毛細胆管のパラメータは、管流軸に垂直な断面若しくは断層面視の断面の面積、屈折率、微絨毛の本数並びに微絨毛の平均長さからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含む。断面の面積は、太い毛細胆管ほど成熟した毛細胆管であると考えられることから、断面の面積が大きい毛細胆管領域を質が高い毛細胆管であると判断してもよい。屈折率は、毛細胆管領域の屈折率であり、微絨毛の占める空間及び内容物の量が多くなるほど屈折率が高くなると考えられることから、屈折率が高い毛細胆管領域を質が高い毛細胆管であると評価してもよい。微絨毛の本数及び長さは、微絨毛の表面積が大きくなるほど毛細胆管への胆汁酸の分泌量及び肝代謝物の排泄量が多くなると考えられることから、微絨毛の数が多い毛細胆管領域ほど質が高い毛細胆管であると判断してもよく、微絨毛の平均長さが長い毛細胆管領域ほど質が高い毛細胆管であると判断してもよい。
一実施形態において、毛細胆管領域を評価する方法は、評価する前に、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定するステップを含んでもよい。すなわち、一実施形態における毛細胆管領域を評価する方法は、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定するステップと、特定された毛細胆管領域における毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価するステップと、を含む。一実施形態において、毛細胆管領域を評価する方法は、観察対象物の屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定するステップであって、毛細胆管領域の特定が、観察対象物中の領域が毛細胆管の特徴を有することに基づいて行われ、上記毛細胆管の特徴が、肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴を含むステップと、特定された毛細胆管領域における毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価するステップと、を含む。
他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法により特定された毛細胆管領域の数、及び／又は肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて毛細胆管領域を評価する方法により得られた毛細胆管領域の評価、に基づいて、肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法である。毛細胆管の数を指標として肝細胞を含有する観察対象物の質を評価することは一般的であり、また、肝細胞を含有する観察対象物に含まれる毛細胆管の質が高いほど肝細胞を含有する観察対象物自体の質が高いことは自明であるから、毛細胆管領域の特定方法及び評価方法により、肝細胞を含有する観察対象物自体を評価することができる。例えば、図３５に示した例においては、毛細胆管領域の数が多い肝細胞塊Ａを質の高い肝細胞塊であると評価することができる。
一実施形態に係る肝細胞を含有する観察対象物の評価方法は、例えば以下のような態様で用いることができる。
例えば、肝細胞を含有する観察対象物の分化の目安の１つとして、毛細胆管の形成を利用できることが知られているため、肝細胞を含有する観察対象物に含まれる毛細胆管領域の数を評価することによって、肝細胞を含有する観察対象物の分化を評価することができる。すなわち、他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、肝細胞を含有する観察対象物の分化を評価する方法である。
例えば、一実施形態に係る肝細胞を含有する観察対象物の評価方法は、肝細胞の培養方法の評価に用いることができる。肝細胞の培養方法としては、通常の平面培養に加えて、サンドイッチ培養法、３次元スフェロイド培養法、中空繊維バイオリアクター法、マイクロパターン共培養法、灌流マルチウェルプレート培養法、マイクロ流体肝バイオチップ培養法及びマイクロ流体多臓器デバイス培養法などの様々な培養方法が開発されているところ、これらの方法により培養された肝細胞を含有する観察対象物に含まれる毛細胆管領域の数を評価することによって、肝細胞の培養方法を評価することができる。すなわち、他の一側面は、肝細胞を培養するステップと、屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法により特定された毛細胆管領域の数、及び／又は屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータによって毛細胆管領域を評価する方法により得られた毛細胆管領域の評価、に基づいて肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法を用いて、培養によって得られた観察対象物を評価するステップと、を含む、肝細胞の培養方法を評価する方法である。肝細胞の培養方法の評価は、毛細胆管領域を非侵襲的に特定及び評価することができる利点を活かし、例えば図３６に示すように、肝細胞塊の培養日数に応じた毛細胆管領域の数に基づいて行うこともできる。
例えば、一実施形態に係る肝細胞を含有する観察対象物の評価方法は、薬物のスクリーニングに用いることができる。毛細胆管は、肝細胞において合成された胆汁酸の分泌先であることに加えて、薬物の主要な排泄方法である肝代謝の排泄経路である。また、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）は、既承認薬の市場撤退及び使用制限並びに新薬が安全性に関して承認に至らないことの主要因の１つであり、肝細胞障害型、胆汁うっ滞型及び混合型等が存在するところ、特に胆汁うっ滞型ＤＩＬＩにおいては、毛細胆管の形態異常が見られることが知られている。したがって、一実施形態に係る肝細胞を含有する観察対象物の評価方法を用いたスクリーニングによって、例えば毛細胆管領域の屈折率の異常な上昇を引き起こす薬物は、胆汁酸又は肝代謝物の異常分泌又は異常排泄を引き起こしうる薬物であるとして、また、毛細胆管の形態異常を引き起こす薬物は、胆汁うっ滞型ＤＩＬＩを引き起こしうる薬物であるとして、それぞれ開発候補から除外することが可能となる。従来は臨床段階で始めて明らかとなっていたこれらの事象をインビトロにおいて明らかにすることができれば、事後的に既承認薬の市場撤退若しくは使用制限せざるを得なくなること及び新薬が安全性に関して承認に至らなくなることによって、臨床試験に対する莫大な費用及び時間の投資の失敗を未然に防止することができる。すなわち、他の一側面は、肝細胞を含有する観察対象物に薬物を添加するステップと、屈折率分布データを用いて観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法により特定された毛細胆管領域の数、及び／又は屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータによって毛細胆管領域を評価する方法により得られた毛細胆管領域の評価、に基づいて肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法を用いて、培養によって得られた観察対象物を評価するステップと、を含む、薬物のスクリーニング方法である。薬物のスクリーニングは、例えば毛細胆管の形態異常を指標として行うことができ、図３７に示した例においては、肝細胞塊中の毛細胆管の拡張を引き起こす薬物Ａ及び収縮を引き起こす薬物Ｂを、毛細胆管領域の断面の面積に基づいて、胆汁うっ滞型ＤＩＬＩを引き起こしうる薬物として開発候補から除外することができる。また、例えば微絨毛に着目した毛細胆管の形態異常を指標として行うこともでき、図３８に示した例においては、微絨毛の短縮を引き起こす薬物Ａ、微絨毛の減少を引き起こす薬物Ｂ並びに微絨毛の短縮及び減少を引き起こす薬物Ｃを、胆汁うっ滞型ＤＩＬＩを引き起こしうる薬物として開発候補から除外することができる。これらのスクリーニングは、毛細胆管領域を非侵襲的に特定及び評価することができる利点を活かし、複数のタイムポイントにおける経時的変化に基づいても行うことができ、図３９に示した例においては、薬物添加後の培養日数に応じた微絨毛の短縮を引き起こす薬物を、胆汁うっ滞型ＤＩＬＩを引き起こしうる薬物として開発候補から除外することができる。
また、一実施形態に係る毛細胆管領域を特定する方法は、例えば以下の態様で用いることができる。
例えば、一実施形態に係る毛細胆管領域を特定する方法は、毛細胆管ネットワーク形成の評価に用いることができる。毛細胆管は、形成後にさらに３次元のネットワークを形成して肝代謝物の分泌や排泄を担うことが知られているところ、一実施形態に係る毛細胆管領域を特定する方法を用いて肝細胞を含有する観察対象物に含まれる毛細胆管領域を網羅的に特定することによって、毛細胆管ネットワークの形成を評価することができる。さらに、一実施形態においては、図４０に示した例のように、タウロコール酸等のネットワーク形成を促進する胆汁酸の添加により誘発された毛細胆管ネットワークの形成を評価してもよい。また、一実施形態においては、リトコール酸等のネットワーク形成を阻害する胆汁酸の添加による毛細胆管ネットワークの形成阻害を評価してもよい。これらの評価は、毛細胆管領域を非侵襲的に特定することができる利点を活かし、複数のタイムポイントにおける経時的変化に基づいても行うことができ、また毛細胆管領域の体積を評価指標として行うこともできる。
例えば、一実施形態に係る毛細胆管領域を特定する方法は、毛細胆管からの内容物を回収するためのガイドとしても用いることができる。毛細胆管は肝代謝の主要経路の１つであるところ、肝細胞を含有する観察対象物内の毛細胆管領域を非侵襲的に特定することができれば、例えば図４１に示す例のように、特定された毛細胆管にドレーンチューブ（ドレーン）又はカテーテルなどを挿入し、内容物を回収することができる。回収された内容物は、例えば質量分析、液体クロマトグラフィー、又はガスクロマトグラフィー等によって分析することができる。
また、一実施形態に係る毛細胆管領域を評価する方法は、肝臓の臨床検体における肝疾患の診断方法、肝疾患の診断を補助する方法又は肝疾患の診断のためのデータを取集する方法としても用いることができる。肝疾患を発症した肝臓において毛細胆管の異常が生じうることが明らかとなっており、例えばＢｙｌｅｒ病の肝臓においては、毛細胆管内の微絨毛が極めて少なくなる「Ｂｙｌｅｒ’ｓ Ｂｉｌｅ」と呼ばれる病変が認められる。また、肝疾患由来の胆汁うっ滞においては、毛細胆管の拡大、微絨毛の減少及びブレブの形成が認められる。これらの知見は電子顕微鏡により明らかとなった知見であるが、一実施形態に係る屈折率分布データを用いた非侵襲的な毛細胆管領域の評価方法によれば、肝臓の臨床検体において、ＨＥ染色に代表される他の病理染色等と拮抗することなく、かつ簡便に毛細胆管の異常を検出することができる。屈折率分布データで毛細胆管の異常を検出することができれば、より早く、より多くの臨床検体を取扱うことが可能になると期待される。例えば図４２に示した例では、臨床検体Ａ～Ｃ中の毛細胆管領域を比較して、微絨毛が短い臨床検体Ｂ及び微絨毛が短く、かつ少ない臨床検体Ｃを、肝疾患を発症した肝臓の臨床検体である可能性が高いとする診断を補助することができる。
以下、実施例等により、詳しく説明するが、これらに限定されるものではない。
［実施例１：位相差及び蛍光顕微鏡を用いた２次元肝培養体の毛細胆管領域の特定］
ヒト肝がん由来細胞（ＨｅｐＧ２）をガラスボトムディッシュ(ＭａｔＴｅｋ社製)に播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ ＣＯ２、３７度、１００％湿度の条件下で５日間培養して、２次元肝培養体を調製した。培地を除去した後、毛細胆管に分泌されることが知られる蛍光標識された胆汁酸であるＣＬＦ（ｃｈｏｌｙｌ―ｌｙｓｙｌ―ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含有するハンクス平衡塩溶液（終濃度２μＭ）を添加し、５％ ＣＯ２、３７℃、１００％湿度の条件下で４５分間インキュベートした。
ヒト肝がん由来細胞（ＨｅｐＧ２）をガラスボトムディッシュ(ＭａｔＴｅｋ社製)に播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ ＣＯ２、３７度、１００％湿度の条件下で５日間培養して、２次元肝培養体を調製した。培地を除去した後、毛細胆管に分泌されることが知られる蛍光標識された胆汁酸であるＣＬＦ（ｃｈｏｌｙｌ―ｌｙｓｙｌ―ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含有するハンクス平衡塩溶液（終濃度２μＭ）を添加し、５％ ＣＯ２、３７℃、１００％湿度の条件下で４５分間インキュベートした。
倒立顕微鏡ＤＭ ＩＬ ＬＥＤ（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、位相差顕微鏡像及び蛍光像を同視野で撮像した。倍率２０倍の対物レンズを用いた。蛍光像は、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５００～５５０ｎｍの条件で取得した。結果を図４３に示す。
位相差顕微鏡像から細胞と細胞の間に管腔構造（図中矢印１及び２）が存在し、蛍光像から管腔構造にＣＬＦの蓄積が確認された。以上から、図中矢印１及び２の領域が毛細胆管領域であると特定した。
［実施例２：光回折トモグラフィ（ＯＤＴ）を用いた２次元肝培養体の毛細胆管領域の評価］
実施例１で用いた２次元肝培養体について、観察装置１Ａ及び屈折率分布測定方法Ａ２に示したＯＤＴを用いて屈折率分布データを取得した。倍率６０倍の対物レンズを用いた。得られた屈折率分布データから抽出した代表的な屈折率断層データを図４４及び図４５に示す。
実施例１で用いた２次元肝培養体について、観察装置１Ａ及び屈折率分布測定方法Ａ２に示したＯＤＴを用いて屈折率分布データを取得した。倍率６０倍の対物レンズを用いた。得られた屈折率分布データから抽出した代表的な屈折率断層データを図４４及び図４５に示す。
図４４において、実施例１で毛細胆管領域と特定した領域（図中矢印１及び２）について、肝細胞間に存在する略円形領域（真円度８６％。以下、段落中の括弧内の数値は、毛細胆管２における値を示す。）である特徴、屈折率（１．３３６）が肝細胞（１．３４４）よりも低い特徴、及び周縁部の屈折率（１．３５９）が肝細胞の屈折率（１．３４４）よりも高い特徴が認められた。加えて、図４５において、実施例１で毛細胆管領域と特定した領域（図中矢印１及び２）について、さらに、微絨毛（ＭＶ）に由来する領域であって、毛細胆管（ＢＣ）の管腔の屈折率（１．３３３）よりも屈折率の高い（１．３４４）領域を有する特徴が認められた。図４５において、Ｇは毛細胆管領域の重心を表す。
［実施例３：光回折トモグラフィ（ＯＤＴ）を用いた肝細胞塊の毛細胆管領域の評価］
ヒト肝がん由来細胞（ＨｅｐＧ２）を細胞低接着性の区画を有する細胞培養容器（ＡＧＣテクノグラス製、「ＥＺＳＰＨＥＲＥ」）に１ウェル当たり１．００ｘ１０５細胞の密度で播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ ＣＯ２、３７℃、１００％湿度の条件下で３日間培養した。そこに、ジメチルスルホキシド（シグマアルドリッチ社製）を終濃度０．０５％となるように添加し、さらに１日培養して、肝細胞塊を調製した。
ヒト肝がん由来細胞（ＨｅｐＧ２）を細胞低接着性の区画を有する細胞培養容器（ＡＧＣテクノグラス製、「ＥＺＳＰＨＥＲＥ」）に１ウェル当たり１．００ｘ１０５細胞の密度で播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ ＣＯ２、３７℃、１００％湿度の条件下で３日間培養した。そこに、ジメチルスルホキシド（シグマアルドリッチ社製）を終濃度０．０５％となるように添加し、さらに１日培養して、肝細胞塊を調製した。
得られた肝細胞塊（肝細胞塊１）について、観察装置１Ａ及び屈折率分布測定方法Ｃに示したＯＤＴを用いて屈折率分布データを取得した。倍率６０倍の対物レンズを用いた。得られた屈折率分布データから抽出した代表的な屈折率断層データを図４６及び図４７に示す。実施例２で取得した屈折率分布データ及び肝細胞塊１について取得した屈折率分布データから得られたパラメータを表１～４に示す。また、同様の方法で調製した別の肝細胞塊（肝細胞塊２）について、同様の方法で取得した屈折率分布データから抽出した代表的な屈折率断層データを図４８に示す。
図４６において、２次元肝培養体で見られた特徴と同様の特徴をもつ構造(毛細胆管)が肝細胞塊にも存在することが確認された。任意の断面を見ると、例えばＺ＝２０．８μｍには５つ、Ｚ＝２８．８μｍには１つ、Ｚ＝６６．８μｍには２つの毛細胆管が存在することが確認されたことから、肝細胞塊において屈折率分布データを用いて毛細胆管領域を特定できることが示された。
図４７において、毛細胆管の存在の確認に加えて、それぞれの毛細胆管で、管腔の大きさ、微絨毛の数及び屈折率などが異なることが確認できたことから、肝細胞塊において屈折率分布データを用いて毛細胆管領域を評価できることが示された。さらに、例えば毛細胆管７において、毛細胆管領域の内部に管腔内構造Ｘが確認されたことから、実施例で用いた特徴及びパラメータ以外にも、屈折率分布データを用いることで、毛細胆管領域の特定若しくは評価、肝細胞塊の評価又は薬物スクリーニングなどに有用な特徴及びパラメータの存在を見出すことができる可能性があることが示唆された。
図４８において、毛細胆管領域の評価例として、例えば屈折率断層データにおける２つの毛細胆管領域のパラメータを比較すると、図中の毛細胆管１は毛細胆管２よりも断面の面積及び断面の周囲長が多く、微絨毛の数が多く、屈折率及び屈折率の中央値が大きいことから、毛細胆管１の方が質の高い毛細胆管である、と判断し得る。
１Ａ～１Ｊ…観察装置、２…記録媒体、１１…光源、１２…レンズ、１３…光入射端、１４…光ファイバ、１５…ファイバカプラ、１６，１７…光ファイバ、１８，１９…光出射端、２１…レンズ、２２…ミラー、２３…レンズ、２４…コンデンサレンズ、２５…対物レンズ、３１…レンズ、３２…ミラー、３３…駆動部、３４…レンズ、４１…ビームスプリッタ、４２…レンズ、４３…撮像部、４４…ミラー，５０…解析部、５１…干渉強度画像取得部、５２…第１複素振幅画像生成部、５３…第２複素振幅画像生成部、５４…２次元位相画像生成部、５５…３次元位相画像生成部、５６…屈折率分布算出部、５７…表示部、５８…記憶部、６０…解析部、６１…干渉強度画像取得部、６２…第１複素振幅画像生成部、６３…第２複素振幅画像生成部、６４…位相共役演算部、６５…２次元位相画像生成部、６６…３次元位相画像生成部、６７…屈折率分布算出部、６８…表示部、６９…記憶部、７０…解析部、７１…干渉強度画像取得部、７２…第１複素振幅画像生成部、７３…第２複素振幅画像生成部、７４…２次元位相画像生成部、７５…３次元位相画像生成部、７６…屈折率分布算出部、７７…第３複素振幅画像生成部、７８…表示部、７９…記憶部。
Claims (14)
- 肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データを用いて、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定する方法であって、前記屈折率分布データが、所定の方向における屈折率断層データである、方法。
- 毛細胆管領域の特定が、観察対象物中の領域が毛細胆管の特徴を有することに基づいて行われ、前記毛細胆管の特徴が、肝細胞間に存在する略円形若しくは略円管形領域である特徴、領域の屈折率が肝細胞の屈折率よりも低い特徴、並びに領域の周縁部の屈折率が肝細胞の屈折率よりも高い特徴を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記毛細胆管の特徴が、さらに、微絨毛に由来する領域であって、領域全体の屈折率よりも屈折率の高い領域を有する特徴を含む、請求項２に記載の方法。
- 肝細胞を含有する観察対象物の屈折率分布データから得られる毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する方法であって、前記毛細胆管のパラメータが、管流軸に垂直な断面若しくは断層面視の断面の面積、屈折率、微絨毛の本数並びに微絨毛の平均長さのうち少なくとも１つのパラメータを含み、前記屈折率分布データが、所定の方向における屈折率断層データである、方法。
- 前記肝細胞を含有する観察対象物が肝細胞塊である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の方法によって、観察対象物に含まれる毛細胆管領域を特定するステップを含み、特定された毛細胆管領域における毛細胆管のパラメータに基づいて、毛細胆管領域を評価する、請求項４に記載の方法。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の方法により特定された毛細胆管領域の数及び／又は請求項４に記載の方法により得られた毛細胆管領域の評価に基づいて、肝細胞を含有する観察対象物を評価する方法。
- 肝細胞を培養するステップと、請求項７に記載の方法を用いて、培養によって得られた観察対象物を評価するステップと、を含む、肝細胞の培養方法を評価する方法。
- 肝細胞を含有する観察対象物に薬物を添加するステップと、請求項７に記載の方法を用いて、薬物を添加された観察対象物を評価するステップと、を含む、薬物のスクリーニング方法。
- 前記肝細胞を含有する観察対象物が肝細胞塊である、請求項９に記載の方法。
- 肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、を備える、毛細胆管領域の特定装置。
- 肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得部と、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定部と、請求項４に記載の方法によって毛細胆管領域を評価する評価部と、を備える、毛細胆管領域の評価装置。
- 肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、をコンピュータに実行させるプログラム。
- 肝細胞を含有する観測対象物の屈折率分布データを取得するデータ取得ステップと、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法によって観察対象物中に含まれる毛細胆管領域を特定する特定ステップと、請求項４に記載の方法によって毛細胆管領域を評価する評価ステップと、をコンピュータに実行させるプログラム。
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| KR101855366B1 (ko) | 2016-11-08 | 2018-05-09 | 주식회사 토모큐브 | 간세포 내 지질을 3d 비표지 영상화 및 정량화하는 방법 및 장치 |
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| 石丸 伊知郎，生きたままの細胞内３次元成分分布時系列計測 単一細胞分光トモグラフィ 3D-Time Series Compositional D，BIO INDUSTRY，Vol.25, No.2，2008年，pp.55-66 |
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