WO2006082890A1 - 胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法および該方法により誘導される肝細胞 - Google Patents

胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法および該方法により誘導される肝細胞 Download PDF

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WO2006082890A1
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hepatocytes
culture
liver
induced
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Noriaki Tanaka
Naoya Kobayashi
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing embryonic stem cells (hereinafter also referred to as ES cells) into hepatocytes, hepatocytes induced by the method, and a bioartificial liver.
  • ES cells embryonic stem cells
  • liver is the largest parenchymal organ in the human body, and its functions are diverse, including the metabolism of carbohydrates, proteins, and fats, as well as pyrilvin metabolism, drug metabolism, and blood coagulation factor generation. Including liver functions in the hundreds, which plays a very important role in the body. Thus, even if it is temporary, severe liver disease is extremely dangerous for the patient's life.
  • liver has a vigorous regenerative ability, and even if it suffers liver injury due to fulminant liver failure, the patient recovers if hepatic function can be replaced for about a week.
  • liver transplantation is most effective for these serious liver diseases, not everyone can benefit from the serious shortage of donors.
  • a combination of continuous filtration dialysis and plasma exchange is a temporary means of replacing liver function. It is necessary to establish a law, and there is a growing need for the development of artificial livers for treatment. Therefore, what is expected is a bioartificial liver filled with cells in order to utilize the metabolic ability and protein synthesis ability of living cells.
  • a bioartificial liver can be said to be an artificial liver device that mimics an in vivo liver in which hepatocytes are incorporated into a carrier and fixed to form a reactor.
  • the patient's blood can be introduced into the apparatus, and the metabolic capacity of hepatocytes can be used to remove toxins in the blood and to supply physiologically active substances such as coagulation factors derived from liver cells.
  • healthy human hepatocytes are ideal, but the lack of donor liver is extremely difficult to obtain.
  • non-transplantable liver is used for hepatocyte isolation and clinically applied to hepatocyte transplantation and bioartificial liver.
  • non-transplantable livers are stipulated to be incinerated and cannot be used for bioartificial livers.
  • ES cells can be divided into 1) all kinds of cells constituting the living body, 2) have the ability to proliferate semi-permanently, and can be mass-cultured at low cost. 3) Since induction methods using cell growth factors can be applied without recombination of genes, there are advantages such as closer to natural body and availability of cells compared to genetically modified cells.
  • Methods for inducing differentiation of hepatocytes from stem cells include hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor (FGF), dexamethasone, and oncostatin M (which belongs to the family of interleukin 6). ), N-butyric acid, etc. is not possible to induce fully functional hepatocytes (Rambhatla L et al., Cell Transplant. Vol. 12, 1-11, 2003, Schwartz RE et al. J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002 and Special Publication 2003-530879).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • dexamethasone dexamethasone
  • oncostatin M which belongs to the family of interleukin 6
  • N-butyric acid, etc. is not possible to induce fully functional hepatocytes (Rambhatla L et al., Cell Transplant. Vol. 12, 1-11, 2003, Schwartz RE et al. J. Clin
  • An object of the present invention is to provide a hepatocyte that is sufficiently functional, can be supplied in large quantities, and is safe and its use, particularly a bioartificial liver using the hepatocyte.
  • ES cells can be efficiently used by using a deletion type hepatocyte growth factor (hereinafter also referred to as dHGF), which is a natural variant of HGF.
  • dHGF deletion type hepatocyte growth factor
  • the present invention has been completed by finding that it can be induced into functional hepatocytes.
  • the present invention uses the following method for inducing differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes, hepatocytes obtained by the method, a bioartificial liver using the hepatocytes, and the hepatocytes.
  • a method for inducing differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes comprising culturing embryonic stem cells in the presence of a deletion-type hepatocyte growth factor.
  • FIG. 1 is a phase contrast micrograph of mouse hepatocytes (Example 3) in which mouse ES cell force was also induced on a nonwoven fabric according to the method of the present invention.
  • Differentiated hepatocytes 1 have multiple nuclei 2 that are characteristic of hepatocytes.
  • FIG. 2 (a) is a scanning photomicrograph of embryoid body 3 immediately after seeding attached to non-woven fiber 4, (b) is a scanning microscope of differentiation-induced hepatocyte 1 attached to non-woven fiber 4. It is a photograph.
  • FIG. 3 is a diagram showing one embodiment of the production process, taking as an example one embodiment of the bioartificial liver reactor of the present invention.
  • (a) is a diagram in which hollow fiber membranes 7 are arranged on a non-woven fabric 6 provided with a backing 5.
  • the non-woven fabric 6 provided with the backing 5 is provided with slits 8.
  • (B) is a figure which shows the process of winding (a) in roll shape.
  • (C) is an enlarged cross-sectional view taken along the line XX of (b).
  • D) is a schematic diagram showing a neuroartificial liver reactor 11 in which a roll having a hollow fiber membrane 7 and a nonwoven fabric 6 force is incorporated in a cylindrical container 10 provided with a liquid leakage preventing member 9 at both ends.
  • FIG. 4 is a photograph showing the expression of a liver-specific gene and an endogenous standard, GAPDH gene, in mouse hepatocytes induced by the method of the present invention.
  • Lanes 1 to 6 show size markers, undifferentiated ES cells, feeder cells, differentiation-induced ES cells (Example 2), differentiation-induced ES cells (Example 3) and mouse liver, respectively. Cells are shown.
  • FIG. 5 is a graph showing the drug metabolic ability of mouse hepatocytes induced to differentiate by the method of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the urea-producing ability of mouse hepatocytes induced to differentiate by the method of the present invention.
  • FIG. 9 is a phase contrast micrograph of human hepatocytes (Example 5) induced to differentiate from human ES cells by the method of the present invention.
  • FIG. 10 (a) Scanning micrograph of embryoid body 23 immediately after seeding attached to non-woven fiber 4 (Example 6). (B) is a scanning photomicrograph of differentiation-induced hepatocytes 21 (Example 6) adhering to non-woven fibers 4.
  • FIG. 11 is a photograph showing the expression of an albumin gene, which is a liver cell-specific gene, and a beta-actin gene, which is an endogenous control, in human hepatocytes in which human ES cell force has also been induced by the method of the present invention.
  • Lanes 1 to 7 show size markers, undifferentiated human ES cells, human ES cells that have formed embryoid bodies, and human ES cells that have been induced to differentiate without the use of non-woven fabric after the formation of embryoid bodies.
  • Example 5 shows human ES cells (Example 6), human hepatocytes, and size markers that were induced to differentiate on a nonwoven fabric after formation of embryoid bodies.
  • FIG. 12 is a transmission electron micrograph of hepatocytes induced to differentiate from human ES cells on a nonwoven fabric by the method of the present invention (Example 6).
  • FIG. 13 is a graph showing the drug metabolic ability of mouse hepatocytes induced to differentiate by the method of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the urea production ability of human hepatocytes induced to differentiate by the method of the present invention.
  • FIG. 15 is a graph showing the albumin producing ability of human hepatocytes induced to differentiate by the method of the present invention.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of ES cells into hepatocytes by using dHGF, which is a natural variant of HGF that is less cytotoxic than HGF.
  • the method for inducing differentiation of hepatocytes from ES cells of the present invention includes (a) a step of forming embryoid bodies of ES cells, and (b) the resulting embryoid bodies in the presence of dHGF. And a method comprising a step of culturing at a.
  • mammals that are preferably derived from mammals include humans, primates such as force-cynomolgus monkeys, mice, and the like.
  • dHGF is a splice variant produced by deletion of 5 amino acids by splicing of natural HGF (see FEBS Letters 434 (1998), 165-170).
  • dHGF can be produced according to the description in Japanese Patent Publication No. 7-68272 and its divisional application, JP-A-7-188292. In these publications, dHGF is described as TCF-II.
  • ES cells can be produced by embryonic force, which is an early stage in which a fertilized egg continues to grow.
  • the fertilized egg which has become a sperm with the ovum, is divided into two, four, eight ... during the growth to the fetus, and is called a blastocyst on the 5th and 6th days It becomes a state.
  • the blastocyst is composed of a blastocoelic force that holds an inner cell mass that is a spherical mass of about 0.1 mm in diameter.
  • the inner cell mass eventually grows into endoderm, mesoderm, and ectoderm and forms all the cells of the body, and the trophectoderm forms their placenta and isolates the embryo from the outside world Form a bag.
  • ES cells can be produced by removing the cells and culturing these cells in an environment that can proliferate and do not differentiate. Therefore, ES cells can also produce embryos as described above.
  • Such ES cells have been used in mice in 1981 (Evans et al., 1981, Nature 292: 154- 6.) and Martin et al. (Martin GR. Et al, 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634- 8.) and can be purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • human ES cell research has been designated as a national bioresource project, and human ES cells established at the Center for Stem Cell Medicine, Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University It can be obtained under certain conditions such as obtaining confirmation (approval) by the Minister of Education, Culture, Sports, Science and Technology in accordance with the “Human ES Cell Distribution Regulations” (enforced on November 26, 2003).
  • human ES cell lines “KhES-l” established in August 2003
  • KhES-2 established in October 2003
  • KhES-3 in October 2003
  • the human ES cell lines KhES-1, KhES 2, and KhES 3 are surplus embryos of fertilized eggs prepared for assisted reproduction such as in vitro fertilization and microinsemination (which must be discarded without being transplanted). Fertilized egg). That is, the fertilized egg is cultured to the blastocyst stage, the inner cell mass is separated from the blastocyst, cultured on a feeder cell, and the proliferating unbroken cell is selected and repeated. It was established by enabling passage, and the establishment method itself is essentially the same as that of mice and monkeys. Unlike mouse ES cells, human ES cells form a flat, almost monolayer colony on a single feeder cell and are morphologically very similar to monkey ES cells.
  • Human ES cells express markers specific to undifferentiated ES cells and maintain a normal chromosomal structure (see Hirofumi Suemori, Clinical Pathology, 52: 3 (2004), pages 255-258). . Markers specific to undifferentiated ES cells expressed by the ES cells include alkaline phosphatase (ALP), SSEA-3 and 4, TRA-1-60 and 81, and NanogOct-3 / 4. Rex-1 expression has been confirmed by RT-PCR.
  • ALP alkaline phosphatase
  • SSEA-3 and 4 SSEA-3 and 4
  • TRA-1-60 and 81 TRA-1-60 and 81
  • NanogOct-3 / 4 NanogOct-3 / 4. Rex-1 expression has been confirmed by RT-PCR.
  • KhES-1 and KhES 2 are normal diploid and female
  • KhES-3 is normal diploid and male karyotype (Research Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University) (See “Human ES Cell Distribution – Human ES Cell Lines KhES-1, 1-2, 1-3” on the homepage of the Center for Stem Cell Medicine).
  • the ES cells are passaged, maintained, and grown under conditions that do not separate (hereinafter, this step may be referred to as a preparation step), and if necessary, Use a portion to induce differentiation into hepatocytes.
  • this step may be referred to as a preparation step
  • a vessel that is capable of growing ES cells and that is also coated with a feeder cell or a skier fold for its ability to grow.
  • feeder cells is mouse embryonic fibroblasts that have been irradiated with gamma rays.
  • skiafold examples include laminin, fibronectin, collagen (collagen IV, collagen I, etc.), enteractin, self-organizing peptide-noid mouth gel, Poly (pN-vinylbenzyl-D-lactonamide) ( PVLA) (polystyrene derivative with latatose in the side chain).
  • Matrigel Matrigel, Laminin 56%, Collagen IV31 o / 0 , Entactin 8%, Betaton Dickinson and Campa-1
  • Glow Factor Reduced Matrigel GFR MatrigeU Laminin 61%, Collagen IV30 o / 0 , Entactin 7% force, Betaton Dickinson and Campa-made, Pure Matrix (PuraMatrix, 16 amino acids (Ac- (RAD A) -CONH))
  • Peptide Hyde Mouth Gel which is an oligopeptide of m, manufactured by 3D Matrix Japan Co., Ltd., Poly (p-N-vinylbenzyl-D-lactonamide) (PVLA) (manufactured by Ceragitus), and the like.
  • VLA Poly (p-N-vinylbenzyl-D-lactonamide)
  • mouse-derived ES cells it is preferable to use a culture vessel coated with a feeder cell.
  • human-derived ES cells when used for the bioartificial liver which is an embodiment of the present invention, there is a possibility of contamination with cells derived from different organisms. It is preferable to use a culture container coated with skiafold without using a culture container coated with cells.
  • the culture state of human ES cells is good, it is more preferable to use the Matrigel, Gloss Factor Reduced Matrigel, PuraMatrix, or the like.
  • ES culture solution (R-ES-101, purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) : Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) medium mixture (1: 1 volume ratio) with 15% urine fetal serum (FBS), 1% non-essential amino acid, 1% nucleoside, 110 / z M 2-mercaptoethanol ( Supplemented with Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), supplemented with 1% penicillin and streptomycin, 1% glutamic acid, and 500UZml mouse leukemia inhibitory factor (LIF) (purchased from Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), (2) Primate ES cell culture medium (Reprose Corporation) (3) Conditioned medium for mouse embryonic fibroblasts (R & D system, etc.).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle
  • FBS urine fetal serum
  • FBS urine fetal serum
  • non-essential amino acid 1% nucleo
  • the culture temperature is preferably in the range of 36 to 37 ° C.
  • the pH is preferably in the range of 7.3 to 7.4.
  • leukemia inhibitory factor LIF
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • a culture method using skier fold without using feeder cells a method published by Geron (Merono Park, California, USA) (Protocols for the Maintenance of Human Embryonic Stem and ells in Feeder Free conditions)
  • the concentration of dHGF used in the culture step for inducing differentiation of ES cells into hepatocytes is preferably higher than IngZml and lower than lOOOngZml, more preferably 10 ng / ml to 500 ngZml. LOOngZml is most preferred.
  • concentration of dHGF is less than the above range, differentiation into hepatocytes tends to be not achieved, whereas when it exceeds the above range, mild cytotoxicity tends to be confirmed.
  • dHGF may be directly applied to ES cells to induce differentiation, but first, embryoid bodies (EBs) are formed from ES cells, and then dHGF is captured. It is preferable to induce differentiation.
  • the embryoid body was formed by seeding ES cells diluted to about 100,000 Zml in culture with a drop (about 30 1 drop) inside the lid of a Petri dish, A hanging drop method in which the embryoid body is formed by culturing for about 2 days in a state where it hangs on the inside of the container and then does not fall down, and then the embryoid body is washed with a culture solution and suspended in a Petri dish to mature.
  • a suspension culture method in which about 5 million ES cells are suspended in a 10 cm Petri dish in about 10 ml of culture for about 5 days to form embryoid bodies can be mentioned. From the viewpoint of simplicity, the embryoid body formation method by suspension culture is more preferable.
  • the culture is carried out for about 3 to 7 days in the embryoid body formation step, and then transferred to the next separation induction step.
  • the culture solution may be (1) ES differentiation induction medium (DMEM F12) [DMEM (Gibco BR L, In-vitro Gene Corporation) and nutrient mixture F—12 (ham) (Gibco BR L, manufactured by Invitrogen Corporation) at a volume ratio of 1: 1, 4.5 mg / ml glucose, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 25 mM HEPES (Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation), lOOmgZml penicillin, lOOmg / ml streptomycin (Sigma-Aldrich Corporation) with LIF not carotenable], (2) Primate ES cell culture medium (such as Librocell), (3) Mouse embryonic fibroblasts Conditioned medium (R & D system, etc.).
  • the culture temperature is preferably in the range of 36 to 37 ° C.
  • the pH is
  • planar culture and three-dimensional culture are used as the culture process for inducing categorization!
  • conditions closer to the in vivo environment can be created by three-dimensional culture of cells on a skifold (scaffold), and cell functions can be improved.
  • three-dimensional culture is preferable.
  • the skiafold used for 3D culture includes collagen such as laminin, fibronectin, collagen IV, collagen I, enteractin, peptide-hide mouth gel, Poly (p-N-vinylbenzyl-D-lactonamide) (PVLA ) And the like.
  • collagen such as laminin, fibronectin, collagen IV, collagen I, enteractin, peptide-hide mouth gel, Poly (p-N-vinylbenzyl-D-lactonamide) (PVLA ) And the like.
  • Examples of commercially available products include the above-mentioned Matrigel, Gloss Factor Reduced Matrigel, and PuraMatrix. Furthermore, the nonwoven fabric etc. which are mentioned later can be used.
  • the culture medium includes (1) ES differentiation induction medium (DMEM F12) [DMEM (Gibco BRL Corporation) and nutrient mixture F-12 (Ham) (Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation) are mixed at a ratio of 1: 1 volume ratio, 4.5 mg / ml glucose, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 25 mM HEPES (Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation), lOOmg / ml penicillin, lOOmgZml streptomycin (manufactured by Sigma-Aldrich Corporation) and LIF cannot be obtained.
  • DMEM F12 DMEM (Gibco BRL Corporation)
  • nutrient mixture F-12 (Ham) Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation
  • the culture temperature is preferably in the range of 36 to 37 ° C.
  • the pH is preferably in the range of 7.3 to 7.4.
  • the culture period is about 14-21 days.
  • one or more of various organic solvents, cyto force-in, hormones and the like can be used in combination with dHGF. Any organic solvents, cytosines, hormones, etc. can be used as long as they do not adversely affect the cells. preferable.
  • organic solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylacetamide (DMA), hexamethylene bisacetamide and other polyethylene bisacetamide, activin A, bFGF, darcocorticoid, epidermal growth factor (EGF) ), Insulin, TGF-a, TGF- ⁇ , FGF, heparin, dexamethasone, and HGF, IL-1, IL-6, IGF-I, IGF-II, and HBGF-l.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMA dimethylacetamide
  • hexamethylene bisacetamide and other polyethylene bisacetamide activin A
  • EGF epidermal growth factor
  • Insulin TGF-a
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • FGF heparin
  • dexamethasone heparin
  • HGF IL-1, IL-6, IGF-I, IGF-II, and HBGF-l.
  • Hepatocytes differentiated from ES cells by the method of the present invention can be confirmed by observation of morphological characteristics and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • a morphological confirmation method there are cells having a plurality of nuclei observed with a phase-contrast microscope and presence of abundant granules in the cytoplasm observed with an electron microscope, especially glycogen granules! /, In addition, confirmation of morphological characteristics specific to hepatocytes can be mentioned.
  • the expression of the induced hepatocyte expression can be evaluated from the expression of the gene by RT-PCR. If the albumin gene is expressed and the undifferentiated gene afetoprotein is expressed and confirmed by RT-PCR, it can be said that differentiation has been induced.
  • epidermal cell markers CK18 cytokeratin 18
  • G6P glycose 6 phosphorylation enzyme
  • TAT tyrosine amino acid transferase
  • HNF3b hepatocyte nuclear factor 3
  • beta beta gene expression is observed.
  • another embodiment of the present invention is a neuroartificial liver containing hepatocytes induced to differentiate from ES cells and a method for producing the same.
  • the degree of cell differentiation when filling the reactor is important.
  • ES cells form embryoid bodies, their adhesion to skifolds such as nonwoven fabrics is enhanced.
  • cells attached to a scaffold such as a non-woven fabric exhibit three-dimensional spheroid formation.
  • three-dimensional culture of cells on a skiffold can create conditions closer to the in vivo environment and improve cell function. Culturing is effective for improving the function. Therefore, after embryoid body formation, ES cells are filled into the reactor, and three-dimensional differentiation induction is performed with dHGF. Will be greatly enhanced.
  • the ES cell mosquito also promotes the formation of embryoid bodies, is filled with cells in the reactor, and is separated into hepatocytes by the induction method of the present invention.
  • Examples of the artificial liver include a hybrid type artificial liver combining a hollow fiber type reactor (device) and a separated 'cultured cell.
  • neoartificial livers There are three types of neoartificial livers: those that are attached outside the body and connected to blood vessels, those that are placed in the body and connected to blood vessels, and those that are placed in the abdominal cavity without being connected to blood vessels.
  • the hepatocytes of the present invention can be used in any form of neuroartificial liver, but ES cells lose their ability to grow when induced to differentiate, but ES cells that have been poorly differentiated remain. In this case, since the cells may be transplanted in vivo, the deformed species may develop, and it is preferable that the point of avoiding the risk associated with cell transfer is also an extracorporeal type.
  • the bioreactor is Dimethrieux from Cedars-Sinai Medical Center (Los Angeles, California, USA) with the support of Circe Biomedical Inc. (Lexington, Massachusetts, USA). Hepatosis for bioartificial liver treatment using porcine hepatocytes centered on (Demetriou) et al. (HepatAssist) (Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 20 01; 8: 1-15.) And German Gerlach et al.'S MELS (Modular Extracorporeal Various types are known, such as Liver System)).
  • reactors do not have a scaffold for the attachment of the force liver cells that can be used in the present invention, so the cells are simply suspended in the space inside the hollow fiber or the space outside the hollow fiber. There is a tendency to become a state. In the floating state, hepatocytes tend not to fully develop the differentiation function, and further collide with surrounding cells and are susceptible to stress stimulation.
  • a reactor composed of a hollow fiber and a skier fold such as a nonwoven fabric is preferable so that a scaffold can be provided for hepatocytes.
  • any membrane can be used as long as cells do not adhere to the membrane surface and hinder the substance exchange. Specifically, it is conventionally used for medical purposes.
  • Commercially available products such as polysulfone membranes and ethylene vinyl acetate random copolymer saponified membranes (for example, trade names: EVAL, manufactured by Kuraray Medical Co., Ltd.) are preferred.
  • the pore sizes of commercially available hollow fiber membranes include dialysis membranes ( ⁇ 5 nm), plasma component separation membranes (20-30 nm), plasma separation membranes (30-200 nm), etc. From the viewpoint of the permeability of the substance, a plasma separation membrane (30 to 200 nm) is preferable.
  • the immunocompetent cells in the blood flowing through the hollow fiber and the immunoglobulin do not come into direct contact with the cells filled on the skifold such as the non-woven fabric outside the hollow fiber.
  • ⁇ LOOnm is most preferred.
  • non-woven fabric those that have been modified to allow cells to adhere are preferable.
  • non-woven fiber examples include polytetrafluoroethylene (PTFE).
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PAU polyamino acid urethane
  • FIG. 3 The process up to the housing is shown in Fig. 3 by taking as an example one embodiment of the bioartificial liver reactor of the present invention.
  • the hollow fiber membrane 7 is placed on the non-woven fabric 6 provided with the backing 5 (FIG. 3 (a)).
  • the non-woven fabric 6 provided with the backing 5 is provided with slits 8. This is rolled up (Fig. 3 (b)).
  • Its X-X cross section is shown in Fig. 3 (c).
  • the reactor 11 is provided with a cell inlet 12 and an outlet 13 through which a cell sample can be collected, and the slit 8 is disposed so as to communicate with the cell inlet 12.
  • bioartificial liver treatment is performed safely and scientifically: 1) Real-time monitoring of inflow and outflow pressures of artificial liver reactors, 2) Alarm activation when bubbles are generated 3) It is preferable to implement the system with an integrated function that can warm the reactor (37 degrees).
  • hepatocytes particularly human hepatocytes, induced to differentiate from ES cells by the method of the present invention are useful as cells for drug metabolism tests.
  • it is useful as a test cell in new drug development, safety testing, and toxicity testing.
  • Hepatocytes are the center of various drug metabolisms, and in order to test the toxicity and safety of drugs, it is necessary to administer drugs to hepatocytes and investigate how they are metabolized. . And since there is a big difference between humans and laboratory animals in terms of substance metabolism, the final test using human hepatocytes is indispensable. In this respect, the present invention that can provide a large amount of human liver cells of uniform quality is useful. As a device used for such a metabolic test, a device having the same structure as the bioartificial liver can be used.
  • hepatocytes particularly human hepatocytes, induced to differentiate from ES cells by the method of the present invention can be used for the production of physiologically active substances.
  • physiologically active substances include albumin and various blood coagulation factors.
  • a device for producing such a physiologically active substance a device having the same structure as the bioartificial liver can be used.
  • mice-derived ES cells purchased from Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.
  • feeder cells that have been introduced with a neomycin resistance gene
  • mouse-derived embryonic fibroblasts purchased from Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.
  • Incubation flask T-75 (Falcon, Betaton Decktonson and Campa) coated with 0.1% gelatin water (catalog number: R-ES-006B, purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) -Cultured using one (Becton, Dickins on and Company).
  • ES culture solution (R—ES—10 1: purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.): Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) culture solution mixture (1: 1 volume ratio) 15% Serum (FBS), 1% non-essential amino acid, 1% nucleoside, 110 M 2-mercaptoethanol (purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), 1% penicillin and streptomycin, 1% gnoretamic acid, and from 500 U / ml mouse A supplement of leukemia inhibitory factor (LIF) (purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was used.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the culture medium was changed every day, and ES cells were passaged every 3 days.
  • a two-step treatment was performed, ie, a 0.25% concentration of trypsin-EDTA (Gibco BRL, Invitrogen). Attach Polesion (manufactured by Invitrogen Corporation), and after 45 seconds, remove trypsin-ED TA solution to remove feeder cells together (ES cells still remain on the culture plate at this stage) Then, after 2 minutes, the ES culture solution was peeled off to recover the ES cells remaining on the culture plate.
  • DMEM F12 10 ml ES differentiation induction medium
  • 10-7 molar concentration dexamethasone manufactured by s
  • DMEM F12 The composition of DMEM F12 is as follows: DMEM (Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation) and nutrient mixture F-12 (Ham) (Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation) at a ratio of 4.5 mgZml Glucose, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 25 mM HEPES (Gibco BRL, manufactured by Invitrogen Corporation), 100 mgZml penicillin, LIG is not added to the product (manufactured by Sigma Leo Red Co., Ltd.).
  • the culture medium was changed every 3 days. After 14 days from the start of culture, we investigated the effect of inducing hepatic cell division. As a result, we have so-called hepatocyte morphological features such as nuclei with several nucleoli, and the expression of albumin. The differentiation into hepatocytes was confirmed.
  • mouse hepatocytes were induced in the same manner as in Example 1 except that the embryoid bodies obtained instead of ES cells were used.
  • Example 2 An embryoid body formed in the same manner as in Example 2 was spread with a polytetrafluoroethylene (PTA) -treated PTFE (polytetrafluoroethylene) nonwoven fabric (manufactured by Kuraray Medical Co., Ltd.) having a cell adhesion of 1 cm ⁇ 1 cm. Seed in a 12-well culture plate (official name: Multiwell 12—well Falc on, manufactured by Falcon, Betaton Decktonson and Camper) for 3 X 10 6 cells Zcm 2 , same as Example 1.
  • PTA polytetrafluoroethylene
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • ES min-induction medium DMEM F12, lOOngZml concentration mouse-derived dHGF (provided by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo), 1 OOngZml concentration bFGF, 1% concentration DMSO (Sigma-Aldrich Corporation) ), 10- 7 molar concentration of dexamethasone (sigma - added Aldrich Corporation) and cultured for 14 days, to induce murine hepatocytes. The culture medium was changed every 3 days.
  • Bioartificial liver (BAL) of whole blood reflux system consisting of hollow fiber and non-woven fabric (see Fig. 3)
  • 550 pieces of 10cm hollow fiber membranes were placed regularly on a non-woven fabric (10 X 10cm) lined with rayon (see Fig. 3 (a)), and rolled up into a roll (see Fig. 3 (b)) ).
  • a schematic diagram of the cross section is shown in Fig. 3 (c).
  • the roll made of the nonwoven fabric and the hollow fiber membrane was incorporated into a cylindrical container provided with a liquid leakage preventing member at both ends (see FIG. 3 (d)).
  • PTFE non-woven fabric manufactured by Kuraray Medical Co., Ltd.
  • PAU polyamino acid urethane
  • each reactor was operated by attaching it between the cervical arteriovenous veins of healthy pigs. I was able to. In addition, there was no decrease in blood cell components such as red blood cells and platelets.
  • the artificial liver reactor BAL-2 obtained in Production Example 2 was filled with the embryoid body obtained in Example 2 in the space outside the hollow fiber, and lOmlES cell differentiation-inducing medium: lOOngZml concentration in DMEM F12. and derived dHGF (Daiichi (from Tokyo)), the lOOngZml concentration, DMSO from mice bFGF, 1% concentration (sigma - Aldrich Corporation), 10-7 molar concentration of dexamethasone (sigma-Aldrich Corporation Reshiyon made ) was added to the cells to induce hematopoietic culture.
  • the culture medium was changed every 3 days, and the differentiation-inducing effect was examined after 14 days of culture.
  • RT In the hepatocytes induced by PCR (Examples 2 and 3), important genes involved in liver metabolism, ie, CK18 (cytokeratin 18), G6P (glucose 6 kinase), TAT (tyrosine amino acid) The expression of transferase, albumin, AFP (alphafetoprotein) and HNF3b (hepatocyte nuclear factor 3 beta) genes were examined. GAPDH gene expression was also examined as an intrinsic factor control.
  • RNA Trizol manufactured by Invitrogen Corporation
  • 5 'primer 5' —CGATACAAGGCACAGATGGA (SEQ ID NO: 1)
  • 5 'Primer 5' —ACCTTCAATCCCATCCGA (SEQ ID NO: 5)
  • 5 'primer 5' — GCTAGGCACACAGTGCTTG (SEQ ID NO: 7)
  • 5 'primer 5' — CAGCCGAGCCACATC (SEQ ID NO: 13)
  • Lanes 1 to 6 show size markers, undifferentiated ES cells, feeder cells, ES cells induced to differentiate (Example 2), ES cells induced to differentiate on the nonwoven fabric (Example 3), and mouse hepatocytes, respectively. Indicates.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 2 to 4 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction.
  • the culture solution was loaded with 1.4 mmol of tetrasalt ammonium, and after 4 hours, 101 1 of the culture solution was collected and the ammonia concentration was measured.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 2 to 4 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction. Jazebam was loaded into the culture solution to a final concentration of 1 ⁇ gZml, and after 4 hours, 1000 1 of the medium was collected and the diazebam concentration was measured.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 2 to 4 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction.
  • Lidocaine was loaded into the culture solution to a final concentration of 1 mgZml, and after 4 hours, 1000 1 medium was collected and the lidocaine concentration was measured.
  • Fig. 5 shows the respective metabolic rates of (A) to (C).
  • the metabolic rate is expressed as a value obtained by subtracting each drug concentration after 4 hours from the concentration of the drug at the time of drug loading and dividing by the concentration of the drug at the time of drug loading.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 2 to 4 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction. Then, after 24 hours of culture, the culture solution was collected and mouse albumin ELIS
  • the amount of albumin produced was measured using an A kit (product code: E90-134, Funakoshi Co., Ltd.).
  • the production amounts of albumin are 500 ng and 8 ml per ml in Examples 2 to 4, respectively. 50 ng and 920 ng ( Figure 7). It can be seen that the ability to produce albumin is enhanced by culturing on a non-woven fabric and further by three-dimensional culturing in a reactor.
  • the bioartificial liver reactor BAL-1 produced in Production Example 1 was filled with about 1 billion pig liver cells (survival rate> 90%).
  • Freshly isolated porcine hepatocytes were isolated from the surgically excised outer liver by a four-step reflux method using dispase and collagenase (Masayama Maruyama, Naoya Kobayashi, Toshinori Tsutsukawa, Organ Biology, Vol. 9). , No.3. 295-301, 2002) 0
  • KhES 1 distributed from the Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University in accordance with the “Regenerative Medicine Research Institute Human ES Cell Distribution Regulations” was used.
  • the cell culture is published on the Neron website (Protocols for the Maintenance of Human Embryonic Stem Cell in Feeder Free Conditions) (http://www.geron.com). It was done according to). Specifically, it was cultured as follows.
  • the culture plate used was a 6-well plate (Falcon, sold by Betatone Dickinson and Campa) that was coated with Matrigel (Betaton Dickinson and Campa-1).
  • a conditioned medium for mouse embryonic fibroblasts (force tag number: AR005, manufactured by R & D Systems) was used.
  • the culture solution was changed every day, and at the time of replacement, mouse basic fibroblast growth factor (bFGF) was added to the culture solution so as to be lOOngZml.
  • ES cells were passaged every 7 days. Specifically, when the proportion of ES cells in the culture plate reached 80 to 90%, collagenase IV solution (200 UZml) (Gibco RBLZ Invitrogen) was used in a two-step treatment.
  • the 5 ⁇ 10 6 KhES 1 cells obtained in Production Example 3 were diluted with 2 ml of ES medium (same as that used in Production Example 3), and previously diluted with ES medium (used in Production Example 3). The same as the above) The seeds were seeded in the center of a culture dish for embryoid body formation (COSTAR, manufactured by Corning Incorporated) holding lml.
  • COSTAR embryoid body formation
  • lOOngZml human-derived dHGF (provided by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.), lOOng Cultured in human bFGF of ZML, 1% of DMSO and 10-7 molar concentrations of dexamethasone ES medium containing (Sigma Aldrich Corporation) (same as used in Production Example 3)
  • the differentiation into hepatocytes Induction was carried out for 14 days.
  • the culture medium was changed every 2 days.
  • Fig. 8 shows a phase contrast micrograph of human ES cells that formed embryoid bodies
  • Fig. 9 shows a phase contrast micrograph of hepatocytes induced to differentiate from human ES cells.
  • Differentiated hepatocytes 21 have multiple nuclei 22 that are characteristic of hepatocytes.
  • the KhES-1 cells obtained in Production Example 3 are covered with a polyamino acid urethane (PAU) -processed PTFE nonwoven fabric (manufactured by Kuraray Medical Co., Ltd.) with a cell adhesion of 1 cm x 1 cm, and an ES culture solution (manufactured)
  • PAU polyamino acid urethane
  • ES culture solution manufactured by Kuraray Medical Co., Ltd.
  • a 12-well culture plate multiwell 12 well falcon, manufactured by Falcon
  • the ES cells were seeded on a culture plate and then cultured for 5 days to form embryoid bodies.
  • a scanning electron micrograph of the embryoid body formed on the nonwoven fabric is shown in Fig. 10 (a).
  • FIG. 10 (a) an embryoid body 23 attached to the non-woven fiber 4 is shown.
  • the RT-PCR method was used to examine the expression of the albumin gene, which is involved in liver metabolism and is a hepatocyte-specific gene.
  • the beta-actin gene expression was also examined as an endogenous control.
  • the RT-PCR method was performed in the same manner as in Test Example 1 for mice. That is, the cells were collected after treatment with 0.25% trypsin-EDTA, and RNA was extracted with RNA Trizol according to the instruction manual of the product. 1 ⁇ g of total RNA at 22 ° C for 10 minutes, then at 42 ° C for 20 minutes, reverse RNA A reverse transcription reaction was performed using a transcriptase.
  • AmpliTag Gold Kid manufactured by Perkin 'Elmaichi Z-Citas was used for the protocol. Therefore, it was used for PCR amplification.
  • the primers and PCR conditions for each gene are described below.
  • 5 'Primer 5Z — TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA (SEQ ID NO: 17)
  • Lanes 1 to 7 show size markers, undifferentiated human ES cells, human ES cells that have formed embryoid bodies, and human ES cells that have been induced to differentiate without using a non-woven fabric after the formation of embryoid bodies
  • Example 5 shows human ES cells (Example 6), human hepatocytes, and size markers induced to differentiate on a non-woven fabric after formation of embryoid bodies.
  • the expression of albumin, a hepatocyte-specific marker gene was confirmed, but hepatocytes specifically induced by three-dimensional culture using a nonwoven fabric.
  • Example 6 it can be confirmed that the expression is enhanced. This result strongly supports that differentiation induction of hepatocytes can be induced more efficiently by using a nonwoven fabric.
  • glycogen granules characteristic of mature hepatocytes were observed by transmission electron microscopy in the cells of human ES cells induced using non-woven fabric.
  • symbols 24, 25 and 26 indicate the endoplasmic reticulum, mitochondria and glycogen granules, respectively.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 5 to 6 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction.
  • the culture solution was loaded with 1.4 mmol of tetrasalt ammonium, and after 4 hours, 101 1 of the culture solution was collected and the ammonia concentration was measured.
  • the metabolic rates of ammonia in Examples 5 to 6 were 7.1% and 7.8%, respectively.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 5 to 6 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction.
  • Lidocaine was loaded into the culture solution to a final concentration of 1 mgZml, and after 4 hours, 1000 1 medium was collected and the lidocaine concentration was measured.
  • the metabolic rate of lidoin was 13.4% and 23.2%, respectively.
  • Fig. 13 shows the respective metabolic rates of (A) and (B).
  • the metabolic rate is expressed as a value obtained by subtracting each drug concentration after 4 hours from the concentration of the drug at the time of drug loading and dividing by the concentration of the drug at the time of drug loading.
  • drug metabolizing ability is observed, but it is obvious that drug metabolizing ability is enhanced by three-dimensional culture on a nonwoven fabric.
  • the culture medium of hepatocytes obtained in Examples 5 to 6 was replaced with a new one 14 days after the initiation of differentiation induction. Thereafter, the culture solution after 24 hours of culture was collected, and albumin production was measured using albumin ELISA kit ALB UWELL II (Exocell Inc, Philadelphia, Pennsylvania, USA). The production amounts of albumin were 289 ng and 349 ng per ml in Examples 5 to 6 (FIG. 15). It can be seen that hepatocytes induced by three-dimensional culture using a non-woven fabric have enhanced albumin producing ability.
  • hepatocytes that are functional enough to replace healthy human liver cells, can be supplied in large quantities, and can be induced safely.
  • the bioman of the present invention When the engineered liver is an extracorporeal type, it can avoid the dangers associated with cell transfer and achieve safer treatment.
  • the present invention provides a method for testing a drug and a method for producing a physiologically active substance using human hepatocytes that can be supplied in large quantities. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 1 Primer for polymerase chain reaction to detect mouse CK18 gene
  • SEQ ID NO: 2 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse CK18 gene
  • SEQ ID NO: 3 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse G6P gene
  • SEQ ID NO: 4 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse G6P gene
  • SEQ ID NO: 5 5 'primer for polymerase chain reaction to detect mouse TAT gene
  • SEQ ID NO: 6 3 ′ primer for polymerase chain reaction to detect mouse TAT gene
  • SEQ ID NO: 7 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse albumin gene
  • SEQ ID NO: 8 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse albumin gene
  • SEQ ID NO: 9 5 'primer for polymerase chain reaction to detect mouse AFP gene
  • SEQ ID NO: 10 3 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting mouse AFP gene
  • SEQ ID NO: 11 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse HNF3b gene
  • SEQ ID NO: 12 Polymerase chain reaction primer for detecting mouse HNF3b gene
  • SEQ ID NO: 13 Primer for polymerase chain reaction to detect mouse GAPDH gene
  • SEQ ID NO: 14 Primer for polymerase chain reaction to detect mouse GAPDH gene
  • SEQ ID NO: 15 Polymerase chain reaction primer for detecting human albumin gene
  • SEQ ID NO: 16 Polymerase chain reaction primer for detecting human albumin gene
  • SEQ ID NO: 17 Polymerase chain reaction primer for detecting human beta-actin
  • SEQ ID NO: 18 Polymerase chain reaction primer for detecting human beta-actin

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Abstract

　胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法に関し、充分に機能的であり、大量供給が可能で安全な肝細胞を得るために、胚性幹細胞をｄＨＧＦの存在下で培養することを特徴する、胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法を提供する。さらに、胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法であって、（ａ）胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、および（ｂ）得られた胚様体を、欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養する工程 を含む方法を提供する。

Description

明 細 書
胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法および該方法により誘導される 肝細胞
技術分野
[0001] 本発明は、胚性幹細胞 (以下、 ES細胞ともいう）の肝細胞への分ィヒ誘導方法およ び該方法により誘導される肝細胞、ならびにバイオ人工肝臓に関する。
背景技術
[0002] 肝臓は、人体の中で最大の実質臓器であり、その機能は糖質、蛋白質、脂肪の代 謝を始めピリルビン代謝、薬物代謝、血液凝固因子の生成など多岐にわたり、未知 な機能を含めると肝臓の機能は数百にものぼり生体において非常に重要な役割を果 たしている。よって、たとえそれが一時的なものであれ、重篤な肝臓疾患は患者の生 命にとって極めて危険である。
[0003] 一方で、肝臓は旺盛な再生能を有し、劇症肝不全で肝傷害を受けたとしても、一週 間ほど肝機能を代替することができれば患者は回復する。こうした重篤な肝疾患に対 して、肝臓移植が最も効果的であることは事実であるが、深刻なドナー不足を鑑みる と万人がその恩恵を受けることはできない。目下、我が国では、一時的に肝機能を代 替する手段として、持続濾過透析と血漿交換を組み合わせることで、ある程度の救命 率は得られているものの、充分とはいい難ぐ更なる有効な治療法の確立が必要であ り、治療用人工肝臓の開発に対するニーズが高まっている。そこで、期待されている のが、生きた細胞の代謝能力やタンパク質合成能を活用するために細胞を充填した バイオ人工肝臓である。
[0004] バイオ人工肝臓は、肝細胞を担体に組み込んで固定しリアクター化した生体内の 肝臓を模倣した人工肝臓装置と言える。患者の血液を当該装置内に導き、肝細胞の 代謝能を利用して血液中のトキシンの除去と肝臓細胞に由来する凝固因子などの生 理活性物質の供給とを行なうことができる。細胞源としては、健常ヒト肝細胞が理想で あるがドナー肝の不足力もその入手はきわめて困難である。欧米では、移植不適合 肝臓は肝細胞分離へと活用され、肝細胞移植やバイオ人工肝臓へと臨床応用され ているが、本邦では移植不適合肝臓は焼却と規定されており、そのバイオ人工肝臓 への活用は不可能である。
[0005] こうした問題の対策として、ヒト末梢血幹細胞、骨髄幹細胞そして肝前駆細胞などか らヒト肝細胞への誘導が研究されている力 これらの細胞は増殖能に乏しぐバイオ 人工肝臓への応用に値する細胞数 (十億個以上）を確保するのは現実的ではな 、。 一方で、欧米、中国では、ブタ肝細胞を使用したバイオ人工肝臓治験がヒトで行なわ れているが、ブタ内因性レトロウイルス感染、 E型肝炎などの人畜共通感染症が問題 視されており今後の進展が厳 ヽ現状にある。
[0006] また、最終分ィ匕したヒト細胞を標的に遺伝子組み換えによる不死化細胞株の榭立 が検討されている力 これらの遺伝子組み換えを用いた方法では、外来遺伝子を導 入するため、ヒトへの応用に際しては、遺伝子導入細胞の染色体の変化およびそれ に伴う細胞の腫瘍化などといった安全面でのハードルが高い（Craig D. Woodworth e t al., Molecular and Cellular Biology Oct. 4492—4501, 1988)。さらに、レトロウイルス ベクターの使用に関しては、フランスの X染色体連鎖先天性重複性重症免疫不全症 (X-Linked SCID)患児に対する、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子治療での γ δ—Τ細胞性白血病が発症するという事故が 2002年 9月に報告されて以来、慎重な 姿勢が取られている（S. Hacein-Bey-Abina et al., Science, Vol. 302(17), 415-419, 2 003)。
[0007] 以上より、臨床応用の実現可能なバイオ人工肝臓を開発するに当たっては、より自 然な形に近 、細胞源の検討が必要とされて 、る。
[0008] 一方、 ES細胞には、 1)生体を構成するあらゆる種類の細胞に分ィ匕でき、 2)半永久 的に増殖する能力があることから低コストで大量培養が可能であり、 3)遺伝子の組換 えを行なわず細胞増殖因子を用いた誘導法が適用可能であるため、遺伝子改変細 胞に比べより自然体に近!、細胞を入手できるなどと!、つた利点がある。
[0009] 幹細胞から肝細胞を分化誘導する方法としては、肝細胞増殖因子 (hepatocyte gro wth factor : HGF)、線維芽細胞増殖因子（FGF)、デキサメタゾン、オンコスタチン M (インターロイキン 6のファミリーに属する）、 n—酪酸などが使用されている力 充分に 機能的な肝細胞への誘導は可能ではない（Rambhatla L et al., Cell Transplant. Vol. 12, 1-11, 2003、 Schwartz RE et al. J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002および特 表 2003— 530879号公報)。また、肝障害を惹起したマウスの肝臓に ES細胞を移 植することで ES細胞の肝細胞への分化誘導を促した例も報告されて ヽるが (Yamam oto H et al. Hepatology 2003 37:983, 2003)、操作が繁雑であり、分化した肝細胞を 障害マウスの肝臓力も回収しなければならないなどの問題点がある。
発明の開示
[0010] 本発明の目的は、充分に機能的であり、大量供給が可能で安全な肝細胞およびそ の用途、特に肝細胞を用いたバイオ人工肝臓を提供することである。
[0011] 前記問題点に鑑み鋭意検討した結果、 HGFの天然の変異体 (natural variant)で ある欠失型肝細胞増殖因子（以下、 dHGFともいう）を用いることにより、 ES細胞を効 率的に機能的な肝細胞へと分ィ匕誘導できることを見出し、本発明を完成した。
[0012] すなわち、本発明は、下記に示す胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法、該方 法により得られる肝細胞、該肝細胞を使用するバイオ人工肝臓、該肝細胞を使用す る薬物検査方法、該肝細胞を使用する生理活性物質の産生方法を提供する。
(1) 胚性幹細胞を欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養することを特徴とする、 胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法。
(2) 胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法であって、
(a)胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、および
(b)得られた胚様体を、欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養する工程 を含む方法。
(3) 胚性肝細胞が哺乳類由来のものである前記第（1)項または第（2)項記載の方 法。
(4) 哺乳類がヒトである前記第 (3)項記載の方法。
(5) 哺乳類がマウスである前記第 (3)項記載の方法。
(6) 胚様体が浮遊培養により形成される前記第（2)項〜第（5)項の 、ずれかに記 載の方法。
(7) 培養が三次元培養で行なわれる前記第（1)項〜第 (5)項の 、ずれかに記載の 方法。 (8) 前記第（1)項〜第（7)項の 、ずれかに記載の方法により誘導される肝細胞。
(9) 前記第 (8)項記載の肝細胞を含有するバイオ人工肝臓。
(10) バイオ人工肝臓の製造方法であって、
(a)胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、
(b)得られた胚様体をバイオ人工肝臓リアクター内に充填する工程、および
(c)バイオ人工肝臓リアクター内で、前記胚様体を欠失型肝細胞増殖因子の存在下 で培養する工程
を含む方法。
(11) 前記第 (8)項記載の肝細胞を使用して薬物を検査する方法。
(12) 前記第 (8)項記載の肝細胞を使用して生理活性物質を産生する方法。
図面の簡単な説明
[図 1]本発明の方法にしたがって、不織布上でマウス ES細胞力も分ィ匕誘導されたマ ウス肝細胞 (実施例 3)の位相差顕微鏡写真である。分化誘導された肝細胞 1には肝 細胞の特徴である複数の核 2が観察される。
[図 2] (a)は不織布の繊維 4に付着した播種直後の胚様体 3の走査顕微鏡写真であり 、 (b)は不織布の繊維 4に付着した分化誘導された肝細胞 1の走査顕微鏡写真であ る。
[図 3]本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、作製過程の一実施 態様を示す図である。 (a)は裏打ち 5が施された不織布 6の上に中空糸膜 7を並べた 図である。ここで、裏打ち 5が施された不織布 6にはスリット 8が設けられている。（b)は 、（a)をロール状に巻く過程を示す図である。（c)は、（b)の X— X線断面拡大図であ る。（d)は、両端に液漏れ防止部材 9を設けた筒状容器 10に中空糸膜 7と不織布 6 力もなるロールを組み込んだノィォ人工肝臓リアクター 11を表わす概略図である。
[図 4]本発明の方法によりマウス ES細胞力 分ィ匕誘導されたマウス肝細胞における 肝特異的遺伝子および内因性標準である GAPDH遺伝子の発現を示す写真である 。レーン 1〜6は、それぞれサイズマーカー、未分化 ES細胞、フィーダ一細胞、分化 誘導された ES細胞 (実施例 2)、不織布上で分化誘導された ES細胞 (実施例 3)およ びマウス肝細胞を示す。 [図 5]本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞の薬物代謝能を示すグラフで ある。
[図 6]本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞の尿素産生能を示すグラフで ある。
圆 7]本発明の方法により分ィ匕誘導されたマウス肝細胞のアルブミン産生能を示すグ ラフである。
圆 8]本発明の方法によりヒト ES細胞カゝら形成された胚様体 (実施例 5)を示す位相 差顕微鏡写真である。
[図 9]本発明の方法によりヒト ES細胞から分化誘導されたヒト肝細胞 (実施例 5)の位 相差顕微鏡写真である。
[図 10] (a)不織布の繊維 4に付着した播種直後の胚様体 23の走査顕微鏡写真であ る（実施例 6)。（b)は不織布の繊維 4に付着した分化誘導された肝細胞 21 (実施例 6 )の走査顕微鏡写真である。
[図 11]本発明の方法により、ヒト ES細胞力も分ィ匕誘導されたヒト肝細胞における肝細 胞特異的遺伝子であるアルブミン遺伝子および内因性コントロールであるベータァク チン遺伝子の発現を示す写真である。レーン 1〜7は、それぞれサイズマーカー、未 分化ヒト ES細胞、胚様体を形成したヒト ES細胞、胚様体を形成させた後に不織布上 を使用せずに分化誘導されたヒト ES細胞 (実施例 5)、胚様体を形成させた後に不織 布上で分化誘導されたヒト ES細胞（実施例 6)、ヒト肝細胞、そしてサイズマーカーを 示す。
[図 12]本発明の方法により、不織布上でヒト ES細胞から分化誘導された肝細胞の透 過電子顕微鏡写真である（実施例 6)。
[図 13]本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞の薬物代謝能を示すグラフ である。
[図 14]本発明の方法により分化誘導されたヒト肝細胞の尿素産生能を示すグラフで ある。
[図 15]本発明の方法により分化誘導されたヒト肝細胞のアルブミン産生能を示すダラ フである。 発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明は、 HGFと比較してより細胞障害性の少ない HGFの天然の変異体である d HGFを用いることにより、 ES細胞を肝細胞へ分化誘導する方法に関する。
[0015] 本発明の ES細胞から肝細胞を分化誘導する方法には、（a) ES細胞の胚様体を形 成する工程、および (b)得られた胚様体を、 dHGFの存在下で培養する工程を含む 方法が含まれる。
[0016] ES細胞としては、哺乳類由来のものが好ましぐ哺乳類としては、ヒト、力-クイザル などの霊長類、マウスなどが挙げられる。
[0017] dHGFは、天然の HGFのスプライシングにより 5個のアミノ酸が欠失して生じたスプ ライス変異体である（FEBS Letters 434 (1998), 165- 170参照）。 dHGFは、特公平 7 — 68272号公報およびその分割出願である特開平 7— 188292号公報の記載にし たがって製造することができる。なお、これら公報においては、 dHGFは、 TCF— IIと して記載されている。
[0018] ES細胞は、受精卵が成長を続ける初期の段階である胚力 製造することができる。
卵子と精子力^つになった受精卵は、胎児へと成長していく途中で 2つ、 4つ、 8つ · · 'と分裂を繰り返し、 5、 6日目には胚盤胞と呼ばれる状態になる。胚盤胞は直径 0. 1 mmほどの球状のかたまりである内部細胞塊を抱く胞胚腔力 構成される。内側の細 胞塊は、いずれ内胚葉、中胚葉、外胚葉へと成長し、体のあらゆる細胞を形作ってい く部分で、栄養外胚葉はそれらの胎盤を形成し、また胚を外界から隔離する袋を形 成する。この内部細胞塊をほぐしたのち、細胞を取り出し、これらの細胞を増殖可能 でかつ分化しな 、環境で培養することにより ES細胞を製造することができる。したが つて、 ES細胞は、前記のとおり胚カも製造することができる。
[0019] このような ES細胞は、マウスでは 1981年にエバンスら（Evans et al.， 1981, Nature 292: 154- 6.)や、マーチンら（Martin GR. et al, 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634- 8.)によって榭立され、商品としては大日本住友製薬株式会社 (大阪、日本)などから 購入可能である。
[0020] また、ヒト ES細胞は、 1998年にトムソンら（Thomson et al., Science, 1998, 282:114 5-7.)によって榭立され、 WiCell研究施設（WiCell Research Institute,ウェブサイト： http : //www. wicell. org/,マジソン、ウィスコンシン州、米国）から入手可能で ある。
[0021] 我国においては、ヒト ES細胞の研究はナショナルバイオリソースプロジェクトに指定 されており、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターで榭立され たヒト ES細胞が、「再生医科学研究所ヒト ES細胞分配規定」（平成 15年 11月 26日 施行）にしたがって、文部科学大臣の確認 (承認)を得るなどの一定の条件下に入手 が可能である。現時点では、ヒト ES細胞株「KhES- l」（平成 15年 8月榭立）、「KhE S-2」（平成 15年 10月榭立）、「KhES-3」（平成 15年 10月榭立）が入手可能である
[0022] 前記ヒト ES細胞株 KhES— 1、 KhES 2、 KhES 3は、体外受精や顕微授精な どの生殖補助医療のために作製された受精卵の余剰胚 (移植されずに廃棄されるこ とになっている受精卵）を用いて榭立されたものである。すなわち、この受精卵を胚盤 胞の段階まで培養し、該胚盤胞から内部細胞塊を分離しフィーダ一細胞上で培養し 、増殖してくる未分ィ匕細胞を選別'継代を繰り返し、継代可能にすることで榭立したも のであり、榭立方法自体はマウスやサルの場合と本質的にかわらない。ヒト ES細胞は マウス ES細胞と異なりフィーダ一細胞上で扁平なほぼ単層のコロニーを作り、形態 的にはサル ES細胞に非常によく似ている。ヒト ES細胞は未分化 ES細胞に特異的な マーカーを発現しており、また正常な染色体構成を保持している（末森博文、臨床病 理、 52 : 3 (2004)、 254〜258頁参照）。前記 ES細胞が発現している未分化 ES細 胞に特異的なマーカーとしては、アルカリ性フォスファターゼ (ALP)、 SSEA—3およ び 4、 TRA— 1— 60および 81が認められ、 NanogOct— 3/4、 Rex— 1の発現が R T—PCRによって確認されている。核型（Gバンド法による）については、 KhES— 1、 KhES 2は正常 2倍体で雌の、 KhES— 3は正常 2倍体で雄の核型を持つ（京都大 学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターのホームページの「ヒト ES細胞 の分配についてーヒト ES細胞株 KhES— 1、 一 2、 一 3 」参照）。
[0023] 本発明においては、必要に応じて、 ES細胞を分ィ匕しない条件下に継代、維持、増 殖させ (以下、この工程を調製工程という場合がある）、必要に応じてその一部を使用 して肝細胞に分化誘導する。 [0024] 調製工程にぉ 、て、 ES細胞の培養を行う容器としては、増殖能の点力もフィーダ 一細胞またはスキヤフォールドでコートされたものを使用するのが好まし 、。フィーダ 一細胞としては、 γ線で照射処理したマウス胚性繊維芽細胞が挙げられる。また、該 スキヤフォールドとしては、ラミニン、フイブロネクチン、コラーゲン（コラーゲン IVゃコラ 一ゲン Iなど）、ェンタクチン、自己組織ィ匕能を有するペプチドノヽイド口ゲル、 Poly(p-N -vinylbenzyl-D-lactonamide) (PVLA) (ラタトースを側鎖にもつポリスチレン誘導体）な どが挙げられる。市販品としてはマトリゲル (Matrigel、ラミニン 56%、コラーゲン IV31 o/0、ェンタクチン 8%力もなる、ベタトン ディッキンソン アンド カンパ-一製）、グロ 一スフアクターリデューストマトリゲル（GFR MatrigeUラミニン 61%、コラーゲン IV30 o/0、ェンタクチン 7%力もなる、ベタトン ディッキンソン アンド カンパ-一製）、ピュ ラマトリックス（PuraMatrix、アミノ酸 16残基 (Ac- (RAD A) -CONH )で長さが約 5n
4 2
mのオリゴペプチドであるペプチドハイド口ゲル、（株)スリー ディー マトリックス ジ ャパン製）、 Poly (p— N— vinylbenzyl— D— lactonamide) (PVLA) ((有)セラジッ タス製)などが挙げられる。マウス由来の ES細胞の場合、フィーダ一細胞でコートした 培養容器を使用することが好ましい。また、ヒト由来の ES細胞の場合、本発明の一実 施例であるバイオ人工肝臓に使用する際には、異種生物由来の細胞の混入のおそ れがあるという理由から、マウス由来のフィーダ一細胞でコートした培養容器を使用 せず、スキヤフォールドでコートされた培養容器を使用することが好ましい。さらに、ヒ ト ES細胞の培養状態が良好であることから、前記マトリゲル (Matrigel)、グロ一スファ クタ一リデューストマトリゲル（GFR Matrigel)、ピユラマトリックス（PuraMatrix)などを 用いることがより好ましい。
[0025] 調製工程における培養液、培養条件としては、通常の方法が採用でき、たとえば、 培養液としては、（1) ES培養液 (R— ES— 101、大日本住友製薬株式会社より購入 )：ダルベッコ改変イーグル (DMEM)培養液の混合液（1： 1容量比）に 15%ゥシ胎仔 血清（FBS)、 1%非必須アミノ酸、 1%ヌクレオシド、 110 /z M 2—メルカプトエタノー ル (大日本住友製薬株式会社より購入)、 1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、 1 %グルタミン酸、ならびに 500UZmlマウス由来白血病抑制因子 (LIF) (大日本住 友製薬株式会社より購入)を補足したもの、 （2)霊長類 ES細胞用培地 ((株)リプロセ ル製など）、 (3)マウス胚性繊維芽細胞用馴化培地 (R&Dシステム製など)などが挙 げられる。培養温度は、 36〜37°Cの範囲が好ましぐ pHは 7. 3〜7. 4の範囲が好 ましい。マウス ES細胞の調製工程では、一般に分化を抑制するために白血病抑制 因子 (LIF)を使用するが、ヒト ES細胞の調製工程では白血病抑制因子 (LIF)は分 化抑制に効果がなぐマトリゲルなどのスキヤフォールドを使用するのが好ましい。ま た、フィーダ一細胞を使用せず、スキヤフォールドを使用する培養方法としては、ジェ ロン社 (メロノパーク、カリフォルニア州、米国）が公開している方法（Protocols for the Maintenance of Human Embryonic Stemし ells in Feeder Free conditions) 好まし い。
[0026] 本発明の方法において、 ES細胞を肝細胞へ分化誘導する培養工程に使用する d HGFの濃度は、 IngZmlより高くかつ lOOOngZmlより低いことが好ましぐ 10ng/ ml〜500ngZmlがより好ましぐ lOOngZmlが最も好ましい。 dHGFの濃度が前記 範囲未満の場合、肝細胞への分化が達成されない傾向があり、一方前記範囲を超 える場合、軽度の細胞障害性が確認される傾向がある。
[0027] 本発明においては、 ES細胞に直接 dHGFをカ卩えて分ィ匕誘導を行ってもよいが、ま ず ES細胞から胚様体 (Embryoid Body: EB)を形成したのち、 dHGFをカ卩えて分化誘 導を行なうことが好ましい。胚様体の形成方法としては、培養液にて約 10万個 Zml に希釈した ES細胞をペトリ皿のフタの内側に液滴状（1滴約 30 1)に播種し、液滴 力 Sフタの内側にぶら下がったまま下に落ちない状態で 2日間程度培養し胚様体を形 成させ、その後培養液にて胚様体を洗い落としペトリ皿内で浮遊培養し成熟させるハ ンギングドロップ法；約 500万個の ES細胞を 10cmペトリ皿内で約 10mlの培養液中 で 5日間程度浮遊培養させ胚様体を形成する浮遊培養による形成法などがあげられ る。簡便性の点からは、浮遊培養による胚様体形成法がより好ましい。
[0028] 本発明にお 、ては、一般に胚様体の形成工程で 3〜7日程度培養したのち、次の 分ィ匕誘導工程に移るのが好まし 、。
[0029] 胚様体形成工程における培養液、培養条件としては、通常の方法が採用でき、たと えば、培養液としては、（1) ES分化誘導培地（DMEM F12)〔DMEM (ギブコ BR L、インビトロジヱン コーポレーション製）と栄養素混合物 F— 12 (ハム）（ギブコ BR L、インビトロジェン コーポレーション製）が 1： 1容量比の割合で混合され、 4. 5mg /ml濃度のグルコース、 20%FBS、 2mM L—グルタミン、 25mM HEPES (ギブコ BRL、インビトロジェン コーポレーション製）、 lOOmgZmlペニシリン、 lOOmg/ mlストレプトマイシン（シグマ—アルドリッチ コーポレーション製）を加え、 LIFをカロえ ないもの]、（2)霊長類 ES細胞用培地（(株)リブロセル製など）、（3)マウス胚性繊維 芽細胞用馴化培地 (R&Dシステム製など)などが挙げられる。培養温度は、 36〜37 °Cの範囲が好ましぐ pHは、 7. 3〜7. 4の範囲が好ましい。
[0030] 本発明にお 、て、分ィ匕誘導を行なう培養工程には、平面培養と三次元培養の！/、ず れも使用できるが、近年、スキヤフォールド (足場)上で細胞を三次元培養することで より生体内環境に近い条件を作ることができ、細胞機能が向上することが知られてき ており、肝機能の向上という点から三次元培養が好ましい。
[0031] 三次元培養に使用するスキヤフォールドとしては、ラミニン、フイブロネクチン、コラ 一ゲン IV、コラーゲン Iなどのコラーゲン、ェンタクチン、ペプチドハイド口ゲル、 Poly ( p - N - vinylbenzyl - D - lactonamide) (PVLA)などが挙げられる。市販品とし ては、前記マトリゲル（Matrigel)、グロ一スフアクターリデューストマトリゲル（GFR Mat rigel)、ピユラマトリックス（PuraMatrix)などが挙げられる。さらに、後述する不織布な どが使用できる。
[0032] 分ィ匕誘導工程における培養液、培養条件としては、通常の方法が採用でき、たとえ ば、培養液としては、（1) ES分化誘導培地（DMEM F12)〔DMEM (ギブコ BRL 、インビトロジェン コーポレーション製）と栄養素混合物 F— 12 (ハム）（ギブコ BRL 、インビトロジェン コーポレーション製）が 1： 1容量比の割合で混合され、 4. 5mg/ ml濃度のグルコース、 20%FBS、 2mM L—グルタミン、 25mM HEPES (ギブコ BRL、インビトロジェン コーポレーション製）、 lOOmg/mlペニシリン、 lOOmgZml ストレプトマイシン（シグマ—アルドリッチ コーポレーション製）を加え、 LIFをカ卩えな いもの〕、 （2)霊長類 ES細胞用培地 ((株)リブロセル製など）、（3)マウス胚性繊維芽 細胞用馴化培地 (R&Dシステム製など)などが挙げられる。培養温度は 36〜37°C の範囲が好ましぐ pHは 7. 3〜7. 4の範囲が好ましい。培養期間は 14〜21日程度 である。 [0033] 本発明の分化誘導工程では、 dHGFにカ卩えて様々な有機溶媒、サイト力イン、ホル モンなどの 1種または 2種以上を併用することができる。そのような有機溶媒、サイト力 イン、ホルモンなどは、細胞に悪影響を与えないものであればどのようなものでも使用 することができるが、従来力も細胞の分ィ匕に使用されているものが好ましい。具体的 には、ジメチルスルホキシド（DMSO)、ジメチルァセトアミド（DMA)、へキサメチレン ビスァセトアミドおよびほかのポリエチレンビスァセトアミドなどの有機溶媒や、ァクチ ビン A、 bFGF、ダルココルチコイド、上皮増殖因子（EGF)、インスリン、 TGF— a、 TGF- β、 FGF、へパリン、デキサメタゾン、および HGF、 IL— 1、 IL— 6、 IGF— I、 IGF— IIおよび HBGF—lなどのサイト力インやホルモンなどがあげられる。
[0034] 本発明の方法により ES細胞より分化誘導された肝細胞は、形態学的特徴の観察 および逆転写ポリメラ―ゼ連鎖反応 (RT— PCR)で確認できる。
[0035] 形態学的な確認方法としては、位相差型顕微鏡で観察される複数の核を有する細 胞および電子顕微鏡で観察される細胞質内に豊富な顆粒、特にグリコーゲン顆粒の 存在と!/、つた、肝細胞に特異的な形態学的特徴を確認することが挙げられる。
[0036] また、 RT— PCRにより、誘導された肝細胞の形質発現を遺伝子の発現から評価す ることもできる。アルブミン遺伝子が発現していることと、未分化な遺伝子である a フエトプロテインが発現して 、な 、ことが RT— PCRなどで確認できれば、分化が誘 導されているということができる。また、肝細胞としての成熟度を表わす指標として、上 皮細胞のマーカーである CK18 (サイトケラチン 18)、 G6P (グルコース 6リン酸化酵 素）、 TAT (チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、 HNF3b (肝細胞核因子 3ベータ） の遺伝子発現が認められるのが好ましい。
[0037] さらには、実際に肝細胞として機能できる力否かは、培地中にアンモニア、リドカイ ン、ジァゼパムなどを添加して代謝できるか否かが大きな点となる。また、培地中にァ ルブミン、尿素が産生されていれば、充分に機能的な肝細胞へと分ィ匕しているという ことができる。
[0038] 本発明にお 、ては、必要細胞数まで ES細胞を増殖させたあと、 dHGFを用いて肝 細胞への分化誘導を行なうことで、遺伝子導入を必要とせず、安全な肝細胞が大量 に供給できる。これをバイオ人工肝臓の細胞源とすることで万人が恩恵を受けること ができるバイオ人工肝臓の開発が大いに期待できる。
[0039] よって、本発明のもう 1つの態様は、 ES細胞から分化誘導させた肝細胞を含有する ノィォ人工肝臓およびその製造方法である。
[0040] 本発明のバイオ人工肝臓を製造する場合、リアクター内に充填する際の細胞の分 化の程度が重要であると考えられる。 ES細胞は、胚様体を形成させることにより、不 織布などのスキヤフォールドへの接着性が増強する。また、不織布などのなどのスキ ャフォールドに付着した細胞は三次元のスフエロイド形成を呈する。近年、スキヤフォ 一ルド上で細胞を三次元培養することでより生体内環境に近い条件を作ることができ 細胞機能が向上することが知られてきており、不織布などのスキヤフォールド上で細 胞を培養することが機能の向上に有効である。したがって、胚様体形成後に ES細胞 をリアクターに充填し、 dHGFにて三次元での分ィ匕誘導を行なうことにより、平面培養 するより、肝細胞に特異的な高度な機能であるアンモニア代謝能などが大幅に増強 される。
[0041] よって、 ES細胞カも胚様体形成を促した後にリアクターに細胞を充填し、本発明の 誘導法による肝細胞への分ィ匕を行なうのが好ましい。
[0042] ノィォ人工肝臓としては、中空糸型のリアクター (デバイス）と分離'培養細胞を組 み合わせたパイブリツド型の人工肝臓などが挙げられる。ノィォ人工肝臓は、体外に 装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に 接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の肝細胞は、いず れの形態のノィォ人工肝臓にも使用可能であるが、 ES細胞は、分化誘導すると増 殖能力を失うが、分化が不充分であった ES細胞が遺残した場合、細胞を生体内に 移植すると奇形種を発症する可能性があるため、細胞移入などに伴う危険性を回避 するという点力も体外型であることが好ましい。
[0043] ノィォ人工肝臓の開発においては、リアクターの設計 ·開発も重要な要素である。
バイオリアクターとしては、サーシ バイオメディカル社（Circe Biomedical Inc.) (レキ シントン、マサチューセッツ州、米国）の支援下でシダーズサイナイ医療センター（Ce dars-Sinai Medical Center) (ロサンジェルス、カリフォルニア州、米国）のディメトリュー (Demetriou)らを中心としたブタ肝細胞を用いたバイオ人工肝臓治療用のへパトァシ スト (HepatAssist) (Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 20 01; 8: 1-15.)や、ブタ肝細胞を使用したドイツの Gerlachらの MELS (モジュラー体外 肝臓システム（Modular Extracorporeal Liver System) )など、様々なタイプが知られて いる。これらのリアクターは、もちろん本発明において使用することができる力 肝細 胞が付着するための足場が無いため、細胞はただ単に、中空糸内スペースか、中空 糸外スペースに充填されるのみで浮遊した状態となる傾向がある。肝細胞は、浮遊 状態では、分化機能が充分に発現されない傾向があり、さらに周りの細胞と衝突し、 ストレス刺激を受けやすい。
[0044] したがって、本発明においては、肝細胞に足場が提供できるよう、中空糸と不織布 などのスキヤフォールドからなるリアクターが好ましい。
[0045] 中空糸膜としては、膜表面に細胞が付着して物質交換が妨げられることがなければ どのようなものでも使用することができ、具体的には、従来医療用に用いられている 市販の物、たとえば、ポリスルフォン膜、エチレン 酢酸ビニルランダム共重合体けん 化物膜 (たとえば、商品名：ェバール、クラレメディカル株式会社製など)などが好まし い。市販の中空糸膜のポアサイズは、その用途力も透析膜 (〜5nm)、血漿成分分離 膜 (20〜30nm)、血漿分離膜 (30〜200nm)などがある。物質の透過性の点からは 、血漿分離膜 (30〜200nm)が好ましい。拒絶反応の危険性を回避するため、中空 糸内を流れる血液中の免疫担当細胞や免疫グロブリンが中空糸外の不織布などの スキヤフォールド上に充填した細胞と直接接触することがないよう、 30ηπ！〜 lOOnm が最も好ましい。
[0046] 不織布としては、細胞が接着することが出来るようにカ卩ェ ·修飾されているものが好 ましい。不織布の繊維としては、ポリ四フッ化工チレン（PTFE)などが挙げられる。な かでも、その加工のしゃすさの点から、ポリ四フッ化工チレン（PTFE)にポリアミノ酸 ウレタン（PAU)加工を施したものが好ましい。
[0047] 本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、ハウジングまでの過程を 図 3に示す。裏打 5を施した不織布 6上に中空糸膜 7を置く（図 3 (a) )。ここで、裏打ち 5を施した不織布 6にはスリット 8が設けられている。これをロール状に巻く（図 3 (b) )。 その X— X線断面が図 3 (c)である。これを両端に液漏れ防止部材 9を設けた筒状容 器 10に組み込む。リアクター 11には細胞注入口 12および細胞のサンプル採取を行 なうことができる取り出し口 13が設けられており、スリット 8は、細胞注入口 12と連絡す るように配置される。
[0048] また、バイオ人工肝臓治療は、安全かつ科学的に施行するために、 1)人工肝臓リ アクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、 2)気泡が発生した際の アラームの作動、 3)リアクターの温暖化（37度)などができる機能を一体ィ匕した装置 で実施されることが好まし 、。
[0049] このようなバイオ人工肝臓として、中空糸 '不織布型リアクターに新鮮分離ブタ肝臓 細胞、可逆性不死化ヒト肝細胞を充填し、サル肝不全モデルでの動物実験にて良好 な成績を得ている（小林直哉他、「ハイブリッド人工肝臓」、肝胆脾、 2003年、 46卷、 p381— 393)。
[0050] さらに、本発明の方法により ES細胞から分化誘導された肝細胞、特にヒト肝細胞は 、薬剤の代謝試験用細胞として有用である。すなわち、新薬開発や安全性試験、毒 性試験などにおける試験用細胞として有用である。
[0051] 肝細胞は様々な薬物代謝の中心となっており、薬物の毒性や安全性を検定するた めには、肝細胞に薬物を投与して代謝のされ方を調べることが必要である。そして、 物質代謝においては、ヒトと実験動物とでは大きな違いがあるので、最終的なテスト はヒト肝細胞を使用した試験が不可欠である。この点において、均一な品質のヒト肝 細胞を大量に提供できる本発明は有用である。このような代謝試験に用いる装置とし ては、前記のバイオ人工肝臓と同様な構造のものなどが使用できる。
[0052] さらに、本発明の方法により ES細胞から分化誘導された肝細胞、特にヒト肝細胞は 、生理活性物質の産生に使用できる。このような生理活性物質としては、アルブミン、 各種血液凝固因子などが挙げられる。このような生理活性物質の製造装置としては、 前記のバイオ人工肝臓と同様な構造のものなどが使用できる。
[0053] 以下、本発明をマウスおよびヒト由来の ES細胞を用いた実施例をあげて説明する 力 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
[0054] 製造例 1 ES細胞の調製
129vマウス由来の ES細胞 (大日本住友製薬株式会社より購入)を、ネオマイシン 耐性遺伝子が導入されているフィーダ一細胞 (マウス由来の胚性繊維芽細胞、大日 本住友製薬株式会社より購入)を用いて、 0. 1%の濃度のゼラチン水 (カタログ番号 ： R-ES-006B,大日本住友製薬株式会社より購入)でコートしてある培養フラスコ T— 75 (ファルコン社製、ベタトン デッキンソン アンド カンパ-一（Becton, Dickins on and Company)販売）を使用して培養した。培養液には、 ES培養液 (R— ES— 10 1：大日本住友製薬株式会社より購入）：ダルベッコ改変イーグル (DMEM)培養液 の混合液（1 : 1容量比）に 15%ゥシ胎仔血清 (FBS)、 1%非必須アミノ酸、 1%ヌクレ オシド、 110 M 2—メルカプトエタノール (大日本住友製薬株式会社より購入）、 1 %ペニシリンおよびストレプトマイシン、 1%グノレタミン酸、ならびに 500U/mlマウス 由来白血病抑制因子 (LIF) (大日本住友製薬株式会社より購入)を補足したものを 使用した。培養液は毎日交換し、 ES細胞は、 3日毎に継代した。培養プレート中に E S細胞が占める割合が 80〜90%の状態になったところで、 2段階式処置にて、すな わち、まず、 0. 25%濃度のトリプシン— EDTA (ギブコ BRL、インビトロジェン コー ポレーシヨン（Invitrogen Corporation)製）を添カ卩し、 45秒間経過後、トリプシン— ED TA液を取り除くことでフィーダ一細胞を一緒に除去し (ES細胞はまだこの段階では 培養プレートに残っている）、ついでその 2分後に ES培養液をカ卩ぇ剥離することによ つて、培養プレートに残っている ES細胞を回収した。
実施例 1
製造例 1で得られた ES細胞 500万個を 0. 1%の濃度のゼラチン水 (カタログ番号： R— ES— 006B、大日本住友製薬株式会社より購入)でコートしてある培養フラスコ T — 75 (ファルコン社製、ベタトン デッキンソン アンド カンパ-一販売）で、 10mlの ES分化誘導培地（DMEM F12)中に lOOngZml濃度のマウス由来 dHGF (第一 製薬株式会社 (東京)より提供）と、 lOOngZml濃度の bFGF、 1%濃度の DMSO ( シグマ アルドリッチ コーポレーション（Sigma- Aldrich Corp.)製）、 10— 7モル濃度の デキサメタゾン (シグマ アルドリッチ コーポレーション製）を添加して肝細胞への分 化誘導培養を行なった。 [0056] DMEM F12の組成は、 DMEM (ギブコ BRL、インビトロジェン コーポレーショ ン製）と栄養素混合物 F— 12 (ハム）（ギブコ BRL、インビトロジェン コーポレーショ ン製）が 1 : 1の割合で、 4. 5mgZml濃度のグルコース、 20%FBS、 2mM L—グル タミン、 25mM HEPES (ギブコ BRL、インビトロジェン コーポレーション製）、 100 mgZmlペニシリン、
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（シグマーァノレドリツチ コーポレ ーシヨン製)で LIFを加えないものである。培養液は、 3日毎に交換した。培養開始か ら 14日後に肝細胞への分ィ匕誘導効果の検討を行なったところ、数個の核小体を有 する核といった、いわゆる肝細胞の形態学的特徴を有し、アルブミンの発現が見られ 、肝細胞への分化が確認された。
[0057] 実施例 2
製造例 1で得られたマウス ES細胞 500万個を 10cm滅菌シャーレ（浅型 90 X 15m m、商品番号: SH90— 15、旭テクノグラス株式会社製)で 10mlの ES培養液 (R—E S— 101)を使用し、 5日間浮遊培養させて胚様体を形成した。
[0058] ついで、 ES細胞の代わりに得られた胚様体を使用した以外は、実施例 1と同様に してマウス肝細胞を誘導した。
[0059] 実施例 3
実施例 2と同様にして形成した胚様体を、 1cm X 1cm大の細胞接着性を有するポ リアミノ酸ウレタン（PAU)加工の PTFE (polytetrafluoroethylene)不織布（クラレメディ カル株式会社製）を敷 ヽた 12穴培養プレート（正式名： Multiwell 12—well Falc on、ファルコン社製、ベタトン デッキンソン アンド カンパ-一販売）に、 3 X 106細 胞個 Zcm2となるように播種し、実施例 1と同じ ES分ィ匕誘導培地 DMEM F12を用 い、 lOOngZml濃度のマウス由来 dHGF (第一製薬株式会社 (東京)より提供)と、 1 OOngZml濃度の bFGF、 1%濃度の DMSO (シグマ—アルドリッチ コーポレーショ ン製）、 10— 7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ—アルドリッチ コーポレーション製）を 添加して 14日間培養し、マウス肝細胞を誘導した。培養液は 3日毎に交換した。
[0060] 得られた細胞の形態は、位相差顕微鏡 (ォリンパス CK40、ォリンパス株式会社製) を使用して観察した（図 1)。また、走査電子顕微鏡により、播種した直後の胚様体の 不織布繊維 4への付着状況 (図 2 (a) )および 14日後の分化誘導された肝細胞（図 2 (b) )も観察した。符号 1は分化誘導された肝細胞を、符号 2は核を、符号 3は胚様体 を、符号 4は不織布の繊維を示す。
[0061] 製造例 2
ノィォ人工肝臓リアクターの製造
中空糸と不織布とからなる全血還流型システムのバイオ人工肝臓 (BAL) (図 3参照
)を以下の手順に従い製造した。中空糸膜の種類により、表 1に示すように、それぞ れ BAL - 1〜： BAL - 3とした。
[0062] [表 1]
Figure imgf000018_0001
* 1クラレメディ力ル株式会社製
[0063] 10cmの中空糸膜 550本をレーヨンで裏打ちした不織布（10 X 10cm)の上に規則 正しく置き（図 3 (a)参照）、これをロール状に巻き込んだ（図 3 (b)参照)。断面の模式 図を図 3 (c)に示す。この不織布と中空糸膜からなるロールを、両端に液漏れ防止部 材を設けた筒状容器に組み込んだ (図 3 (d)参照)。
[0064] なお、不織布としては、細胞接着性を有するポリアミノ酸ウレタン (PAU)加工の PT FE不織布 (クラレメディカル株式会社製)を使用した。
[0065] 得られたリアクターの生体適合性を判定するために、各リアクターをそれぞれ健常 ブタの頸部動静脈間に装着して作動させたところ、 24時間循環動態に悪影響なく無 事に稼働させることができた。また、赤血球 ·血小板などの血球成分の減少も認めな かった。
[0066] また、 BAL治療を安全かつ科学的に施行するために、 1) BALリアクターの流入圧 と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、 2)気泡が発生した際のアラームの作動、 3 )リアクターの温暖化（37度)できる機能を一体ィ匕した装置を開発し、システムが良好 に作動することをブタ実験にて検証した。
[0067] 実施例 4
前記製造例 2で得られたノィォ人工肝臓リアクター BAL— 2に、実施例 2で得られ た胚様体を中空糸外スペースに充填し、 lOmlES細胞分化誘導培地： DMEM F12 中に lOOngZml濃度のマウス由来 dHGF (第一製薬株式会社 (東京)より提供)と、 lOOngZml濃度の、マウス由来 bFGF、 1%濃度の DMSO (シグマ—アルドリッチ コーポレーション製）、 10— 7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ アルドリッチ コーポ レーシヨン製)を添加して肝細胞への分ィ匕誘導培養を行なった。培養液は 3日毎に交 換し、培養 14日後に分化誘導効果の検討を行なった。
[0068] 試験例 1
誘導された肝細胞における遺伝子発現
RT— PCR法により、誘導された肝細胞（実施例 2および 3)において、肝臓代謝に 関わる重要な遺伝子、すなわち、 CK18 (サイトケラチン 18)、 G6P (グルコース 6リン 酸化酵素）、 TAT (チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、アルブミン、 AFP (アルファ フエトタンパク質)および HNF3b (肝細胞核因子 3ベータ)遺伝子の発現を調べた。 内因子性コントロールとして GAPDH遺伝子の発現も調べた。 RT—PCR法では、細 胞を 0. 25%トリプシン一 EDTA (ギブコ BRL、インビトロジェン コーポレーション製 )で処理したのちに回収し、 RNAトリゾール (インビトロジェン コーポレーション製）を 用いて製品の取扱説明書にしたがって RNAを抽出した。 1 μ gの総 RNAを 22°Cで 1 0分間、さらに 42°Cで 20分間、 RNA逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
[0069] 得られた 2 μ gの逆転写産物を、各プライマー 20pmolZmlで、 AmpliTag Gold キット（パーキン一エルマ一 Zシータス社、ノーウォーク、コネチカット州、米国）を用 い、そのプロトコールにしたがって PCR増幅に用いた。各遺伝子に対するプライマー および PCR条件を以下に記載する。
[0070] マウス CK18遺伝子（182bp、 59°C、 35サイクル）
5' プライマー： 5' —CGATACAAGGCACAGATGGA (配列番号 1)
3' プライマー： 5' — CTTCTCCATCCTCCAGCAAG (配列番号 2) マウス G6P遺伝子（206bp、 57。C、 35サイクル） 5' プライマー： 5' —CAGGACTGGTTCATCCTT (配列番号 3)
3' プライマー： 5' — GTTGCTGTAGTAGTCGGT (配列番号 4)
マウス TAT遺伝子（210bp、 55。C、 35サイクル）
5' プライマー： 5' —ACCTTCAATCCCATCCGA (配列番号 5)
3' プライマー： 5Z — TCCCGACTGGATAGGTAG (配列番号 6)
マウスアルブミン遺伝子（174bp、 59。C、 35サイクル）
5' プライマー： 5' — GCTAGGCACACAGTGCTTG (配列番号 7)
3' プライマー： 5' - CAGGATTGCAGACAGATAGTC (配列番号 8) マウス AFP遺伝子（300bp、 59。C、 32サイクル）
5' プライマー： 5' — CACTGCTGCAACTCTTCGTA (配列番号 9)
3' プライマー： 5' — CTTTGGACCCTCTTCTGTGA (配列番号 10) マウス HNF3b遺伝子（500bp、 60。C、 35サイクル）
5' プライマー： 5' —TATTGGCTGCAGCTAAGCGG (酉己列番号 11) 3' プライマー： 5' - GCATCGGACTCAGGTGAGGT (配列番号 12) マウス GAPDH遺伝子（459bp、 60。C、 32サイクル）
5' プライマー： 5' — CAGCCGAGCCACATC (配列番号 13)
3' プライマー： 5Z —TGAGGCTGTTGTCATACTTCT (酉己列番号 14) 結果を図 4に示す。レーン 1から 6は、それぞれサイズマーカー、未分化 ES細胞、フ ィーダ一細胞、分化誘導された ES細胞 (実施例 2)、不織布上で分化誘導された ES 細胞（実施例 3)およびマウス肝細胞を示す。実施例 2および 3で誘導された肝細胞 では、肝臓細胞に関わる重要な遺伝子、 CK18 (サイトケラチン 18)、 G6P (ダルコ一 ス 6リン酸化酵素）、 TAT (チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、アルブミン、および H NF3b (肝細胞核因子 3ベータ）遺伝子の発現が確認される力 特に不織布を用いて 誘導された肝細胞（実施例 3)では、 CK18 (サイトケラチン 18)、 G6P (グルコース 6リ ン酸化酵素）、 TAT (チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、アルブミン遺伝子の発現 が増強し、未分ィ匕細胞のマーカーである AFP (アルファフエトタンパク質)発現の消失 が観察された。当該結果は、不織布を使用することで、肝細胞への分化誘導がより効 率よく誘導されることを示す。 [0072] 試験例 2
肝機能の測定
(A)アンモニアの代 f
実施例 2〜4で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その培溶液中に、 1. 4ミリモルの四塩ィ匕アンモ-ゥムを負荷し、 4時間後 に培養液を 10 1採取し、アンモニア濃度を測定した。
[0073] (B)ジァゼバムの代謝
実施例 2〜4で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その培養液中に、ジァゼバムを最終濃度 1 μ gZmlとなるよう負荷し、 4 時間後に培地を 1000 1採取し、ジァゼバム濃度を測定した。
[0074] (C)リドカインの代謝
実施例 2〜4で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その培養液中に、リドカインを最終濃度 lmgZmlとなるよう負荷し、 4時 間後に培地を 1000 1採取し、リドカイン濃度を測定した。
[0075] 前記 (A)〜 (C)のそれぞれの代謝率を図 5に示す。代謝率は、薬物負荷時の該薬 物の濃度から 4時間後の各薬物濃度を引いたものを薬物負荷時の該薬物の濃度で 割った値で表わす。各実施例ともに薬物代謝能が見られるが、不織布における培養
、さらにはリアクター内で三次元培養することにより、薬物代謝能が増強されているこ とがわかる。
[0076] (D)尿素の産生
前記 (A)と同様に 1. 4ミリモルの四塩ィ匕アンモ-ゥムを負荷し、 4時間後に培養液 を採取し、尿素の産生量を測定した。実施例 2〜4で、それぞれ細胞 100万個当たり
21. 4 /z g、 22. 2 gおよび 24. 7 gであった（図 6)。
[0077] (E)アルブミンの産生
実施例 2〜4で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その後 24時間培養したのちの培養液を採取し、マウスアルブミン ELIS
Aキット（商品コード: E90— 134、フナコシ株式会社)を使用してアルブミンの産生量 を測定した。アルブミンの産生量は、実施例 2〜4で、それぞれ lml当たり 500ng、 8 50ngおよび 920ngであった（図 7)。不織布上での培養、さらにはリアクター内での 三次元培養によりアルブミン産生能が増強されていることがわかる。
[0078] 参考例
新鮮ブタ肝臓細胞を充填したバイオ人工肝臓の機能評価
施設動物実験取り扱い指針に従い、検疫済みの力二クイザル（日本クレアから購入 )を用いて製造例 1にお 、て作製したバイオ人工肝臓リアクターの安全性と有効性を 検討した。
[0079] 製造例 1で作製したバイオ人工肝臓リアクター BAL - 1に約 10億個のブタ肝臓細 胞 (生存率 > 90%)を充填した。新鮮分離ブタ肝細胞は、外科的に切除した肝臓 外側区域をデイスパーゼとコラゲナーゼを用いた 4段階還流法にて分離した (丸山昌 伸，小林直哉，都津川敏範ら、 Organ Biology, Vol.9, No.3. 295-301, 2002) 0
[0080] 雄性力-クイザル (4kg、 n=6)に、 0. 5g/kgの D—ガラクトサミン（シグマ社カも購 入)を静注して薬剤性肝障害を誘導した。
[0081] D—ガラクトサミン投与 18時間後に、全身麻酔下に治療群のサル (n= 2)の左内頸 動脈にアトム 6Frのカテーテル (アトムメディカル株式会社、東京、 日本)を挿入し、そ して左外頸静脈にアトム 6Frのカテーテルを挿入してその間に、ブタ肝臓細胞を充填 したバイオ人工肝臓リアクターを接続した。ポンプに PERISTA BIO-MINIPUNP(ATT 0、東京、 日本)を用い、流量 10ml/分で 6時間、体外循環させた。麻酔は、静脈麻 酔として、デュプリバンを使用した（5ml/時間）。抗血栓療法として、血液がリアクター を通過する直前に、リアクターの中枢側よりへノ^ン 1000単位を注入し、以後体外循 環中はへノ《リンの持続注入 (へノ リン 500単位/時間）により、全身へパリン化を行な つた o
[0082] ネガティブ 'コントロール群 (n= 2)として、細胞を充填していない空リアクターを用 いて、同様の試験を行なった。
[0083] 結果は、ネガティブ 'コントロール群では、 2例のサルはいずれも D—ガラクトサミン 投与後 1週間以内に肝不全で死亡した。剖検では、肝臓の出血壊死、顕著な萎縮、 黄疽性の胸'腹水の貯留を認め、組織学的にも肝細胞の広範な壊死を認めた。一方 、約 10億個のブタ肝臓細胞を装填した群はいずれも 3週間以上生存し、剖検所見で も一切の異常を認めな力つた。
[0084] 製造例 3
ヒト ES細胞の調製
ヒト由来の ES細胞として、 KhES 1 (京都大学再生医科学研究所から「再生医科 学研究所ヒト ES細胞分配規定」に則って分配されたもの）を使用した。本細胞の培養 は、ジェロン社が公開している培養方法（Protocols for the Maintenance of Human E mbryonic Stem Cell in Feeder Free Conditions ^ンェロン社のウェブサイト (http://ww w.geron.com)に公開されている。 )に準じて行った。具体的には、以下のように培養し た。
[0085] 培養プレートは、マトリゲル（ベタトン ディッキンソン アンド カンパ-一製）でコー トしてある 6ゥエルプレート（ファルコン社製、ベタトン ディッキンソン アンド カンパ二 一販売）を使用し、培養液は ES培養液としてマウス胚性繊維芽細胞用馴化培地 (力 タログ番号: AR005、 R&D システムズ社製)を使用した。培養液は毎日交換し、交 換時にはマウス塩基性繊維芽細胞増殖因子 (bFGF)を lOOngZmlとなるように、培 養液中に添加した。 ES細胞は 7日毎に継代した。具体的には、培養プレート中に ES 細胞が占める割合が 80〜90%の状態になったところで、 2段階式処置にて、すなわ ち、まず、コラゲナーゼ IV液（200UZml) (ギブコ RBLZインビトロジェン社製、カタ ログ番号： 17104— 019)を添カ卩し、 37°C、 10分間経過後に、コラゲナーゼ IV液を除 去することによってフィーダ一細胞を除去した。この段階では、未分化状態の ES細 胞はプレートに残っている。ついで、前記 6ゥエルプレートに ES培養液 2mlを添カロし 、 2mlピペットを用いて、培養プレートに残っている未分化状態の ES細胞をスクラッ チして剥離した後に、 5回ピペッティングし、 6ゥエルプレートに播種して継代した。
[0086] 実施例 5
製造例 3で得られた 5 X 106個の KhES 1細胞を 2mlの ES培養液 (製造例 3で使 用したものと同じ)で希釈したものを、予め ES培養液 (製造例 3で使用したものと同じ ) lmlをカ卩えておいた胚様体形成用培養皿（COSTAR、コ一-ング インコーポレイ ティッド製)の中央に播種した。この胚様体形成用培養皿で 5日間培養し、胚様体を 形成した後に、 lOOngZmlのヒト由来 dHGF (第一製薬株式会社より提供）、 lOOng Zmlのヒト由来 bFGF、 1%の DMSOおよび 10— 7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ アルドリッチ コーポレーション製)を含む ES培養液 (製造例 3で使用したものと同じ )で培養して、肝細胞への分化誘導を 14日間行った。培養液は 2日毎に交換した。 胚様体を形成したヒト ES細胞の位相差顕微鏡写真を図 8に、ヒト ES細胞から分化誘 導された肝細胞の位相差顕微鏡写真を図 9に示す。分化誘導された肝細胞 21には 肝細胞の特徴である複数の核 22が観察される。
[0087] 実施例 6
製造例 3で得られた KhES— l細胞を、 1cm X 1cm大の細胞接着性を有するポリア ミノ酸ウレタン (PAU)加工の PTFE不織布 (クラレメディカル (株)製)を敷き、 ES培養 液 (製造例 3で使用したものと同じ)をカ卩えた 12穴培養プレート（マルチウエル 12ゥェ ルファルコン、ファルコン社製）に、 3 X 106細胞数 Zcm2となるように播種した。前記 E S細胞を培養プレートに播種したのち、 5日間培養して胚様体を形成した。不織布上 に形成された胚様体の走査電子顕微鏡写真を図 10 (a)に示す。図 10 (a)において は、不織布の繊維 4に付着した胚様体 23が示されて 、る。
[0088] ついで、 lOOngZmlのヒト由来 dHGF、 lOOngZmlのヒト由来 bFGF、 1%の DM SOおよび 10—7Μのデキサメタゾンを含んだ ES培養液 (製造例 3で使用したものと同 じ)を用いて、 14日間培養し、肝細胞への分化誘導を行った。培養液は 2日毎に交 換した。不織布上で分ィ匕誘導された肝細胞の走査電子顕微鏡写真を図 10 (b)に示 す。図 10 (b)においては不織布の繊維 4に付着した分化誘導された肝細胞 21が示 示されている。
[0089] 試験例 3
誘導された肝細胞における遺伝子発現および形態学的変化
実施例 5および 6に記載の誘導された肝細胞において、 RT— PCR法により、肝臓 代謝に関わり、肝細胞特異的な遺伝子であるアルブミン遺伝子の発現を調べた。内 因性コントロールとしてベータァクチン遺伝子の発現も調べた。 RT—PCR法では、 マウスの場合の試験例 1と同様に行った。すなわち、細胞を 0. 25%トリプシン— ED TAでの処理後、回収し、製品の取り扱い説明書にしたがって、 RNAトリゾールにより RNAを抽出した。 1 μ gの総 RNAを 22°Cで 10分間、さらに 42°Cで 20分間、 RNA逆 転写酵素を用いて逆転写反応をさせた。
[0090] 得られた 2 μ gの逆転写物を、 20pmol/mlの各プライマーで、アンプリタッグ ゴール ド キット（AmpliTag Gold Kid) (パーキン 'エルマ一 Zシータス社製）を用い、そ のプロトコールにしたがって、 PCR増幅に用いた。各遺伝子に対するプライマーおよ び PCR条件を以下に記載する。
[0091] ヒ卜アルブミン遺伝子（576bp、 59。C、 35サイクル）
5' プライマー： 5' —AAACCTCTTGTGGAAGAGCC (酉己列番号 15) 3' プライマー： 5' — CAAAGCAGGTCTCCTTATCG (配列番号 16) ヒトベータァクチン遺伝子（610bp、 60°C、 32サイクノレ）
5' プライマー： 5Z — TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA (配 列番号 17)
3' プライマー： 5' CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGACGG (配 列番号 18)
[0092] 結果を図 11に示す。レーン 1〜7は、それぞれサイズマーカー、未分化ヒト ES細胞 、胚様体を形成したヒト ES細胞、胚様体を形成させた後に不織布上を使用せずに分 化誘導されたヒト ES細胞 (実施例 5)、胚様体を形成させた後に不織布上で分化誘 導されたヒト ES細胞（実施例 6)、ヒト肝細胞、そしてサイズマーカーを示す。実施例 5 および 6で誘導された肝細胞にお ヽては、肝細胞特異的なマーカー遺伝子であるァ ルブミンの発現が確認されるが、特に不織布を使用する三次元培養により誘導され た肝細胞（実施例 6)では、発現が増強していることが確認できる。この結果は、不織 布を使用することで肝細胞の分化誘導がより効率よく誘導できることを強く支持してい る。
[0093] また、不織布を使用して、誘導されたヒト ES細胞の細胞内では、透過電子顕微鏡 により、成熟した肝細胞に特徴的であるグリコーゲン顆粒（図 12)が観察された。図 1 2において、符号 24、 25、 26は、それぞれ小胞体、ミトコンドリアおよびグリコーゲン 顆粒を示す。
[0094] 試験例 4
肝機能の測定 (A)アンモニアの代 f
実施例 5〜6で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その培溶液中に、 1. 4ミリモルの四塩ィ匕アンモ-ゥムを負荷し、 4時間後 に培養液を 10 1採取し、アンモニア濃度を測定した。実施例 5〜6におけるアンモ ユアの代謝率は、それぞれ 7. 1%、 7. 8%であった。
[0095] (B)リドカインの代謝
実施例 5〜6で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その培養液中に、リドカインを最終濃度 lmgZmlとなるよう負荷し、 4時 間後に培地を 1000 1採取し、リドカイン濃度を測定した。実施例 5〜6におけるリド 力インの代謝率は、それぞれ 13. 4%、 23. 2%であった。
[0096] 前記 (A)、（B)のそれぞれの代謝率を図 13に示す。代謝率は、薬物負荷時の該薬 物の濃度から 4時間後の各薬物濃度を引いたものを薬物負荷時の該薬物の濃度で 割った値で表わす。各実施例ともに薬物代謝能が見られるが、不織布上での三次元 培養により、薬物代謝能が増強されていることがわ力る。
[0097] (C)尿素の産生
前記 (A)と同様に 1. 4ミリモルの四塩ィ匕アンモ-ゥムを負荷し、 4時間後に培養液 を採取し、尿素の産生量を測定した。実施例 5〜6で、それぞれ細胞 100万個当たり 5. 4 /z g、 6. 8 /z gであった（図 14)。
[0098] (D)アルブミンの産生
実施例 5〜6で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から 14日後に新しいもの に交換した。その後 24時間培養したのちの培養液を採取し、 albumin ELISA kit ALB UWELL II (Exocell Inc、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、米国)を使用してアル ブミンの産生量を測定した。アルブミンの産生量は、実施例 5〜6で、それぞれ lml当 たり 289ng、 349ngであった（図 15)。不織布を使用する三次元培養により誘導され た肝細胞はアルブミン産生能が増強されていることがわかる。
産業上の利用可能性
[0099] 本発明の分ィ匕誘導方法により、健常ヒト肝臓細胞を代替するのに充分機能的であり 、大量供給が可能で安全な肝細胞を誘導することができる。また、本発明のバイオ人 工肝臓は、体外型とした場合、細胞移入などに伴う危険性を回避し、より安全性の高 い治療が実現できる。さらに、本発明においては、大量供給が可能なヒト肝細胞を使 用する薬物の検査方法および生理活性物質の産生方法が提供される。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 :マウス CK18遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライ マー
配列番号 2 :マウス CK18遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライ マー
配列番号 3 :マウス G6P遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライ マー
配列番号 4 :マウス G6P遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライ マー
配列番号 5：マウス TAT遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 5' プライ マー
配列番号 6：マウス TAT遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 3' プライ マー
配列番号 7 :マウスアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プ ライマー
配列番号 8 :マウスアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プ ライマー
配列番号 9 :マウス AFP遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 5' プライ マー
配列番号 10 :マウス AFP遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 3' プライ マー
配列番号 11：マウス HNF3b遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プ ライマー
配列番号 12 :マウス HNF3b遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プ ライマー 配列番号 13 :マウス GAPDH遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライマー
配列番号 14 :マウス GAPDH遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライマー
配列番号 15：ヒトアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プ ライマー
配列番号 16：ヒトアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プ ライマー
配列番号 17 :ヒトベータァクチンを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライ マー
配列番号 18：ヒトベータァクチンを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用 プライ マー

Claims

請求の範囲
[I] 胚性幹細胞を欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養することを特徴とする、胚性 幹細胞の肝細胞への分化誘導方法。
[2] 胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法であって、
(a)胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、および
(b)得られた胚様体を、欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養する工程 を含む方法。
[3] 胚性肝細胞が哺乳類由来のものである請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法
[4] 哺乳類がヒトである請求の範囲第 3項記載の方法。
[5] 哺乳類がマウスである請求の範囲第 3項記載の方法。
[6] 胚様体が浮遊培養により形成される請求の範囲第 2項〜第 5項のいずれかに記載 の方法。
[7] 培養が三次元培養で行なわれる請求の範囲第 1項〜第 5項の 、ずれかに記載の 方法。
[8] 請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれかに記載の方法により誘導される肝細胞。
[9] 請求の範囲第 8項記載の肝細胞を含有するバイオ人工肝臓。
[10] ノィォ人工肝臓の製造方法であって、
(a)胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、
(b)得られた胚様体をバイオ人工肝臓リアクター内に充填する工程、および
(c)バイオ人工肝臓リアクター内で、前記胚様体を欠失型肝細胞増殖因子の存在下 で培養する工程
を含む方法。
[I I] 請求の範囲第 8項記載の肝細胞を使用して薬物を検査する方法。
[12] 請求の範囲第 8項記載の肝細胞を使用して生理活性物質を産生する方法。
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