WO2021200235A1 - ３次元腸組織モデルの作製方法 - Google Patents

３次元腸組織モデルの作製方法 Download PDF

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WO2021200235A1
WO2021200235A1 PCT/JP2021/011188 JP2021011188W WO2021200235A1 WO 2021200235 A1 WO2021200235 A1 WO 2021200235A1 JP 2021011188 W JP2021011188 W JP 2021011188W WO 2021200235 A1 WO2021200235 A1 WO 2021200235A1
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scaffold
lumen
intestinal
dimensional
cells
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PCT/JP2021/011188
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行子 松永
忠章 中島
克典 佐々木
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国立大学法人 東京大学
住友化学株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional intestinal tissue model. It also relates to a three-dimensional intestinal tissue model obtained by the production method and a scaffold material suitable for the production method.
  • the intestine plays an important role in the absorption and metabolism of orally administered drugs, and it is known that certain diseases are associated with the intestinal immune system.
  • a plane two-dimensional (2D) culture system using Caco-2 cells derived from human colon cancer is common, and even when an artificial model imitating the intestinal tract is used. Its structure was sheet-like (for example, Non-Patent Document 1). Therefore, it is not easy to co-culture with cells of other species other than epithelial cells, and especially when using immune cells, the effect of three-dimensional migration must be investigated, which is not possible with the current experimental system. Met.
  • the conventional intestinal tissue model having a two-dimensional sheet-like structure is sufficiently viable for examining the absorption efficiency of substances. It could not be said that it reflected the inside of the body.
  • three-dimensional culture of a biological tissue model has a problem that it lacks convenience because the operation and setting of culture conditions are complicated and it is necessary to add power such as perfusion. Therefore, there is a demand for a three-dimensional intestinal tissue model chip (gut-on-a-chip) that can be produced by a simple method and can be tested for absorption of a drug.
  • an object of the present invention to provide an intestinal tissue model having a three-dimensional tubular structure and capable of an absorption test of a drug reflecting the environment in the living body, and a simpler production method thereof. Is.
  • the present inventors form a lumen in a scaffold (scaffold material) having cell adhesion, and inoculate and culture intestinal epithelial cells in the lumen.
  • a three-dimensional intestinal tissue model having microvilli and tight junction structure very close to the structure in the living body can be obtained by a simple method.
  • a three-dimensional intestinal tissue model it is possible to evaluate the function, which was difficult in the past, by observing the action of drug absorption only from the lumen side like the intestinal tract in the living body. I also found it.
  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional intestinal tissue model, more specifically, ⁇ 1> A method for producing a three-dimensional intestinal tissue model, a) a step of preparing a scaffold made of a material having cell adhesion and having at least one lumen extending in the long axis direction; b) the above.
  • the production method comprising a step of seeding intestinal epithelial cells inside the lumen of the scaffold; and c) a step of three-dimensionally culturing the intestinal epithelial cells in the scaffold to obtain an intestinal tissue model;
  • ⁇ 2> The production method according to ⁇ 1> above, wherein the intestinal tissue is the intestinal tract;
  • ⁇ 3> The production method according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the material having cell adhesion is a hydrogel;
  • ⁇ 4> The production method according to ⁇ 3> above, wherein the hydrogel is a collagen gel or a hyaluronic acid gel;
  • ⁇ 5> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the lumen has a cylindrical cross section in the range of 250 to 1000 ⁇ m in diameter;
  • ⁇ 6> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the lumen penetrates the scaffold.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, further comprising a step of coating the inner surface of the lumen of the scaffold with a cell adhesive molecule before the step b).
  • Manufacturing method ⁇ 8> The production method according to ⁇ 7> above, wherein the cell adhesion molecule is an extracellular matrix, an extracellular matrix-like molecule, or a polyamine; ⁇ 9> The production method according to ⁇ 8> above, wherein the extracellular matrix is laminin, fibronectin, or a combination thereof; ⁇ 10>
  • the production method according to any one; ⁇ 11> The production method according to ⁇ 1> above, further comprising the step of producing the scaffold including the following steps: a step of adding a solution of a material having cell adhesion into a base material container; the solution is The step of inserting the rod-shaped member into the stored space; the step of gelling the solution to form the scaffold; the step of removing the rod-shaped member after gelation and extending at least 1 in the long axis direction of the scaffold.
  • Steps to form two lumens ⁇ 12> The production method according to ⁇ 11> above, wherein a part of the inner surface of the cavity is formed of a base material container; ⁇ 13> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12> above, wherein the scaffold encloses cells other than the intestinal epithelial cells; and ⁇ 14> the scaffold is an immune cell or stromal cell.
  • the production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12> above, which encloses a plasmic cell, is provided.
  • the present invention also targets a scaffold material suitable for producing a three-dimensional intestinal tissue model, and more specifically, the present invention.
  • a scaffold material for culturing intestinal epithelial cells to prepare a three-dimensional intestinal tissue model which is made of a material having cell adhesion and has at least one lumen extending in the long axis direction.
  • the scaffold material; ⁇ 16> The scaffold material according to ⁇ 15> above, wherein the material having cell adhesion is a hydrogel; ⁇ 17> The scaffold material according to ⁇ 16> above, wherein the hydrogel is a collagen gel or a hyaluronic acid gel; ⁇ 18> The scaffold material according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 17>, wherein the lumen has a cylindrical cross section in the range of 250 to 1000 ⁇ m in diameter; ⁇ 19> The scaffold material according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 18>, wherein the lumen penetrates the scaffold; ⁇ 20> The scaffold material according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 19>, wherein the inner surface of the lumen is coated with a cell adhesive molecule; ⁇ 21> The scaffold material according to ⁇ 20> above, wherein the cell adhesion molecule is an extracellular matrix or a polyamine; ⁇ 22> The scaffold material according to ⁇ 21> above, wherein the extracellular matrix is laminin, fibros
  • the present invention also targets a three-dimensional intestinal tissue model, a method for evaluating its function, and the like, and more specifically, ⁇ 27> A three-dimensional intestinal tissue model formed in the lumen of the scaffold material according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 26>above; ⁇ 28> The three-dimensional intestinal tissue model according to ⁇ 27> above, which is an intestinal tract model having a villous structure; ⁇ 29> The three-dimensional intestinal tissue model according to ⁇ 28> above, wherein the epithelial cell occupancy in the lumen is 50% or more; ⁇ 30> A device including the three-dimensional intestinal tissue model according to any one of ⁇ 27> to ⁇ 29>above; ⁇ 31> A method for evaluating the function of the intestinal tissue model using the three-dimensional intestinal tissue model according to any one of ⁇ 27> to ⁇ 29>above; ⁇ 32> The method according to ⁇ 31>above; and ⁇ 33> the scaffold, comprising supplying a compound into the lumen of the scaffold material and
  • a three-dimensional intestinal tissue model in which microvilli that are very close to the structure in the living body are induced can be constructed by a simple method.
  • it has an excellent effect that cannot be achieved by the conventional method in that the villous structure can be induced only by culturing the intestinal epithelial cells in a tubular shape without requiring power.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a procedure for producing a three-dimensional intestinal tract model of the present invention.
  • FIG. 2 is a top view and a side view of the scaffold material used in the examples.
  • FIG. 3 is an optical microscope image of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) in the long axis direction.
  • FIG. 4 is an OCT image of a three-dimensional and cross-sectional portion of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of the tube diameter in the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1).
  • FIG. 1 is a schematic view showing a procedure for producing a three-dimensional intestinal tract model of the present invention.
  • FIG. 2 is a top view and a side view of the scaffold material used in the examples.
  • FIG. 3 is an optical microscope image of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) in the long axis direction.
  • FIG. 6 is a graph showing the time course of the height of the epithelial layer in the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1).
  • FIG. 7 shows a 3D image (top) and a maximum intensity projection (MIP) diagram (bottom) of EdU staining of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet model (Comparative Example) in the XY plane.
  • MIP maximum intensity projection
  • FIG. 8 is a graph of cell proliferation rate in EdU staining of a three-dimensional intestinal model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet model (Comparative Example).
  • FIG. 9 is a graph showing ⁇ 2 values in EdU staining of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet model (Comparative Example).
  • FIG. 10 shows the maximum intensity projection (MIP) image (top) in the XY plane and the maximum intensity projection (MIP) image in the XY plane in the phalloidin staining of the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and the two-dimensional sheet model (Comparative Example). It is a cross-sectional image (bottom).
  • FIG. 11 is a graph showing the positive ratio of the F-actin-stained region in the phalloidin staining of the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and the two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • FIG. 12 is a comparative graph showing the expression of each mRNA in the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and the two-dimensional sheet model (Comparative Example).
  • FIG. 11 is a graph showing the positive ratio of the F-actin-stained region in the phalloidin staining of the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and the two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • FIG. 13 is a TEM image of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • FIG. 14 is a graph showing cell height, aspect ratio, and microvilli occupancy in a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • FIG. 15 is a graph showing the distribution of the forestation rate of microvilli in the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and the two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • FIG. 16 is a graph showing the results of an ⁇ -lipoic acid absorption test in a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example).
  • the method for producing a three-dimensional intestinal tissue model of the present invention is a method for culturing and differentiating intestinal epithelial cells to obtain an intestinal tissue having a three-dimensional structure very close to that in the living body. It is characterized by including the following steps a) to c).
  • the intestinal tissue is preferably the intestinal tract. a) A step of preparing a scaffold made of a material having cell adhesion and having at least one lumen extending in the long axis direction; b) A step of seeding intestinal epithelial cells inside the lumen of the scaffold; and c) A step of three-dimensionally culturing the intestinal epithelial cells in the scaffold to obtain an intestinal tissue model.
  • Step a) is a step of preparing a scaffold (culture scaffold material) for culturing and differentiating intestinal epithelial cells in three dimensions.
  • the scaffold is made of a material having cell adhesion and is characterized by having at least one lumen extending in the long axis direction therein.
  • the cell-adhesive material constituting the scaffold natural and non-natural polymer materials can be typically used, and a biocompatible or biodegradable polymer material is preferable.
  • polymer materials include collagen, collagen derivatives, hyaluronic acid, chitosan, gelatin, fibroin, fibroin, polyalkylene glycol, polycarboxymethyl cellulose, polylactic acid, polyacrylamide, polycaprolactone, elastin, etc. Examples of known polymers and copolymers in. Any combination of these can also be used.
  • the material having cell adhesion is a gel using water as a solvent, that is, a hydrogel.
  • a hydrogel collagen gel, hyaluronic acid gel, fibrin gel, chitosan gel, gelatin gel, polyethylene glycol (PEG) gel, alginate gel, acrylamide gel derivative, or a combination thereof can be used. More preferably, it is a collagen gel or a hyaluronic acid gel.
  • the size and shape of the scaffold itself can be changed as appropriate according to the culture environment and applications such as device conversion, but typically, a cube having dimensions of several mm in length, width, and height. Or it can be a cube.
  • the lumen in the scaffold is a space for three-dimensionally forming an intestinal tissue model.
  • the shape of the lumen is preferably a straight line with a cylindrical cross section, but it can also be formed into various shapes depending on the application and the like. For example, it may be S-shaped curved or radial, and the cross section may be an ellipse, a semicircle, a rectangle, or the like.
  • the lumens can be more than one, in which case they are preferably present in parallel.
  • the lumen of the scaffold has a cylindrical cross section
  • its diameter can be in the range of 250 to 1000 ⁇ m, preferably 250 to 500 ⁇ m, and more preferably 250 to 350 ⁇ m.
  • the cross section of the lumen is not a perfect circle but a substantially circular shape, an ellipse, a semicircle, a rectangle, or the like, it is preferable that the lumen has the same size.
  • their sizes may be the same or different from each other.
  • the length of the lumen (length in the major axis direction) can be appropriately changed according to the size and shape of the scaffold described above, and is not particularly limited, but is typically in the range of 1 to 30 mm. It can be preferably in the range of 3 to 10 mm.
  • the lumen may have both ends penetrating in the long axis direction of the scaffold (penetrating type), and one end thereof may be closed in the scaffold (non-penetrating type). It may be.
  • the penetrating type for example, there is an advantage that a drug or the like to be tested can be supplied by a flow field at the time of functional evaluation after preparing a three-dimensional intestinal tissue model.
  • the non-penetrating type it is useful for imitating the appendix and evaluating the retention of drugs in the intestine.
  • the production method of the present invention can further include a step of producing a scaffold before the step a).
  • the scaffold can be produced, for example, by a step including the following steps (i) to (iv).
  • the present invention is not limited to this, and other manufacturing steps can be applied.
  • Step of adding a solution of a material having cell adhesion into a base material container (Ii) A step of inserting a rod-shaped member into the space in which the solution is stored; (Iii) A step of gelling the solution to form the scaffold; and (iv) removing the rod-shaped member after gelation to form at least one lumen extending in the longitudinal direction of the scaffold. Steps to make.
  • a scaffold is formed (gelled) in the presence of the rod-shaped member, and then the rod-shaped member is extracted to obtain the desired content. It is to form a cavity.
  • the types of the cell-adhesive material used in step (i) are as described above, and a gelable material is used.
  • a gelable material is used.
  • a solution containing collagen before gelation is used.
  • a scaffold of PEG gel a solution containing ungelled PEG is used.
  • any material known in the art can be used as long as it is a material capable of storing a solution containing a biogel or a cell, which will be described later.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA poly (methylmethacrylate) or poly (methylmethacrylate)
  • PMMA poly(methylmethacrylate)
  • Inorganic materials such as glass and quartz can also be used.
  • the rod-shaped member used in step (ii) can be appropriately selected according to the desired lumen size and shape, but typically, it is preferable to use a metal or plastic needle.
  • the material is not particularly limited as long as it is not reactive with the cell adhesive material in the solution.
  • the size of the cross section of the rod-shaped member defines the size of the lumen to be formed, it is possible to obtain a cavity of a desired size by adjusting the diameter and length of the rod-shaped member. Therefore, typically, the diameter of the rod-shaped member can be in the range of 250 to 1000 ⁇ m, preferably 250 to 500 ⁇ m, and more preferably 250 to 350 ⁇ m.
  • the cross section of the rod-shaped member can be not only a circular shape but also a semicircle, an ellipse, or a rectangle. Further, by using two or more rod-shaped members, two or more lumens can be formed.
  • Gelation in step (iii) can be performed by a method known in the art, depending on the type of cell adhesion material used.
  • collagen gel it can be gelled by allowing it to stand for a certain period of time under an appropriate temperature condition, or it can be gelled by a photopolymerization reaction using an appropriate cross-linking agent.
  • a polymer such as PEG
  • it can be gelled by forming an intermolecular crosslink with a photocrosslinker or a crosslinking agent.
  • the rod-shaped member in the step (iv) can be appropriately removed by physically pulling it out or the like. This makes it possible to obtain a scaffold having at least one lumen extending in the longitudinal direction.
  • the scaffold may be an embodiment in which a material having cell adhesion is supported in or on the base material.
  • a part of the inner surface of the lumen may be formed of a base material. That is, the lumen can be configured to be surrounded by a material having cell adhesion and a base material.
  • a part of the cavity surface can be used as a base material by installing the rod-shaped member so that a part of the rod-shaped member is in contact with the surface of the base material.
  • other cells different from the intestinal epithelial cells seeded in the lumen in the step b) described later may be encapsulated in the scaffold body portion outside the lumen.
  • examples of such other cells include immune cells, stromal cells, tumor cells and organoids.
  • Immune cells include, for example, T cells, B cells, macrophages, dendritic cells, lymphocytes, basophils, mast cells, eosinophils and the like.
  • Stromal cells include, for example, fibroblasts, vascular endothelial cells, vascular wall cells, vascular smooth muscle cells, lymphatic endothelial cells and the like.
  • Tumor cells include intestinal adenocarcinoma cells, enterosarcoma cells, carcinoid cancer cells, intestinal lymphoma cells and the like.
  • the scaffold can enclose immune cells or stromal cells.
  • step b) is a step of seeding intestinal epithelial cells inside the lumen of the scaffold.
  • Enterocytes can be isolated from various regions of the intestine, including the duodenum, jejunum, ileum, colon, rectum and rectum. Such enterocytes are preferably of human origin, but may also be of non-human mammals such as rats, mice, pigs, sheep, or primates.
  • cells capable of differentiating into intestinal epithelial cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent cells (iPS cells) can also be used.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent cells
  • organoid-derived cells composed of them can also be used.
  • the intestinal epithelial cell may be a primary epithelial cell derived from a healthy donor, or may be a primary epithelial cell derived from a donor suffering from any disease.
  • diseases include intestinal or colorectal cancer, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, hemorrhoids, diverticulitis, inflammatory bowel disease, microcolitis, lymphocytic colitis, collagenous colitis, endocrine. Includes disorders, metabolic disorders, obesity, diabetes, and dyslipidemia.
  • the enterocyte can be a cell line derived from a tumor of the colon, rectum and duodenum, more specifically Caco-2, HT-29, HT29-18N2, HuTu80, STC. It can be a cell line such as -1.
  • a Caco-2 cell line can be preferably used.
  • Dissemination of intestinal epithelial cells into the interior of the lumen can be performed by adding a solution (aqueous solution) containing the intestinal epithelial cells to the interior of the lumen of the scaffold.
  • a solution aqueous solution
  • the number of cells in the solution can be preferably 1x10 5 to 1x10 7 cells / ml, more preferably 1x10 6 to 5x10 6 cells / ml.
  • solutions known in the art can be used.
  • a step of coating the inner surface of the scaffold lumen with a cell adhesive molecule is further included before step b).
  • a cell adhesive molecule for such coating include extracellular matrix, extracellular matrix-like molecule, and polyamine.
  • the extracellular matrix contains laminin, fibronectin, or a combination thereof.
  • the coating step can be performed by adding a solution containing cell adhesion molecules into the lumen of the scaffold.
  • step c) is a step of obtaining a target intestinal tissue model by three-dimensionally culturing the intestinal epithelial cells seeded in the above step b).
  • the culture can be carried out by allowing the cells to stand in a suitable cell culture medium for a certain period of time.
  • a medium for culturing animal tissues commonly used in the art can be used, and examples thereof include FBS-containing EMEM and DMEM, intestinal epithelial-like adjustment medium, and chemical-defined medium. ..
  • the culture period depends on the size and type of the desired tissue model, but is typically in the range of 4 to 24 days, preferably in the range of 7 to 21 days.
  • other cells different from the above intestinal epithelial cells can also be encapsulated in the scaffold body portion outside the lumen, in which case the enterocytes inside the lumen and other cells outside. Can be co-cultured.
  • the intestinal tissue model obtained by the above-mentioned production method has a feature that cannot be achieved by the conventional method of having a three-dimensional structure very close to that in the living body. Therefore, the present invention also relates to a three-dimensional intestinal tissue model formed in the lumen of the scaffold material obtained by the above-mentioned fabrication method.
  • the three-dimensional intestinal tissue model of the present invention is preferably a model of the intestinal tract.
  • the intestinal tract model has a three-dimensional structure with epithelial tissue and tight junctions, and in particular, has a microvilli structure and a protrusion structure similar to the structure in the living body, and is different from the conventional two-dimensional sheet-like tissue model. Is different.
  • the occupancy of epithelial cells in the lumen is preferably 50% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 99 to 100%. .. If the cell occupancy rate is lower than the applicable range, the drug in the lumen leaks to the scaffold side, which not only makes it impossible to perform an appropriate evaluation, but also makes it difficult to obtain a microvilli structure similar to that of a living body.
  • the microvilli are preferably forested in the vertical direction, for example, at an angle of 75 to 90 degrees with respect to the scaffold surface.
  • the thickness of the intestinal epithelial tissue formed is preferably 5 to 20 ⁇ m on average.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the function of the intestinal tissue model using the above three-dimensional intestinal tissue model.
  • the evaluation method can include supplying a compound into the lumen of the scaffold material and observing the behavioral changes of the intestinal tissue model due to the compound in real time. As a result, it is possible to observe the action of drug absorption only from the lumen side like the intestinal tract in the living body, the barrier function of the intestinal tract against toxic substances, and the like, and it is possible to perform an analysis imitating actual oral ingestion.
  • Examples of means for observing changes in the behavior of the intestinal tissue model include optical measuring means such as a confocal laser scanning microscope and a fluorescence microscope, and chemical measuring means such as HPLC and mass spectrometry.
  • the interaction analysis method include optical measuring means such as a confocal laser scanning microscope and a fluorescence microscope, and biological means such as a quantitative RT-PCR method and a western blot method.
  • the compound can be supplied to a portion other than the lumen of the scaffold. This makes it possible to analyze the effects of drugs on the parenchyma of the intestinal tract.
  • the invention also provides, in another aspect, a device that includes a three-dimensional intestinal tissue model.
  • the present invention also relates to the scaffold material itself for culturing intestinal epithelial cells to make a three-dimensional intestinal tissue model.
  • the details of the scaffold material the matters already described in the above description of the manufacturing method are applied as they are.
  • Test Example 1 2.4 mg / ml collagen solution (manufactured by Nitta Gelatin) in a base container made of polydimethylsiloxane (PDMS) having a size of about 25 mm x about 25 mm (inner size: about 2 mm x 3 mm x 5.5 mm).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • a needle having a diameter of 300 ⁇ m was inserted into the base material container and left for 90 minutes in an environment of 37 ° C. to gel. Then, the needle was pulled out horizontally to obtain a scaffold material.
  • a top view and a side view of the obtained scaffold material are shown in FIG.
  • OCT optical interference tomography
  • TEM transmission electron microscopy
  • OCT image analysis test example 1 was structurally analyzed by an optical microscope and optical coherence tomography (OCT).
  • OCT optical coherence tomography
  • Comparative Examples are on a filter membrane insert 12well fibronectin-coated, and seeded at 1 ⁇ 10 5 cells per membrane (so that the confluent seeding), and cultured same period.
  • FIG. 3 shows images in the long axis direction of the three-dimensional intestinal tract model for each culture period of 4 to 16 days.
  • FIG. 4 is a three-dimensional image and a cross-sectional image of a three-dimensional intestinal tract model and a two-dimensional sheet-shaped model.
  • FIGS. 5 and 6 The changes over time in the tube diameter and epithelial layer height of the intestinal model obtained from these images are shown in FIGS. 5 and 6, respectively.
  • the height of the epithelial layer was higher in the three-dimensional intestinal tract model than in the two-dimensional sheet model, and a columnar epithelium was formed.
  • the deviation of the epithelial layer increased from the 12th day of culture and the epithelial layer thickened on the 16th day, it was found that the three-dimensional structure of the epithelium began to form on the 12th day and the epithelial layer undulated on the 16th day. rice field.
  • the image was divided into 9 sub-areas, EdU-positive cells were counted in the sub-areas, and the value of ⁇ 2 was calculated using the following formula.
  • the p-value was calculated directly using the value of ⁇ 2 using the ⁇ 2 test.
  • ⁇ 2 indicates that the larger the value, the more locally distributed the proliferating cells.
  • FIG. 7 A 3D image of the obtained EdU staining in the XY plane and a maximum intensity projection (MIP) diagram are shown in FIG. 7 (nuclear scale bar: 50 ⁇ m).
  • the cell proliferation rate in the three-dimensional intestinal model was about 7 times higher than that in the two-dimensional sheet model (Fig. 8).
  • the value of ⁇ 2 was larger than that in the two-dimensional sheet model, and it was confirmed that cell proliferation was significantly localized (FIG. 9).
  • the cell proliferation site is localized at the root of the process structure, and these results show that the three-dimensional intestinal model has an intestinal epithelium with properties closer to those in vivo. It shows that.
  • MIP maximum intensity projection
  • the obtained maximum intensity projection (MIP) image on the XY plane and the cross-sectional image on the XY plane are shown in FIG. 10 (scale bar: 50 ⁇ m).
  • the area ratio of the F-actin stained region is shown in FIG.
  • the expression of actin fibers was significantly higher than that in the 2D sheet model, and after culturing for 16 days, it was completely detected mainly on the basal side of epithelial cells. This suggests that the intestinal epithelial cells spontaneously pull the gel of the scaffold and influence the physical characteristics of the gel to prepare the environment.
  • FIG. 12 shows the results of examining the expression of differentiation markers of various intestinal epithelial cells.
  • the localization of protein expression of the absorptive epithelial cell marker virgin was confirmed on the cell surface throughout the epithelium, and the expression of virgin 1 (VIL1) mRNA was not different between the two-dimensional and three-dimensional intestinal models.
  • the Paneth cell marker lysozyme was predominantly expressed in the lower zones of the 2D and 3D models, and lysozyme (LYZ) mRNA expression in the 3D intestinal model was higher than in the 2D intestinal model.
  • Mucin 2 (MUC2) mRNA expression a mucosal secretory cell marker, did not differ between 2D and 3D models.
  • TEM image analysis Next, a transmission electron microscope (TEM) was used to evaluate finer structures such as microvilli.
  • FIG. 13 shows TEM images of a three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1) and a two-dimensional sheet-shaped model (Comparative Example) on the 4th and 16th days of culture.
  • Test Example 1 On the 16th day of culture in the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1), it was confirmed that many microvilli were formed and the plants were standing in the vertical direction as in the living body. It was also confirmed from the TEM image that the formation of tight junctions was started from the 4th day of culture in the three-dimensional intestinal tract model (Test Example 1).
  • the three-dimensional intestinal tract model is a tissue model closer to the living body in cell cubicization (thickness) and formation of microvilli structure as compared with the two-dimensional sheet model.
  • the graph shows that the smaller the difference from 90 °, the closer to the vertical the forest.
  • the three-dimensional intestinal tract model had a forest of microvilli in the vertical direction as compared with the two-dimensional sheet-shaped model.
  • the microvilli were at random angles regardless of the number of culture days.
  • ⁇ -Lipoic acid absorption test Using a three-dimensional intestinal model (Test Example 1), an ⁇ -lipoic acid absorption test was performed. Sodium azide was used as an inhibitor of active transport. As a comparative example, a two-dimensional sheet model was used.
  • the specific test procedure is as follows.
  • the three-dimensional intestinal model was washed with HBSS buffer (pH 6.0) at 37 ° C. for 30 minutes, 0.5 mM ⁇ -lipoic acid solution (10 ⁇ L) was added intracavitarily, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. ..
  • 10 mM sodium azide was added to the ⁇ -lipoic acid solution at the same time. It was confirmed that there was no simple leakage of the substance by adding 10 ⁇ L of a 4 kDa dextran solution to which a fluorescent substance was bound to the lumen side, and after washing with HBSS buffer (pH 6.0), the entire sample was collected. bottom.
  • the permeation amount of the amount of ⁇ -lipoic acid was calculated per unit area of epithelial tissue when the three-dimensional intestinal tract model had a simple vascular structure and the two-dimensional sheet-like model had a sheet. The obtained results are shown in FIG.
  • the three-dimensional intestinal model forms an epithelial structure that does not passively permeate on the scaffold side, and absorbs by higher active transport than the two-dimensional sheet model. Therefore, it was suggested that the three-dimensional intestinal model can be used as a system with higher absorption efficiency.
  • Inflammation evaluation system Macrophage-like cells derived by PMA treatment of THP1 which is a monocyte lineage cell were stained with a cell tracker in a collagen gel of a three-dimensional intestinal tract model, and encapsulated and cultured. Sixteen days later, when macrophages were observed with a confocal laser scanning microscope, their migration and morphological changes could be observed. From this, it is possible to analyze as a model imitating intestinal inflammation by observing the dynamics of macrophages that change with the addition of a drug or toxic substance.

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Abstract

【課題】　３次元の管状構造を有し、生体内の環境を反映した薬剤の吸収試験等が可能な腸組織モデル、及びそのより簡便な作製方法を提供することを課題とする。 【解決手段】　３次元腸組織モデルの作製方法であって、ａ）細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有するスキャフォールドを用意する工程；ｂ）前記スキャフォールドの前記内腔の内部に、腸上皮細胞を播種する工程；及びｃ）前記スキャフォールド内で前記腸上皮細胞を３次元培養し、腸組織モデルを得る工程を含む、該作製方法。

Description

３次元腸組織モデルの作製方法
　本発明は、３次元腸組織モデルの作製方法に関する。また、当該作製方法により得られる３次元腸組織モデル、及び当該作製方法に好適なスキャフォールド材料にも関する。
　腸は、経口投与された薬剤の吸収や代謝において重要な役割を果たしており、また、ある種の疾患は腸内の免疫系と関連性があることが知られている。従来、薬剤の腸管への影響を調べる際には、ヒト結腸癌由来のＣａｃｏ－２細胞を用いた平面２次元（２Ｄ）培養系が一般的であり、腸管を模倣した人工モデルを用いる場合でもその構造はシート状であった（例えば、非特許文献１）。その為、上皮細胞以外の他種細胞と共培養を行うことが容易ではなく、特に免疫細胞を用いる場合は３次元的な移動の影響を調べなければならないことから、現状の実験系では不可能であった。
　また、生体内においては腸管の形状は管状かつ微絨毛を有しているため、物質の吸収効率を調べる上でも、従来のような２次元シート状の構造を有する腸組織モデルは、十分に生体内を反映したものといえなかった。一方で、一般に、生体組織モデルの３次元培養は、操作や培養条件の設定が煩雑であり、灌流等の動力を付加する必要がある等、簡便性に欠けるという課題があった。そのため、簡便な手法で作製でき、薬剤の吸収試験が可能な３次元腸組織モデルのチップ（ｇｕｔ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）が求められている。
Artursson and Karlsson. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem Biophys Res Commun. 1991;175:880-885.
　そこで、本発明は、３次元の管状構造を有し、生体内の環境を反映した薬剤の吸収試験等が可能な腸組織モデル、及びそのより簡便な作製方法を提供することを課題とするものである。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、細胞接着性を有するスキャフォールド（足場材料）に内腔を形成し、当該内腔内に腸上皮細胞を播種し培養することで、生体内の構造に極めて近い微絨毛及びタイトジャンクション構造を有する３次元腸組織モデルが簡便な手法により得られることを見出した。また、かかる３次元腸組織モデルを用いることで、生体内の腸管のように内腔側のみからの薬剤吸収の作用等を観測できるという、従来は困難であった機能評価が可能であることも併せて見出した。これらの知見により本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、３次元腸組織モデルの作製方法に関し、より具体的には、
＜１＞３次元腸組織モデルの作製方法であって、ａ）細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有するスキャフォールドを用意する工程；ｂ）前記スキャフォールドの前記内腔の内部に、腸上皮細胞を播種する工程；及びｃ）前記スキャフォールド内で前記腸上皮細胞を３次元培養し、腸組織モデルを得る工程を含む、該作製方法；
＜２＞前記腸組織が、腸管である、上記＜１＞に記載の作製方法；
＜３＞前記細胞接着性を有する材料が、ハイドロゲルである、上記＜１＞又は＜２＞に記載の作製方法；
＜４＞前記ハイドロゲルが、コラーゲンゲル又はヒアルロン酸ゲルである、上記＜３＞に記載の作製方法；
＜５＞前記内腔が、直径２５０～１０００μｍの範囲の円筒状断面を有する、上記＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載の作製方法；
＜６＞前記内腔が、前記スキャフォールドを貫通している、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載の作製方法；
＜７＞前記工程ｂ）の前に、前記スキャフォールドの前記内腔の内表面を、細胞接着性分子で被覆する工程をさらに含む、上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載の作製方法；
＜８＞前記細胞接着性分子が、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス様分子、又はポリアミンである、上記＜７＞に記載の作製方法；
＜９＞前記細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、又はそれらの組み合わせである、上記＜８＞に記載の作製方法；
＜１０＞前記工程ｂ）が、１ｘ１０５～１ｘ１０７個／ｍｌの腸上皮細胞を含む溶液を前記スキャフォールドの前記内腔の内部に添加することを含む、上記＜１＞～＜９＞のいずれか１に記載の作製方法；
＜１１＞以下のステップを含む前記スキャフォールドを作製する工程をさらに含む、上記＜１＞に記載の作製方法：基材容器内に細胞接着性を有する材料の溶液を添加するステップ；前記溶液が格納された空間に棒状部材を挿入するステップ；前記溶液中をゲル化させ前記スキャフォールドを形成させるステップ；ゲル化後に前記棒状部材を除去し、前記スキャフォールドの長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を形成させるステップ；
＜１２＞前記内腔の内表面の一部が、基材容器により形成されている、上記＜１１＞に記載の作製方法；
＜１３＞前記スキャフォールドが、前記腸上皮細胞以外の細胞を内包する、上記＜１＞～＜１２＞のいずれか１に記載の作製方法；及び
＜１４＞前記スキャフォールドが、免疫細胞又は間質細胞を内包する、上記＜１＞～＜１２＞のいずれか１に記載の作製方法
を提供するものである。
　本発明は、別の態様において、３次元腸組織モデルの作製に好適なスキャフォールド材料を対象とするものでもあり、より具体的には、
＜１５＞腸上皮細胞を培養して３次元腸組織モデルを作製するためのスキャフォールド材料であって、細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有する、該スキャフォールド材料；
＜１６＞前記細胞接着性を有する材料が、ハイドロゲルである、上記＜１５＞に記載のスキャフォールド材料；
＜１７＞前記ハイドロゲルが、コラーゲンゲル又はヒアルロン酸ゲルである、上記＜１６＞に記載のスキャフォールド材料；
＜１８＞前記内腔が、直径２５０～１０００μｍの範囲の円筒状断面を有する、上記＜１５＞～＜１７＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料；
＜１９＞前記内腔が、前記スキャフォールドを貫通している、上記＜１５＞～＜１８＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料；
＜２０＞前記内腔の内表面が細胞接着性分子で被覆されている、上記＜１５＞～＜１９＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料；
＜２１＞前記細胞接着性分子が、細胞外マトリクス又はポリアミンである、上記＜２０＞に記載のスキャフォールド材料；
＜２２＞前記細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、又はそれらの組み合わせである、上記＜２１＞に記載のスキャフォールド材料；
＜２３＞前記腸上皮細胞以外の細胞を内包する、上記＜１５＞～＜２２＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料；
＜２４＞免疫細胞又は間質細胞を内包する、上記＜１５＞～＜２３＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料；
＜２５＞基材内又は基材上に担持されている、上記＜１５＞～＜２４＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料；及び
＜２６＞前記内腔の内表面の一部が、前記基材により形成されている、上記＜２５＞に記載のスキャフォールド材料
を提供するものである。
　本発明は、さらなる態様において、３次元腸組織モデル及びその機能評価方法等を対象とするものでもあり、より具体的には、
＜２７＞上記＜１５＞～＜２６＞のいずれか１に記載のスキャフォールド材料の内腔内に形成されている３次元腸組織モデル；
＜２８＞絨毛様構造を有する腸管モデルである、上記＜２７＞に記載の３次元腸組織モデル；
＜２９＞前記内腔内における上皮細胞の占有率が５０％以上である、上記＜２８＞に記載の３次元腸組織モデル；
＜３０＞上記＜２７＞～＜２９＞のいずれか１に記載の３次元腸組織モデルを含むデバイス；
＜３１＞上記＜２７＞～＜２９＞のいずれか１に記載の３次元腸組織モデルを用いて、当該腸組織モデルの機能を評価する方法；
＜３２＞前記スキャフォールド材料の内腔内に化合物を供給し、当該化合物による腸組織モデルの挙動変化をリアルタイムで観測することを含む、上記＜３１＞に記載の方法；及び
＜３３＞前記スキャフォールド材料の前記内腔以外の部分に化合物を供給することを含む、上記＜３２＞に記載の方法
を提供するものである。
　本発明によれば、生体内の構造に極めて近い微絨毛を誘導した３次元腸組織モデルを簡便な手法により構築することができる。特に、動力を必要とせず、腸上皮細胞を管状に培養するのみで絨毛様構造を誘導できる点で、従来の手法では達成できなかった優れた効果を奏するものである。
　また、かかる３次元腸組織モデルを用いることで、生体内の腸管のように内腔側のみからの薬剤吸収の作用等を観測でき、実際の経口摂取を模倣した解析を行うことができる。スキャフォールド中に間質細胞や免疫細胞を内包させることで簡便に共培養系とすることも可能であり、これらの細胞が腸組織モデルに対してどのような挙動を示すのかを立体的に観測可能である。当該３次元腸組織モデルを用いたデバイスにより、ハイスループットな解析系を構築することも可能となる。
図１は、本発明の３次元腸管モデルの作製手順を示す概略図である。 図２は、実施例で用いたスキャフォールド材料の上面図と側面図である。 図３は、３次元腸管モデル（試験例１）の長軸方向における光学顕微鏡画像である。 図４は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）の３次元及び断面部のＯＣＴ画像である。 図５は、３次元腸管モデル（試験例１）における管径の経時変化を示すグラフである。 図６は、３次元腸管モデル（試験例１）における上皮層高さの経時変化を示すグラフである。 図７は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のＥｄＵ染色のＸ-Ｙ平面での３Ｄ画像（上）および最大強度投影（ＭＩＰ）図（下）である。 図８は、図１１は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のＥｄＵ染色における細胞増殖率のグラフである。 図９は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のＥｄＵ染色におけるχ２値を示すグラフである。 図１０は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のファロイジン染色におけるＸ-Ｙ平面での最大強度投影（ＭＩＰ）画像（上）およびＸ-Ｚ平面での断面画像（下）である。 図１１は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のファロイジン染色におけるＦ－アクチン染色領域の陽性割合を示すグラフである。 図１２は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）における各ｍＲＮＡの発現を示す比較グラフである。 図１３は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のＴＥＭ画像である。 図１４は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）における細胞高さ、アスペクト比、及び微絨毛占有率を示すグラフである。 図１５は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）における微絨毛の林立率の分布を示すグラフである。 図１６は、３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）におけるα－リポ酸の吸収試験の結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
１．３次元腸組織モデルの作製方法
　本発明の３次元腸組織モデルの作製方法は、腸上皮細胞を培養・分化させて生体内に極めて近い３次元構造を有する腸組織を得るための方法であって、以下のａ）～ｃ）の各工程を含むことを特徴とする。ここで、腸組織は、好ましくは腸管である。
ａ）細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有するスキャフォールドを用意する工程；
ｂ）前記スキャフォールドの前記内腔の内部に、腸上皮細胞を播種する工程；及び
ｃ）前記スキャフォールド内で前記腸上皮細胞を３次元培養し、腸組織モデルを得る工程。
　以下、ａ）～ｃ）の各工程について説明する。
　工程ａ）は、腸上皮細胞を３次元で培養・分化させるためのスキャフォールド（培養足場材料）を用意する工程である。当該スキャフォールドは、細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔をその内部に有することを特徴とする。
　スキャフォールドを構成する細胞接着性を有する材料は、典型的には、天然及び非天然の高分子材料を用いることができ、好ましくは、生体適合性又は生分解性を有する高分子材料である。かかる高分子材料の例としては、コラーゲン、コラーゲン誘導体、ヒアルロン酸、キトサン、ゼラチン、フィブリン、フィブロイン、ポリアルキレングリコール、ポリカルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリアクリルアミド、ポリカプロラクトン、エラスチン等、その他、当該技術分野において公知のポリマー及びコポリマーを挙げることができる。これらの任意の組み合わせを用いることもできる。
　好ましくは、細胞接着性を有する材料は、水を溶媒とするゲル、すなわちハイドロゲルである。かかるハイドロゲルとしては、コラーゲンゲル、ヒアルロン酸ゲル、フィブリンゲル、キトサンゲル、ゼラチンゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ゲル、アルギン酸ゲル、アクリルアミドゲル誘導体、又はこれらの組み合わせを用いることができる。より好ましくは、コラーゲンゲル又はヒアルロン酸ゲルである。
　スキャフォールド自体のサイズ及び形状は、培養環境やデバイス化等の用途に応じて適宜変更することができるが、典型的には、縦・横・高さが、いずれも数ｍｍの寸法を有する直方体又は立方体であることができる。
　スキャフォールドにおける内腔は、３次元的に腸組織モデルを形成させるための空間である。当該内腔の形状は、円筒状断面の直線であることが好ましいが、その用途等に応じて様々の形状に形成することも可能である。例えば、Ｓ字状の湾曲や放射状等とすることもでき、断面を楕円、半円、矩形等とすることもできる。内腔は、２以上の複数であることができ、その場合は、それらが並行して存在していることが好ましい。
　スキャフォールドの内腔が円筒状断面の場合、その直径は２５０～１０００μｍの範囲、好ましくは、２５０～５００μｍ、より好ましくは、２５０～３５０μｍの範囲であることができる。内腔の断面が、完全な円形ではなく、略円形、楕円、半円、矩形等の場合においても、同様のサイズの内腔となることが好ましい。また、内腔が２以上存在する場合は、それらサイズ（直径）は、同一であってもよいし、それぞれ異なるものであってもよい。
　当該内腔の長さ（長軸方向の長さ）は、上述のスキャフォールドのサイズや形状等に応じて適宜変更することができ、特に限定されないが、典型的には、１～３０ｍｍの範囲、好ましくは３～１０ｍｍの範囲であることができる。また、内腔は、その両端がスキャフォールドの長軸方向に貫通している態様（貫通型）であってもよく、一方の端部がスキャフォールド内で閉鎖されている態様（非貫通型）であってもよい。貫通型の場合には、例えば、３次元腸組織モデルを作製後の機能評価の際に、試験対象となる薬剤等を流れ場によって供給することができる等の利点がある。非貫通型の場合には、虫垂の模倣や、薬物等の腸内での滞留を評価する場合に有用である。
　好ましい態様において、本発明の作製方法は、工程ａ）の前に、スキャフォールドを作製する工程をさらに含むことができる。当該スキャフォールドは、例えば、以下に示すステップ（ｉ）～（ｉｖ）を含む工程により作製することができる。ただし、必ずしもこれに限られるものではなく、他の作製工程を適用することも可能である。
（ｉ）基材容器内に細胞接着性を有する材料の溶液を添加するステップ；
（ｉｉ）前記溶液が格納された空間に棒状部材を挿入するステップ；
（ｉｉｉ）前記溶液中をゲル化させ前記スキャフォールドを形成させるステップ；及び
（ｉｖ）ゲル化後に前記棒状部材を除去し、前記スキャフォールドの長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を形成させるステップ。
　当該工程は、要するに、適切なサイズを有する棒状部材をテンプレートとして用いて、当該棒状部材が存在する状態でスキャフォールドを形成（ゲル化）させ、その後に、棒状部材を抜き取ることにより、所望の内腔を形成させるというものである。
　ここで、ステップ（ｉ）で用いられる細胞接着性を有する材料の種類等は、上述のとおりであり、ゲル化可能な材料が用いられる。例えば、コラーゲンゲルのスキャフォールドを得る場合には、ゲル化前のコラーゲンを含む溶液を用いる。また、ＰＥＧゲルのスキャフォールドを得る場合には、未ゲル化のＰＥＧを含む溶液を用いる。
　基材容器としては、後述の生体ゲルや細胞を含む溶液を格納し得る材料であれば当該技術分野において公知のものを用いることができるが、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）やポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）等の光学的に透明でありかつ生体適合性を有する高分子材料であることが好ましい。ガラスや石英の無機材料を用いることもできる。
　ステップ（ｉｉ）で用いる棒状部材は、所望の内腔サイズや形状に合わせて適宜選択することができるが、典型的には、金属製やプラスチック製のニードルを用いることが好適である。溶液中の細胞接着性材料に対する反応性がないものであれば、その材料は特に限定されない。
　当該棒状部材の断面の大きさが、形成される内腔サイズを規定することになるため、棒状部材の直径や長さを調整することで、所望のサイズの内腔を得ることができる。したがって、典型的には、棒状部材の直径は２５０～１０００μｍの範囲、好ましくは、２５０～５００μｍ、より好ましくは、２５０～３５０μｍの範囲であることができる。ここで、棒状部材の断面は、円型だけでなく、半円や楕円、矩形とすることもできる。また、２つ以上の棒状部材を用いることにより、２以上の内腔を形成させることができる。
　ステップ（ｉｉｉ）におけるゲル化は、用いる細胞接着性材料の種類に応じて、当該技術分野における公知の手法により行うことができる。例えば、コラーゲンゲルの場合には、適切な温度条件下で一定時間静置することによりゲル化させることができるし、或いは、適切な架橋剤を用いる光重合化反応によりゲル化させることもできる。ヒアルロン酸ゲルについても同様である。また、ＰＥＧ等のポリマーを用いる場合には、光架橋や架橋剤により分子間架橋を形成させることでゲル化させることができる。
　ステップ（ｉｖ）における棒状部材の除去は、物理的に引き抜く等によって適宜行うことができる。これにより長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有するスキャフォールドを得ることができる。
　スキャフォールドのバリエーションの例として、基材内又は基材上に細胞接着性を有する材料を担持した態様のスキャフォールドとしてもよい。この場合、内腔の内表面の一部は、基材により形成されていてもよい。すなわち、内腔が、細胞接着性を有する材料と基材に囲まれて構成されることができる。例えば、上記ステップ（ｉｉ）において棒状部材を挿入する際に、棒状部材の一部が基材表面に接するように設置することで、内腔表面の一部を基材することができる。
　また、スキャフォールドの別のバリエーションの例として、後述の工程ｂ）において内腔内に播種される腸上皮細胞とは異なる他の細胞を、内腔の外側のスキャフォールド本体部分に内包させることもできる。そのような他の細胞の例としては、免疫細胞や間質細胞、腫瘍細胞、オルガノイドを挙げることができる。免疫細胞には、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、好塩基球、肥満細胞、好酸球などが含まれる。間質細胞には、例えば、線維芽細胞、血管内皮細胞、血管壁細胞、血管平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞などが含まれる。腫瘍細胞には、腸腺癌細胞、腸肉腫細胞、カルチノイド癌細胞、腸リンパ腫細胞などが含まれる。好ましくは、スキャフォールドは、免疫細胞又は間質細胞を内包することができる。
　次いで、工程ｂ）は、上記スキャフォールドの内腔の内部に、腸上皮細胞を播種する工程である。腸上皮細胞は、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸および直腸を含む腸の様々な領域から単離することができる。かかる腸上皮細胞は、ヒト由来のものであることが好ましいが、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、又は霊長類動物などの非ヒト哺乳動物に由来するものであってもよい。場合によっては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）などの腸上皮細胞に分化し得る細胞を用いることもできる。また、それらより構成されたオルガノイド由来の細胞も用いることもできる。
　また、腸上皮細胞は、健康なドナー由来の初代上皮細胞であってもよいし、何らの疾患に罹患したドナー由来の初代上皮細胞であってもよい。そのような疾患には、腸または結腸直腸癌、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核、憩室炎、炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、内分泌障害、代謝障害、肥満、糖尿病、脂質異常症が含まれる。
　代表的な態様では、腸上皮細胞は、結腸、直腸および十二指腸の腫瘍に由来する細胞株であることができ、より具体的には、Ｃａｃｏ－２、ＨＴ－２９、ＨＴ２９－１８Ｎ２、ＨｕＴｕ８０、ＳＴＣ－１等の細胞株であることができる。腸管吸収の挙動を観測する目的の場合には、好ましくは、Ｃａｃｏ－２細胞株を用いることができる。
　内腔の内部への腸上皮細胞の播種は、腸上皮細胞を含む溶液（水溶液）を前記スキャフォールドの前記内腔の内部に添加することにより実行することができる。その際、溶液中の細胞数は、好ましくは、１ｘ１０５～１ｘ１０７個／ｍｌ、より好ましくは、１ｘ１０６～５ｘ１０６個／ｍｌであことができる。その他の溶液条件等については、当該技術分野において公知の条件を用いることができる。
　好ましい態様では、工程ｂ）の前に、スキャフォールドの内腔の内表面を、細胞接着性分子で被覆する工程をさらに含む。これにより、腸上皮細胞の初期接着の亢進、均一な定着を向上させることができ、内腔内に腸上皮細胞を高密度で播種することを促進する。かかる被覆用の細胞接着性分子としては、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス様分子、又はポリアミンを挙げることができる。細胞外マトリクスには、ラミニン、フィブロネクチン、又はそれらの組み合わせが含まれる。当該被覆工程は、細胞接着性分子を含む溶液をスキャフォールドの内腔内に添加することにより行うことができる。
　次いで、工程ｃ）は、上記工程ｂ）で播種した腸上皮細胞を３次元的に培養することで目的とする腸組織モデルを得る工程である。当該培養は、適切な細胞培養培地中で一定期間静置することで行うことができる。
　培養に用いる培地は、当該技術分野において慣用される動物組織培養用の培地を用いることができ、例えば、ＦＢＳ含有のＥＭＥＭやＤＭＥＭ、腸上皮様の調整培地やケミカルディファインド培地を挙げることができる。また、培養期間は、所望とする組織モデルの大きさや種類に依存するが、典型的には、４～２４日の範囲、好ましくは、７～２１日の範囲である。
　上述のように、上記腸上皮細胞とは異なる他の細胞を内腔の外側のスキャフォールド本体部分に内包させることもでき、この場合は、内腔内側の腸上皮細胞と、外側の他の細胞を共培養することができる。
２．３次元腸組織モデル
　上述の作製方法によって得られる腸組織モデルは、生体内に極めて近い３次元構造を有するという従来の手法では達成できなかった特徴を有するものである。したがって、本発明は、上述の作製方法によって得られる、スキャフォールド材料の内腔内に形成されている３次元腸組織モデルにも関する。
　本発明の３次元腸組織モデルは、好ましくは、腸管のモデルである。腸管モデルは、上皮組織及びタイトジャンクションを有する立体的構造を有しており、特に、生体内の構造に類似する微絨毛構造と突起構造を有する点で、従来の２次元のシート状組織モデルとは異なるものである。
　本発明の３次元腸組織モデルは、好ましくは、内腔内における上皮細胞の占有率が５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９９～１００％である。細胞占有率がかかる範囲を下回る場合には、内腔内の薬剤等がスキャフォールド側に漏出してしまい適切な評価ができないだけでなく、生体に近い微絨毛構造等も得られ難くなるまた、当該微絨毛は垂直方向に林立していることが好ましく、例えば、スキャフォールド面に対して７５～９０度の角度であることができる。また、形成される腸上皮組織の厚さは、好ましくは、平均で５～２０μｍである。
３．３次元腸組織モデルを用いる評価方法等
　本発明は、また、上記３次元腸組織モデルを用いて、当該腸組織モデルの機能を評価する方法にも関する。当該評価方法は、スキャフォールド材料の内腔内に化合物を供給し、当該化合物による腸組織モデルの挙動変化をリアルタイムで観測することを含むことができる。これにより、生体内の腸管のように内腔側のみからの薬剤吸収の作用や、毒物に対する腸管のバリア機能等を観測でき、実際の経口摂取を模倣した解析を行うことができる。
　当該腸組織モデルの挙動変化を観測する手段としては、共焦点レーザー顕微鏡や蛍光顕微鏡などの光学的測定手段や、HPLCや質量分析などの化学的測定手段を挙げることができる。
　また、上述のように、内腔の外側のスキャフォールド本体部分に、免疫細胞や間質細胞のような腸上皮細胞以外の細胞を内包させることもできるため、腸における上皮組織と間質組織または免疫系との相互作用を好適に解析することも可能となる。相互作用の解析手法には、共焦点レーザー顕微鏡や蛍光顕微鏡などの光学的測定手段や、定量的RT-PCR法やウェスタンブロット法などの生物学的手段を上げることができる。
　好ましい態様では、スキャフォールドの内腔以外の部分に化合物を供給することもできる。これにより、腸管の実質部における薬剤の影響等についても解析することができる。
　このように、上記３次元腸組織モデルを用いることで、薬理効果を有する低分子化合物の同定等の用途に適用可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸モデルチップ（ｇｕｔ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）を構築することができるため、本発明は、別の側面において、３次元腸組織モデルを含むデバイスを提供するものでもある。
４．スキャフォールド材料
　上述のように、細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有するスキャフォールド材料を用いることにより、簡便に３次元構造を有する腸組織モデルを作製することができるものであるため、本発明は、さらに、腸上皮細胞を培養して３次元腸組織モデルを作製するためのスキャフォールド材料自体にも関する。当該スキャフォールド材料の詳細については、上述の作製方法の説明において既に述べた事項がそのまま適用される。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
１．３次元腸組織モデルの作製
　以下の手順により、スキャフォールド内に腸管モデルを作製した。作製手順の概略を図１に示す。
（試験例１）
　約２５ｍｍ×約２５ｍｍの寸法を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製の基材容器（内寸：２ｍｍ×３ｍｍ×５．５ｍｍ程度）に、２．４ｍｇ/ｍｌのコラーゲン溶液（新田ゼラチン社製）を添加した。基材容器内に直径３００μｍのニードルを挿入し、３７℃環境下で９０分放置しゲル化させた。その後、ニードルを水平に抜き、スキャフォールド材料を得た。得られたスキャフォールド材料の上面図と側面図を図２に示す。
　形成された内腔内に１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン溶液をコーティングし、その後に、ヒト結腸癌由来の上皮細胞であるＣａｃｏ－２細胞株（４ｘ１０６細胞／ｍｌ）を内腔内に播種し、内腔全面を覆った。２日間培養することにより、３次元腸管組織が形成されていることを確認した。後述のように、腸上皮タイトジャンクションの形成及び腸上皮形態の形成を光干渉断層撮影（ＯＣＴ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像により観測した。
（試験例２～４）
　また、ニードルの直径、細胞密度、内腔コーティング材料を変えた以下の表に示す条件でも、同様に培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、コート剤としてラミニンを用いた場合も同様に３次元腸管組織が形成されることを確認した。一方、ニードルの直径を２００μｍとしたものでは、８日間程度の培養期間で３次元腸管組織が形成された。
２．ＯＣＴ画像解析
　試験例１で得られた３次元腸管モデルについて、光学顕微鏡と光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により構造解析を行った。比較例として、腸上皮細胞を２次元シート状に培養して得られたモデルとの対比を行った。比較例は、フィブロネクチンコートした１２ｗｅｌｌのインサートのフィルターメンブレン上に、１メンブレンあたり１×１０５cells　で播種（コンフルエントになるよう播種）して、同様の期間培養した。
　得られた光学顕微鏡画像を図３に、ＯＣＴ画像を図４に示す。図３は、３次元腸管モデルの長軸方向における画像を、４～１６日の培養期間ごとに示したものである。図４は、３次元腸管モデル及び２次元シート状モデルの３次元画像及び断面部の画像である。
　これら画像から得られた腸管モデルの管径及び上皮層高さの経時変化をそれぞれ図５及び図６に示す。その結果、３次元腸管モデルでは、２次元シート状モデルと比較して上皮層の高さが高く、円柱上皮を形成していることが分かった。また、培養１２日目から上皮層の偏差が大きくなり１６日目では上皮層が肥厚することから、１２日目より上皮の立体構造が形成されはじめ、１６日目で上皮層がうねることが分かった。
３．細胞増殖アッセイ
　３次元腸管モデルと２次元シート状モデルについて、ＥdＵ (５-エチニル-２’-デオキシウリジン)とＨｏｅｃｈｓｔにより核染色を行ない、細胞増殖率とその分布を解析した。
　具体的な実験手順は以下のとおりである。３次元腸管モデルサンプルと２次元シート状モデル（それぞれｎ＝３）を１６日間培養し、20μＭ ＥdＵ含有培地で２４時間処理した後、ＰＢＳ中の４％（w/w）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で３０分間固定した。サンプルをＰＢＳおよび３％（w/w）ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、０．５％（v/v）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで室温で１５分間透過処理した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを、Alexa Fluor 594色素を含む細胞増殖キットの反応カクテルで培養した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳで６０分間洗浄した後、室温にて、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて核を１５分間染色した。サンプルを０．１％（v/v）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で８回洗浄し、ＰＢＳＴで４℃で一晩洗浄した。ＰＢＳで洗浄した後、４０倍の水浸検出対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用してＥｄＵ陽性細胞を観察した。ＥｄＵ陽性細胞とＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞の数を数え、ＩｍａｇｅＪを使用して最大強度の投影画像におけるＥｄＵ陽性細胞の分布を計算した。細胞分布を計算するために、画像を９つのサブエリアに分割し、ＥｄＵ陽性細胞をサブエリアでカウントし、以下の式を使用してχ２の値を計算した。p値は、χ２検定を用いてχ２の値を使用して直接計算した。ここで、χ２は、その値が大きいほど、増殖中の細胞が局所的に分布していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　得られたＥｄＵ染色のＸ-Ｙ平面での３Ｄ画像および最大強度投影（ＭＩＰ）図を図７に示す（核スケールバー：５０μｍ）。その結果、３次元腸管モデルでは、細胞増殖率が２次元シート状モデルよりも７倍程度高かった（図８）。また、３次元腸管モデルでは、χ２の値が２次元シート状モデルよりも大きく、細胞増殖が有意に局在化していることが確認された（図９）。生体内の腸においては細胞増殖する場所が突起構造の根本部分に局在化していることから、これらの結果は、３次元腸管モデルが、より生体内に近い性質の腸上皮を有していることを示すものである。
４．アクチン繊維（Ｆ－アクチン）の解析
　さらに、３次元腸管モデルと２次元シート状モデルについて、ファロイジンによりＦ－アクチンの染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔにより核染色を行ない、Ｆ－アクチンの発現を解析した。
　具体的な実験手順は以下のとおりである。３次元腸管モデルサンプルと２次元シート状モデル（それぞれｎ＝３）を１６日間培養し、４％ＰＦＡ /ＰＢＳで30分間固定し、０．５％（v/v）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで室温で１０分間透過処理した。ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４℃で一晩ブロッキングを行った。次に、サンプルを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ファロイジンと４℃で一晩培養した後、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。４０倍の水浸検出対物レンズを備えたＬＳＭ７００顕微鏡を使用して画像は取得した。最大強度投影（ＭＩＰ）画像のＦ－アクチン面積は、ＩｍａｇｅＪを使用した２値化によって測定した。
　得られたＸ-Ｙ平面での最大強度投影（ＭＩＰ）画像およびＸ-Ｚ平面での断面画像を図１０に示す（スケールバー：５０μｍ）。また、Ｆ－アクチン染色領域の面積割合を図１１に示す。その結果、３次元腸管モデルサンプルでは、アクチン繊維の発現が、２次元シート状モデルよりも有意に高く、１６日間の培養後、主に上皮細胞の基底側で完全に検出された。これは、腸上皮細胞が自発的に足場のゲルを牽引して、ゲルの物性に影響を与えることで環境を整えていることを示唆するものである。
　また、各種腸上皮細胞の分化マーカーの発現について検討を行った結果を図１２に示す。吸収上皮細胞マーカーであるビリンのタンパク質発現の局在は、上皮全体の細胞表面で確認され、ビリン1（ＶＩＬ１）ｍＲＮＡの発現は、２次元および３次元腸管モデル間で異ならなかった。パネート細胞マーカーであるリゾチームは主に２次元および３次元モデルの下部ゾーンで発現し、３次元腸モデルのリゾチーム（ＬＹＺ）ｍＲＮＡ発現は、２次元腸モデルよりも高かった。粘膜分泌細胞マーカーであるムチン２（ＭＵＣ２）ｍＲＮＡ発現は２次元および３次元モデル間で異ならなかった。陰窩における幹細胞マーカー遺伝子であるＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）の発現は、３次元腸管モデルで高かった。これらの結果によれば、３次元腸管モデルでは、陰窩のマーカーであるＬＹＺと、陰窩に存在する幹細胞マーカーであるＬＧＲ５遺伝子の発現が高いことから、遺伝子発現レベルにおいても２次元に比べて３次元で培養した腸管モデルは生体様であることが確認された。
５．ＴＥＭ画像解析
　次に、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、微絨毛等のより微細な構造についての評価を行った。
　図１３に、培養４日目及び１６日目における３次元腸管モデル（試験例１）及び２次元シート状モデル（比較例）のＴＥＭ画像を示す。３次元腸管モデル（試験例１）における培養１６日目では、微絨毛が多く形成され、生体内と同様に垂直方向に林立していることが確認された。また、同じくＴＥＭ画像から、３次元腸管モデル（試験例１）においては培養４日目から、タイトジャンクションの形成が開始されていることも併せて確認した。
　ＴＥＭ画像から得られた細胞高さ、アスペクト比、および微絨毛占有率を図１４に示す。いずれも２次元シート状モデルとの比較として示している（いずれの結果も、ｎ＝３）。その結果、３次元腸管モデルは、２次元シート状モデルと比較して、細胞の立方化（厚み）と微絨毛構造の形成において、より生体に近い組織モデルであることが分かった。
　さらに、ＴＥＭ画像により求めた微絨毛の林立率の結果を図１５に示す（いずれもｎ＝３）。なお、グラフは、９０°からの差が小さいほど垂直に近い林立であること示している。その結果、３次元腸管モデルは、２次元シート状モデルと比較して垂直方向に微絨毛が林立していることが分かった。一方、２次元シート状モデルでは、培養日数にかかわらず、微絨毛がランダムな角度であった。
６．α－リポ酸吸収試験
　３次元腸管モデル（試験例１）を用いて、α－リポ酸の吸収試験を行った。能動輸送の阻害剤として、アジ化ナトリウムを用いた。比較例として、２次元シート状モデルを用いた。
　具体的な試験手順は以下のとおりである。３次元腸管モデルをＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で３７℃、３０分間洗浄し、０．５ｍＭのα－リポ酸溶液（１０μＬ）を内腔内に添加して３０分間３７℃で静置した。能動輸送阻害群においては、α－リポ酸溶液に１０ｍＭのアジ化ナトリウムを同時に添加した。物質の単純な漏出がないことを、蛍光物質を結合させた4 ｋＤａデキストラン溶液を内腔側に１０μＬ添加することで確認し、ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、サンプル全体を回収した。２次元シート状モデルにおいては、ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で３７℃、３０分間洗浄し、フィルターメンブレン上部に０．５ｍＭのα－リポ酸溶液（５００μＬ）を添加し、下部にＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を１ｍｌ添加し、３０分間３７℃で静置した。その後下部ＨＢＳＳ緩衝液を回収し、漏出を確認した。３次元腸管モデルのサンプルまたは２次元シート状モデルの下部ＨＢＳＳ緩衝液を全量用いて質量分析を行い、内容物におけるα－リポ酸の量を同定した。α－リポ酸の量の透過量は、３次元腸管モデルは単純な管構造とした際の、２次元シート状モデルはシートとした際の上皮組織の単位面積あたりとして算出した。得られた結果を図１６に示す。
　図１６の結果から、３次元腸管モデルでは、スキャフォールド側に受動的に透過しない上皮構造を形成しつつ、２次元シート状モデルに比べて高い能動輸送による吸収を行うことが分かった。したがって、３次元腸管モデルは、より吸収効率の良い系として利用可能であることが示唆された。
７．炎症評価系 
　３次元腸管モデルのコラーゲンゲルに、単球系細胞であるＴＨＰ１をＰＭＡ処理して誘導したマクロファージ様細胞をセルトラッカーで染色して内包して培養した。１６日後、共焦点レーザー顕微鏡によりマクロファージを観察したところ、その移動と形態変化が観察できた。このことより、薬剤や毒物添加した際に、その添加によって変化するマクロファージの動態を観察することで、腸炎症を模倣したモデルとして解析可能である。

Claims (33)

  1. 　３次元腸組織モデルの作製方法であって、
    　ａ）細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有するスキャフォールドを用意する工程；
    　ｂ）前記スキャフォールドの前記内腔の内部に、腸上皮細胞を播種する工程；及び
    　ｃ）前記スキャフォールド内で前記腸上皮細胞を３次元培養し、腸組織モデルを得る工程
    を含む、該作製方法。
  2. 　前記腸組織が、腸管である、請求項１に記載の作製方法。
  3. 　前記細胞接着性を有する材料が、ハイドロゲルである、請求項１又は２に記載の作製方法。
  4. 　前記ハイドロゲルが、コラーゲンゲル又はヒアルロン酸ゲルである、請求項３に記載の作製方法。
  5. 　前記内腔が、直径２５０～１０００μｍの範囲の円筒状断面を有する、請求項１～４のいずれか１に記載の作製方法。
  6. 　前記内腔が、前記スキャフォールドを貫通している、請求項１～５のいずれか１に記載の作製方法。
  7. 　前記工程ｂ）の前に、前記スキャフォールドの前記内腔の内表面を、細胞接着性分子で被覆する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１に記載の作製方法。
  8. 　前記細胞接着性分子が、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス様分子、又はポリアミンである、請求項７に記載の作製方法。
  9. 　前記細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、又はそれらの組み合わせである、請求項８に記載の作製方法。
  10. 　前記工程ｂ）が、１ｘ１０５～１ｘ１０７個／ｍｌの腸上皮細胞を含む溶液を前記スキャフォールドの前記内腔の内部に添加することを含む、請求項１～９のいずれか１に記載の作製方法。
  11. 　以下のステップを含む前記スキャフォールドを作製する工程をさらに含む、請求項１に記載の作製方法：
    基材容器内に細胞接着性を有する材料の溶液を添加するステップ；
    前記溶液が格納された空間に棒状部材を挿入するステップ；
    前記溶液中をゲル化させ前記スキャフォールドを形成させるステップ；
    ゲル化後に前記棒状部材を除去し、前記スキャフォールドの長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を形成させるステップ。
  12. 　前記内腔の内表面の一部が、基材容器により形成されている、請求項１１に記載の作製方法。
  13. 　前記スキャフォールドが、前記腸上皮細胞以外の細胞を内包する、請求項１～１２のいずれか１に記載の作製方法。
  14. 　前記スキャフォールドが、免疫細胞又は間質細胞を内包する、請求項１～１２のいずれか１に記載の作製方法。
  15. 　腸上皮細胞を培養して３次元腸組織モデルを作製するためのスキャフォールド材料であって、細胞接着性を有する材料よりなり、長軸方向に延在する少なくとも１つの内腔を有する、該スキャフォールド材料。
  16. 　前記細胞接着性を有する材料が、ハイドロゲルである、請求項１５に記載のスキャフォールド材料。
  17. 　前記ハイドロゲルが、コラーゲンゲル又はヒアルロン酸ゲルである、請求項１６に記載のスキャフォールド材料。
  18. 　前記内腔が、直径２５０～１０００μｍの範囲の円筒状断面を有する、請求項１５～１７のいずれか１に記載のスキャフォールド材料。
  19. 　前記内腔が、前記スキャフォールドを貫通している、請求項１５～１８のいずれか１に記載のスキャフォールド材料。
  20. 　前記内腔の内表面が細胞接着性分子で被覆されている、請求項１５～１９のいずれか１に記載のスキャフォールド材料。
  21. 　前記細胞接着性分子が、細胞外マトリクス又はポリアミンである、請求項２０に記載のスキャフォールド材料。
  22. 　前記細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、又はそれらの組み合わせである、請求項２１に記載のスキャフォールド材料。
  23. 　前記腸上皮細胞以外の細胞を内包する、請求項１５～２２のいずれか１に記載のスキャフォールド材料。
  24. 　免疫細胞又は間質細胞を内包する、請求項１５～２３のいずれか１に記載のスキャフォールド材料。
  25. 　基材内又は基材上に担持されている、請求項１５～２４のいずれか１に記載のスキャフォールド材料。
  26. 　前記内腔の内表面の一部が、前記基材により形成されている、請求項２５に記載のスキャフォールド材料。
  27. 　請求項１５～２６のいずれか１に記載のスキャフォールド材料の内腔内に形成されている３次元腸組織モデル。
  28. 　絨毛様構造を有する腸管モデルである、請求項２７に記載の３次元腸組織モデル。
  29. 前記内腔内における上皮細胞の占有率が５０％以上である、請求項２８に記載の３次元腸組織モデル。
  30. 　請求項２７～２９のいずれか１に記載の３次元腸組織モデルを含むデバイス。
  31. 　請求項２７～２９のいずれか１に記載の３次元腸組織モデルを用いて、当該腸組織モデルの機能を評価する方法。
  32. 　前記スキャフォールド材料の内腔内に化合物を供給し、当該化合物による腸組織モデルの挙動変化をリアルタイムで観測することを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 　前記スキャフォールド材料の前記内腔以外の部分に化合物を供給することを含む、請求項３２に記載の方法。
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