CN108324989A - 一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织工程领域，具体公开了一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，本发明利用诱导分化后的脂肪干细胞脂肪在三维生物材料支架上进行增值以加速受损皮肤愈合，缩短愈合时间，使创面更加平整，减少皮肤褶皱，达到美化皮肤痊愈后效果的目的，为皮肤的生长恢复提供了一个较好的愈合条件，为干细胞用于临床治疗皮肤创伤提供参考。

Description

一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体地，涉及一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用。

背景技术

细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。细胞培养技术作为一种培养细胞的技术方法在生物学领域已被深入广泛的应用于观察活细胞的形态结构和生命活动和细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。

皮肤损伤是现代疾病损伤的重要原因之一，许多原因都会导致皮肤受损，例如烧伤、烫伤、外部意外创伤以及皮肤疾病等多种因素均可导致皮肤受损。现在皮肤受损的治疗方式主要通过自体皮片移植、异体皮移植等治疗方式进行，临床上治疗主要是以自体皮片为主，但是，通过自体皮片移植方法治疗皮肤损伤存在着供体皮肤有限和皮肤愈合时间较长以及愈后存在疤痕等问题，给患者生活造成了一定程度的影响，造成治疗的效果不尽理想。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，对受损的皮肤组织的修复有促进作用。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万用细胞"。

基于干细胞具有的强大分化潜能，近年来，随着组织工程学的不断发展，干细胞被越来越多的利用来与生物材料基质进行结合用来促进生物组织修复和疾病的治疗。

近年来，干细胞已被用于辅助皮肤伤口愈合和其它一些组织修复以及疾病治疗的研究，其中，相关研究已表明骨髓间充质干细胞在皮肤伤口愈合的过程中起到重要作用和具有积极意义。但是，骨髓间充质干细胞自身也存在一些限制，例如，骨髓间充质干细胞的产量相对较低，而且，要取得骨髓血需要较大的创面，可能会造成相关的后续问题出现。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，它还具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，与骨髓间充质干细胞相比更适宜用于自体移植。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，所述的干细胞在生物组织修复的应用，包括如下步骤：脂肪干细胞前处理、培养和诱导分化完成后，转移到生物支架上进行增值，以促进皮肤组织修复。

优选地，所述的生物支架为三维立体支架。

更优选地，所述的三维立体支架材料为聚糖-聚己内酯和壳聚糖-聚丙交酯中的一种。

更优选地，所述的三维立体支架材料为壳聚糖-聚丙交酯。

更优选地，所述的三维立体支架的结构为孔隙率高的多孔单层方形立体结构。

更优选地，所述的三维立体支架的结构为孔隙率高的多孔单层长方形立体结构。

优选地，所述的脂肪干细胞前处理过程为所述的脂肪干细胞的前处理为取小白鼠的脂肪，将其剪碎，随后加适量0.16％Ⅱ型胶原酶并搅拌，35℃左右消化35min。

更优选地，所述的小白鼠的脂肪为取自小鼠皮下股沟处脂肪组织。

优选地，所述的干细胞的培养为将前处理后的脂肪组织离心5min，并加入培养液，在 5％CO2浓度，37℃条件下进行培养。

更优选地，所述的脂肪组织的离心速度为2000rpm。

优选地，所述的干细胞诱导为为取融合度达到85％的第2代的脂肪干细胞，加入诱导培养液对脂肪干细胞进行诱导，在5％CO₂浓度，37℃条件下进行培养，期间每2天换液1次，诱导培养时间为2～3个星期。

更优选地，所述的干细胞诱导为双系诱导，分别对脂肪干细胞进行成骨诱导分化和成脂诱导分化。

更优选地，所述的成骨诱导分化培养时间为3周，成脂诱导分化培养时间为4周。

优选地，所述的生物组织为生物受损的皮肤组织。

更优选地，所述的生物组织修复为修复生物受损的表皮组织。

优选地，所述的生物组织修复为：

首先，环境条件为35℃，5％CO₂浓度条件下，对脂肪干细胞待细胞融合达到90％时，进行传代；

其次，取第3代脂肪干细胞分别进行成骨诱导分化和成脂诱导分化；

制备壳聚糖-聚丙交酯支架；

随后，将脂肪干细胞与壳聚糖-聚丙交酯支架共同培养，进行受损皮肤组织。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用。该发明利用前面所述的干细胞对生物受损皮肤组织进行修复。发明人惊奇的发现，采用本方法培养干细胞，显示该培养液与干细胞有良好的兼容性，有利于细胞活性的保持，与肝素相比，干细胞的神经分化能力更强，干细胞往神经方向分化率更高。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了本发明提供了一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，能够促进受损皮肤组织的修复，有利于缩短受损皮肤的愈合时间，使创面愈后更加平整，减少皮肤褶皱，起到美化皮肤痊愈额效果，而且脂肪干细胞具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，与骨髓干细胞等其它干细胞相比更适宜用于自体移植。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：

本实施例中，以壳聚糖-聚丙交酯为材料上制作成的三维多孔支架为桥梁；为脂肪干细胞的增值、新陈代谢等提供相应的空间和场所，最后通过检查受损皮肤的修复效果，通过与脂肪干细胞组、多孔支架组、空白组(自体修复)进行对比、分析判断脂肪干细胞对于受损皮肤组织修复的作用和效果。具体如下：

1、脂肪干细胞的分离和培养

1.1细胞的分离和培养

(1)小鼠脂肪干细胞细胞分离和培养

取死亡后的小鼠皮下股沟处脂肪组织，并用Hanks液冲洗，再用剪刀将脂肪组织剪碎，随后加适量0.16％Ⅱ型胶原酶并搅拌，35℃左右消化35min。随后在并将液体进行离心(2000rpm，5min)，并往里加入细胞培养液，并在环境条件为35℃，5％CO₂浓度条件下进行培养，待细胞融合达到90％时，进行传代，图像流式对脂肪干细胞进行检测，并参照文献的所述的方法进行。

(2)脂肪干细胞的诱导分化

(1)脂肪干细胞成骨诱导分化

取第3代的脂肪干细胞，先用蛋白酶对脂肪干细胞进行消化，之后再进行接种，待细胞贴壁后，分别往里加入成骨诱导液(标准培养基添加5％血清、5μmol/L氢化可的松、0.1mol/LFF 地塞米松、50μg/mL抗坏血酸+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠)，需每隔2天换一次培养液，3周末时用茜素红检查成骨分化情况，培养4周。

(2)脂肪干细胞成脂诱导分化

取第3代的脂肪干细胞，先用蛋白酶对脂肪干细胞进行消化，之后再进行接种，待细胞贴壁后，分别往里加入成骨诱导液(标准培养基添加1mol/L地塞米松、1μmol/L吲哚美辛、 5μg/mL胰岛素和0.1mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，需每隔2天换一次培养液，2周末时用油红O染色法检查其成脂情况，培养4周。

2、壳聚糖-聚丙交酯支架的制备

纳米支架由聚丙交酯和壳聚糖按质量比70～85:15～30组成，先取一定量的聚丙交酯溶于氯仿中，配成浓度为15％～25％的溶液，待其全部溶解后，加入壳聚糖，并搅拌，使聚丙交酯与壳聚糖成分混合在氯仿溶液中，再往里加入适量的氯化钠，充分搅拌均匀后，进行超声脱泡，注入到聚四氟乙烯模具中，静置36～48小时，随后脱模，再静置18～36小时，最后真空干燥24～36小时。并利用SEM对壳聚糖-聚丙交酯支架的材料的材料表面形貌进行观察，利用能谱仪、拉曼等分析对其成分进行分析。通过SEM、能谱仪和拉曼光谱仪表征显示，壳聚糖-聚丙交酯支架满足三维立体支架的多孔结构，成分为壳聚糖-聚丙交酯。

3、脂肪干细胞在支架上的种植和培养

支架被剪成相应的体积大小，75％酒精处理2.5小时，PBS清洗，于紫外灯下照射过夜。取长满细胞的1盘10cm直径培养皿，PBS清洗，1ml胰蛋白酶消化2分钟，等体积培养基中和。转移至15ml离心管，1200rpm，5分钟。取出，去上清，加入1ml培养基重悬细胞，2*10⁴个/cm²密度将细胞悬液加到材料上。37℃孵化培育2小时,再补加培养基至对应量。壳聚糖- 聚丙交酯支架具有多孔结构，可提供三维环境，有利于宿主细胞再生，实验显示接种8天后，培养基中自由悬浮细胞大量减少，表明大部分已附着在壳聚糖-聚丙交酯支架上。

4、细胞增殖检测

利用CCK8培养基检测试剂对细胞增值数量检测。

5、免疫荧光检测

将壳聚糖-聚丙交酯支架铺在盖玻片上，放入培养皿中，将脂肪干细胞以2*10⁴密度种于壳聚糖-聚丙交酯支架上，加入标准培养液。培养2天，使用4％多聚甲醛固定12min，用PBS 溶液冲洗3遍。0.1％Triton-X100透化固定2min，1％BSA封闭30min，加一抗抗微管蛋白与 4℃孵化培育过夜，用含1％血清蛋白血清的PBS冲洗3遍后，取标记的山羊抗小鼠lgG的二抗(1:10001％BSA：PBS)室温下孵化培育45min。PBS冲洗3遍后，加入DAPI(1:50001％BSA： PBS)，常温下染核10min，PBS清洗后，用荧光显微镜拍照。

6、实时反转录PCR反应

(1)提取RNA

按照Trizol法的相关步骤提取小鼠皮肤组织标本的总RNA。提取完总RNA后，并通过分光光度仪对RNA的质量进行检测，检测结果显示RNA纯度高，杂质较少，可以用于下一阶段逆转录反应。

(2)逆转录合成cDNA

反应体系为：Oligo dT Primer(25μM)2μl，dNTPMix(10mM)1μl，总RNA 1.5μg

RNase free dH₂O up to10μl

5*RTMaster Mix 4μl

RNA template 2.5μg

Nuclease-free ater up to 20μl

PCR的反应程序：

逆转录合成cDNA发反应程序：37℃(15min)，50℃(5min)，98℃(5min)4℃(5min)。

实时荧光定量PCR

本实验采用SYBR Green Master混合液作为实时荧光定量PCR的反应体系，反应体系为：

荧光定量PCR的反应程序：

95℃反应10s；93℃(5s，循环40次)；65℃(35s，循环40次)。

荧光定量PCR的结果分析

毎个靶基因的相对表达水平用2^-AACt方法计算。引物对的扩增效率先进行证实,以与内参基因扩增效率差别3％内则用于的定量比较。

7、动物实验

所有的实验动物处理都遵循美国实验动物饲养管理和使用指南。所有努力，都为尽量减轻痛苦和小鼠使用为目的。对小鼠进行剃毛处理后，在其背部切开一个1cm*1cm全层皮肤创口，伤口被随机分组(每个时间节点，每组3个创口)，1、对照组(自体修复组)，2、脂肪干细胞组，3、壳聚糖-聚丙交酯支架组，4、脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组。所有伤口均用透明材料覆盖，并用绷带加以固定。动物在相同条件下进行饲养，每天观察创面的愈合情况和动物状态，包括创面面积变化情况、局部炎症、肉芽组织增生及上皮愈合情况和愈合皮肤愈后状况等。在第3天、5天、8天和12天，采用CO2吸入法处死小鼠，取标本行组织学、实时定量PCR分析，伤口愈合后，再进行皮肤功能测定。

8、HE染色

留取背部切口处含两侧1cm范围全层皮肤姐织及对照组正常皮肤组织，以4％多聚甲酸固定和石蜡嵌入,制成石蜡组织切片,进行HE染色。具体步骤如下:

①脱蜡前,将石蜡切片放入烤箱中30分钟。

②依次放入二甲苯I、二甲苯II各10min进行脱蜡。

③依次放入100％乙醉I、100％乙醇II、95％乙醇、85％乙醇各1min,进行酒精梯度清洗。

④使用自来水浸泡10min。

⑤使用苏木素染色5min后,自来水冲洗1min。

⑧使用1％盐酸乙醇溶液分化10s后,自来水冲洗1min。

⑦使用淡氨水返蓝30秒后,自来水冲洗5min。

⑨放入伊红液染色3min,自来水冲洗1min。

⑨85％己醇20秒,95％酒精1min，100％乙醇I 1min,100％乙醉II 2min，酒精梯度脱水。

最后，二甲苯I I 5min，二甲苯II 10min。进行透明。

最后采用中性树胶封片,光镜下进行观察染色结果。

9、愈后创面检测

在创伤后第3、5、8、12d用透明薄膜描记创耐面积，测算创面愈合率，观察创面愈合情况。创面愈合率(％)＝(初始创晒面积一现创曲晒积)/初始创曲面积*100％，在创伤后，即刻进行面积描绘，使用己消毒的透明薄膜紧贴于创面，沿创缘描绘创面的范围，标记为初始创面面积，并使用扫描仪进行扫描。后创面的标记均按此方法进行。最后使用软件对扫描图像进行处理分析。

创口面积结果分析，术后3天、5天、8天和12天，脂肪干细胞组和壳聚糖-聚丙交酯支架组的皮肤愈合情况无太大差异但略微优于对照组(自体修复)，而与上述3组相比，脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组的皮肤愈合情况较好，创口缩小明显。

在动物实验的实验过程中，各组均无小鼠死亡，生活习性正常，无异常，体重均有所增加，各组小鼠的创面也都在不断减少，慢慢愈合，伴随有一定的炎症渗出液、新皮生成，未有明显炎症和化脓情况出现。对照组(自体修复)的皮肤褶皱明显，黑痂较多，其它3组相对对照组，皮肤较为平整，黑痂较少，其中以脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组皮肤最为平整，黑痂最少，其它两组情况大致相仿。

在第12天，通过对各组愈合皮肤厚度的检测显示，通过微标尺测量和HE染色观察皮肤，结果显示，脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组的皮肤厚度厚于其它3组，最为接近正常皮肤，而脂肪干细胞组优于其它两组，壳聚糖-聚丙交酯支架组和对照组(自体修复)大致相当。

10、皮肤愈合功能的评价

皮肤愈合后，对新愈合的皮肤的以下参数进行测定，对比皮肤功能完整性恢复情况。

皮肤水化程度的测定

主要对角质层的含水量进行测定。依据皮肤电容法对其进行测定，其中对照组(自体修复)为缺水性皮肤，皮肤含水量较低；脂肪干细胞组、壳聚糖-聚丙交酯支架组和脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组为正常含水量皮肤，其中以脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组含水量最高，优于脂肪干细胞组和壳聚糖-聚丙交酯支架组，上述两组皮肤含水量大致相仿。

水分保持能力的测定

通过对各组皮肤水分保持能力测定显示：其中脂肪干细胞加壳聚糖-聚丙交酯支架组的皮肤水分保持能力要优于正常皮肤，脂肪干细胞组和壳聚糖-聚丙交酯支架组的皮肤水分保持能力属于正常皮肤范围，而对照组(自体修复)属于不正常状态皮肤。

皮肤柔韧性的测定

通过使用测力计来对各组新愈合皮肤进行质量比较，其中以脂肪干细胞组和壳聚糖-聚丙交酯支架组的皮肤柔韧性最好，优于其它3组；而其它3组差别不大，皮肤柔韧性大致相仿。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的脂肪干细胞在生物组织修复的应用，包括如下步骤：脂肪干细胞前处理、培养和诱导分化完成后，转移到生物支架上进行增值，以促进皮肤组织修复。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的生物支架为三维立体支架。

3.根据权利要求2所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的生物支架的材料为壳聚糖-聚己内酯和壳聚糖-聚丙交酯中的一种。

4.根据权利要求2所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的生物支架的结构为孔隙率高的多孔单层方形立体结构。

5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的脂肪干细胞的前处理为取小白鼠的脂肪，将其剪碎，随后加适量0.16％Ⅱ型胶原酶并搅拌，35℃消化35min。

6.根据权利要求1所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的干细胞的培养为将前处理后的脂肪组织离心5min，并加入培养液，在5％CO₂浓度，37℃条件下进行培养。

7.根据权利要求1所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的干细胞诱导为取融合度达到85％的第2代的脂肪干细胞，加入诱导培养液对脂肪干细胞进行诱导，在5％CO₂浓度，37℃条件下进行培养，期间每2天换液1次，诱导培养时间为3～4个星期。

8.根据权利要求1所述的脂肪干细胞在生物组织修复中的应用，其特征在于，所述的生物组织为生物受损的皮肤组织。

9.一种脂肪干细胞在生物组织中的修复方法，其特征在于，所述的生物组织修复步骤为：

S1.环境条件为35℃，5％CO₂浓度条件下，对脂肪干细胞待细胞融合达到90％时，进行传代；

S2.取第3代脂肪干细胞分别进行成骨诱导分化和成脂诱导分化；

S3.制备壳聚糖-聚丙交酯支架；

S4.将脂肪干细胞与壳聚糖-聚丙交酯支架共同培养，进行受损皮肤组织。