CN111518711A - 一株肠杆菌株及其在联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents
一株肠杆菌株及其在联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT‑1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日期为2017年12月29日。本发明公开了一株肠杆菌及其在联产多糖及2,3‑丁二醇的应用，所述菌株是从酒糟中筛选得到，且首次公开该菌株能够联产多糖和2,3‑丁二醇，培养基中积累的多糖浓度高达12.61～46.59g/L，2,3‑丁二醇的产量达7.83～26.81g/L。该菌株以蔗糖为碳源，酵母粉为氮源，发酵合成的多糖和2,3‑丁二醇，蔗糖转化率可达68.13％～86.35％，大大降低了生产成本。本发明所述操作方法简单，成本较低，极具工业化推广的应用前景。
Description
技术领域
本发明具体涉及一株肠杆菌及其在联产多糖及2,3-丁二醇的应用，属于微生物学、 生物工程技术和化工技术领域。
背景技术
生物多糖广泛存在于微生物、大型真菌、动物和植物中，是天然界最丰富的聚合物之一。随着生物技术的高速发展，微生物胞外多糖功能的研究也日益完善，成为免疫学、 生物学和药学的研究热点。研究表明，微生物胞外多糖由于其独特的化学结构、优越的 物理化学性质、流变学特性以及本身的生物活性和营养价值，微生物胞外多糖在各个领 域均具有相关应用。此外，微生物胞外多糖具有生产周期短、原料廉价、纯化简单以及 可在人工控制下进行大规模工业化生产等动植物多糖所不具备的优势。因此，微生物胞 外多糖正迅速成为重要的新兴的生物材料。
2,3-丁二醇(2,3-Butanediol)是一种极具价值的液体燃料，燃烧值仅次于乙醇且高 于甲醇，达27,200kJ/kg；2,3-丁二醇也是一种极有潜力的化工原料，可用于生产抗冻剂、 高级航空油；2,3-丁二醇可以清除自由基、阻断过氧化反应，因而被广泛地应用于化妆品、洗液等行业；此外，2,3-丁二醇还可以用作高价值香料的食品添加剂和医药中间体。
经检索，目前未见有使用肠杆菌K.cowanii发酵联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇 的专利报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一株依赖蔗糖合成微生物胞外多糖和2,3-丁二醇 的肠杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述肠杆菌的应用。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
发明人从60份来自全国各地的酒糟中筛选得到一株能够联产多糖和2，3-丁二醇的 肠杆菌，菌株号为Kosakonia cowaniiLT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中 心，邮编：430072，登记入册的保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日期为2017年 12月29日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。
所述菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。
表1菌落形态学特征与生理生化特性
2、16S rDNA序列分析：
测得菌株的16S rDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQID No.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建 16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与肠杆菌HME8565达到100％ 同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌， 具体为肠杆菌K.cowanii LT-1。
上述肠杆菌K.cowanii LT-1在发酵合成微生物胞外多糖和2,3-丁二醇的应用也在本 发明的保护范围之内。
具体的应用方法为，将肠杆菌LT-1接种于斜面固体培养基，转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有多糖和2,3-丁二醇。
本发明所述肠杆菌K.cowanii LT-1及其所述菌在制备微生物胞外多糖和2,3-丁二醇 的应用，依次包括以下步骤：
1.培养基的配制：
斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉 20g/L，pH值7.0～7.2，余量为水。
液体种子培养基：碳源10～30g/L，氮源4～8g/L，无机盐及金属离子1～2.5g/L，pH值7.0～7.2，余量为水。
固体种子培养基：液体种子培养基，琼脂粉20g/L，pH值7.0～7.2，余量为水。
富集液体培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1.5g/L， 氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.05g/L，氯化锌0.08g/L、琼脂粉20g/L，pH 值7.0～7.2，余量为水。
富集固体培养基：富集液体培养基、琼脂粉20g/L，pH值7.0～7.2，余量为水。
发酵培养基：蔗糖30g/L、酵母粉6g/L、硝酸钠6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、氯化 钙0.3g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.04g/L、氯化锌0.1g/L，pH值7.0～7.2，余量为水。
2.菌种选择：
选已保藏菌株肠杆菌K.cowanii LT-1；
3.菌种活化：
将肠杆菌K.cowanii LT-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；
4.种子液培养：
取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为28～38℃培养24h，得到发酵种子液；
5.发酵培养：
摇瓶发酵培养：将上述发酵种子液在无菌条件下以4％～8％体积比的接种量，将种 子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，28～38℃培养36～48h；当发酵液中多糖和丁二醇浓度基本不再上升时，发酵停止；
6.多糖提取：
(1)取步骤5中发酵液取于5,000rpm条件下离心除去菌体，上清液在60～70℃ 条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5，加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉 淀用无水乙醇脱水，经过高速离心收集沉淀，恒温干燥后可获得胞外多糖粗品；
(2)将步骤(1)所得的多糖粗品溶解于25倍体积蒸馏水中，用Na2CO3调pH至 7.0～8.0，加入质量为多糖1％～5％的胰蛋白酶，50～60℃水解1～2h后，用草酸调pH至 5.0～6.0添加质量为多糖质量2‰～5‰的木瓜蛋白酶，60～70℃水解2～4h后，于100℃ 水浴加热4～6min，以终止酶反应；
(3)将步骤(2)所得蛋白酶处理液用草酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌， 15,000rpm离心10～15min，取上清；
(4)将步骤(3)所得清液加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得 多糖溶液；
(5)将步骤(4)所得多糖溶液用氨水调pH值至8.0，在50℃下滴加30％的H2O2， 至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用草酸中和pH至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻 干燥得多糖精品，并蒸馏回收酒精；
7.多糖含量测定
本发明利用苯酚硫酸法测定多糖含量：
精密称取干燥恒重的葡萄糖，配置成0.000、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mg/mL的标准液，同时配置一定浓度的多糖溶液。 精密吸取各标准液和多糖溶液0.2mL，分别置于试管内，各加5％苯酚试剂0.1mL和浓 硫酸0.5mL，立刻摇匀。沸水加热15min，冰浴，以0mg/mL的标准液作空白对照， 在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归 方程，并计算多糖的含量。
8.2,3-丁二醇的提取：
取步骤6(1)中的沉淀上清液，对其进行减压蒸馏，获得30％～55％的浓缩液，再加入等体积的45％的K2HPO4/乙醇体系，形成双相体系，将上相中的溶液进行蒸馏，得 2,3-丁二醇。
9.2,3-丁二醇含量测定：
取步骤5中的发酵液，12000rpm离心20min，上清用0.22μm的滤膜过滤除去菌体，置于进样瓶中待用。样品采用示差检测器检测，色谱柱：Aminex HPX-87H(300×7.8mm)； 流动相：0.05M的H2SO4；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：60℃。
有益效果：本发明具有如下优势：
(1)本发明筛选得到一株联产多糖和2,3-丁二醇的菌株，该菌株能够以蔗糖为碳源，发酵合成多糖和2,3-丁二醇，副产物少，蔗糖转化率可达68.13％～81.97％，大大降 低了生产成本，且有利于多糖和2,3-丁二醇的纯化，社会和经济效益显著。
(2)该菌株利用廉价的原材料同步发酵合成多糖和2,3-丁二醇，多糖产量高达12.61～46.59g/L，2,3-丁二醇的产量达7.83～26.81g/L。该方法不仅生产成本低，而且操作简单，这对于多糖和2,3-丁二醇的生产和拓展应用具有十分重要的意义。
附图说明
图1为肠杆菌LT-1的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和肠杆菌LT-1 的系统发育树(B)。
图2为肠杆菌LT-1产胞外多糖水解液液相色谱图。
图3为肠杆菌LT-1产胞外多糖的红外光谱图。
图4为肠杆菌LT-1产胞外多糖的核磁共振图(NMR)图谱，其中(A)为1H谱； (B)为13C谱。
图5为肠杆菌LT-1产微生物胞外多糖的结构。
图6为肠杆菌LT-1产2,3丁二醇高效液相色谱图。
图7为肠杆菌LT-1产2,3-丁二醇的红外光谱图。
图8为摇瓶水平合成肠杆菌LT-1胞外多糖和2,3-丁二醇进程曲线。
图9为50L发酵罐补料合成肠杆菌LT-1胞外多糖和2,3-丁二醇进程曲线。
图10为1t发酵罐补料合成肠杆菌LT-1胞外多糖和2,3-丁二醇进程曲线。
具体实施方式：
可以根据下列实施例更好的理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。
实施例1：菌株LT-1的筛选及其菌属鉴定
从60份来自全国各地的酒糟中筛选微生物胞外多糖产生菌，各取1g分别加入装有无菌富集培养基的三角瓶中，在37℃条件下，置于摇床以200rpm，富集培养48h。 取1mL培养液转接到相同的液体富集培养基中相同条件下培养48h。在无菌条件下， 将培养液稀释到10-8和10-9，各取0.2mL涂布于苯胺蓝多糖筛选平板中，30℃培养24 h，根据菌落表面湿润粘稠的程度和表面代谢产物与苯胺蓝反应的颜色变化，筛选出阳 性菌株并进行分离纯化，再接种到多糖发酵培养基中，在30℃，200rpm条件下培养 45h，然后测定初筛菌株多糖的产量，获得产量最高的菌株。在后续各种生理生化测定 的实验中，发现发酵液中含有一定量的2,3-丁二醇。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株LT-1的基因组DNA，以上游引物27F 和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回 收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株 的16S rDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测 序结果与Gene Bank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程 序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与 肠杆菌K.cowanii HME8565达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理生 化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌，具体命名为肠杆菌K.cowanii LT-1。
所述的苯胺蓝多糖筛选平板包含如下组分：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，苯胺蓝0.05g/L，琼脂20g/L， 余量为水，自然pH，121℃灭菌20min。
实施例2：菌株LT-1发酵产物多糖和2,3-丁二醇的鉴定
①多糖及其结构的鉴定：
取肠杆菌K.cowanii LT-1多糖发酵液于5,000rpm条件下离心除去菌泥，上清液在60～70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5，加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取 沉淀，沉淀用无水乙醇脱水，经过高速离心收集沉淀，恒温干燥后可获得胞外多糖粗品； 将多糖粗品溶解于蒸馏水中，用Na2CO3调pH至7.0～8.0，加入质量为多糖1％～5％的胰 蛋白酶，45～55℃酶解1～2h后，用醋酸调pH至5.0～6.0添加质量为多糖质量2‰～5‰ 的木瓜蛋白酶，55～65℃水解2～4h后，于100℃水浴加热15～30min，终止酶反应； 将蛋白酶处理液用醋酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，5000rpm离心10～15min， 取上清加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；用氨水调pH 值至8.0，在50℃下滴加30％的H2O2，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用稀盐酸 中和pH至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖提纯产物。
取多糖提纯产物0.3g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于30℃水浴60 min，取出后加入84mL去离子水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷 却，调节pH至6.5，得到多糖酸水解液，多糖水解液液相色谱结果如图2所示。从单糖 高效液相色谱图中可以看出，EPS共有四种单糖组分，分别为葡萄糖醛酸、葡萄糖、半 乳糖和岩藻糖。
利用红外光谱仪鉴定K.cowanii LT-1发酵微生物胞外多糖提纯产物的红外图谱，取 样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描 范围4000～400cm～1(图3)。以D2O为溶剂，对K.cowanii LT-1发酵提纯产物进行NMR 1H和NMR13C检测。结果如图4所示，经过对多糖的结构进行解析，得知多糖的初步 结构如图5所示。
②2,3-丁二醇的鉴定：
取①中沉淀上清液，对其进行减压蒸馏，获得30％～55％的浓缩液，再加入等体积的45％的K2HPO4/乙醇体系，形成双相体系，将上相中的溶液进行蒸馏，得2,3-丁二醇。 将所得2,3-丁二醇用0.22μm的滤膜过滤除去菌体，置于进样瓶中待用。样品采用示差 检测器检测，色谱柱：Aminex HPX-87H(300×7.8mm)；流动相：0.05M的H2SO4； 流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：60℃。提纯后的菌株LT-1产物液相色谱分 离结果如图6所示，在相同色谱条件下，该物质与2,3-丁二醇标准品对比，在同一处均 有吸收峰出现，说明发酵液中含有2,3-丁二醇。利用红外光谱仪鉴定2,3-丁二醇提纯产 物的红外图谱，制样后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm-1。 结果如图7所示，符合2,3-丁二醇的结构特征。
实施例3：肠杆菌LT-1发酵联产胞外多糖和2,3-丁二醇碳源种类的优化
本实施例说明不同碳源对菌株胞外多糖和2,3-丁二醇产量的影响，将种子培养液以 4％(v/v)的接种量分别接种于含甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸盐为唯一碳源的 发酵培养基，初始pH值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，发酵培养45h， 菌株胞外多糖和2,3-丁二醇的产生情况明显不同。仅当碳源为蔗糖时，菌株才能合成微 生物胞外多糖。此时，多糖产量达到12.61g/L，生产速率高达0.28g/L/h，蔗糖转化率 为42.03％；2,3-丁二醇产量达到7.83g/L，生产速率高达0.17g/L/h，蔗糖转化率为26.10％。 底物蔗糖的总转化率为68.13％。
实施例4：肠杆菌LT-1发酵合成胞外多糖和2,3-丁二醇碳源浓度的优化
本实施例说明不同蔗糖浓度对菌株胞外多糖和2,3-丁二醇产量的影响，将种子培养 液以4％(v/v)的接种量分别接种于蔗糖浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100g/L的发酵培养基中，初始pH值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，发酵 培养45h，菌株胞外多糖和2,3-丁二醇的产生情况明显差别较大。当所选蔗糖浓度为3％ 时，菌株的胞外多糖产量最多。因此，选择蔗糖浓度30g/L为发酵培养基的碳源浓度， 多糖产量达到12.92g/L，生产速率高达0.29g/L/h，蔗糖转化率为43.07％；2,3-丁二醇 产量达到8.23g/L，生产速率高达0.18g/L/h，蔗糖转化率为27.43％。底物蔗糖的总转 化率为70.50％。
实施例5：肠杆菌LT-1发酵合成胞外多糖和2,3-丁二醇氮源种类的优化
本实施例说明不同氮源对菌株胞外多糖和2,3-丁二醇产量的影响，将种子培养液以 4％(v/v)的接种量分别接种于含牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、花生 粉、黄豆粉、小麦胚芽粉、酵母粉为唯一氮源的发酵培养基，初始pH值为7.0～7.2，于 28～32℃，200rpm振荡培养，发酵培养45h，菌株胞外多糖和2,3-丁二醇的产生情况 明显不同。当所选氮源为酵母粉时，菌株的胞外多糖产量最多。因此，选择酵母粉为发 酵培养基的氮源，多糖产量达到13.65g/L，生产速率高达0.30g/L/h，蔗糖转化率为 45.50％；2,3-丁二醇产量达到8.46g/L，生产速率高达0.19g/L/h，蔗糖转化率为28.20％。 底物蔗糖的总转化率为73.70％。
实施例6：肠杆菌LT-1发酵合成胞外多糖和2,3-丁二醇酵母粉浓度的优化
本实施例说明不同酵母粉浓度对菌株胞外多糖和2,3-丁二醇产量的影响，将种子培 养液以4％(v/v)的接种量分别接种于酵母粉浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L 的发酵培养基中，初始pH值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，发酵培养45 h，菌株胞外多糖和2,3-丁二醇的产量差别较大。当所选酵母粉浓度为0.4％～0.8％时，菌 株的胞外多糖产量最多。因此，选择酵母粉浓度0.4％～0.8％为发酵培养基的氮源浓度， 多糖产量达到14.07g/L，生产速率高达0.31g/L/h，蔗糖转化率为46.90％；2,3-丁二醇 产量达到8.64g/L，生产速率高达0.19g/L/h，蔗糖转化率为28.80％。底物蔗糖的总转 化率为75.70％。
实施例7：肠杆菌LT-1发酵合成胞外多糖和2,3-丁二醇温度的优化
本实施例说明不同培养温度对菌株胞外多糖和2,3-丁二醇产量的影响，将种子培养 液以4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为7.0～7.2，于200rpm恒温振 荡培养，发酵培养45h，发酵培养温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、 36℃，菌株胞外多糖和2,3-丁二醇的产生情况明显不同。从结果可以看出在28～32℃ 菌株的胞外多糖产量较高。因此，选择28～32℃为最佳生产胞外多糖和2,3-丁二醇的温 度范围，多糖产量达到14.41g/L，生产速率高达0.32g/L/h，蔗糖转化率为48.03％；2,3- 丁二醇产量达到8.76g/L，生产速率高达0.20g/L/h，蔗糖转化率为29.20％。底物蔗糖 的总转化率为77.23％。
实施例8：肠杆菌LT-1发酵合成胞外多糖和2,3-丁二醇pH的优化
本实施例说明不同pH值对菌株发酵制备胞外多糖和2,3-丁二醇的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，温度为30℃，于200rpm振荡培养45h， 培养pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0不同的pH值，菌株胞外多 糖和2,3-丁二醇的产生情况明显不同。从结果可以看出在28～32℃菌株的胞外多糖产量 较高。因此，选用pH值7.0为最佳发酵pH值。多糖产量达到14.79g/L，生产速率高 达0.33g/L/h，蔗糖转化率为49.30％；2,3-丁二醇产量达到8.93g/L，生产速率高达0.20 g/L/h，蔗糖转化率为29.77％。底物蔗糖的总转化率为70.07％。
实施9：肠杆菌LT-1发酵合成胞外多糖和2,3-丁二醇所需金属盐种类及其浓度的优 化
本实施例说明金属盐及其浓度对菌株产胞外多糖和2,3-丁二醇产量的影响，将种子 培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各不同浓度金属盐的发酵培养基中，经过单因素变量实验如下：
硝酸钠3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0g/L以及对照组，硝酸钠最佳浓度为6.0g/L；
磷酸二氢钾0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，磷酸二氢钾最佳浓度为0.30g/L；
氯化钙0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，氯化钙最佳浓度为0.30g/L；
硫酸镁0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.50g/L；
硫酸锰0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g/L以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.04g/L；
氯化锌0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12g/L以及对照组，氯化锌最佳浓度为0.10g/L；
对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属离子设置3组平行对照，初始pH值为7.0，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养45h，菌株产胞外多糖产量最高。此 时，多糖产量达到15.09g/L，生产速率高达0.34g/L/h，蔗糖转化率为50.30％；2,3-丁 二醇产量达到9.03g/L，生产速率高达0.20g/L/h，蔗糖转化率为30.10％。底物蔗糖的 总转化率为80.40％(图8)。
实例10：50L发酵罐分批补料合成肠杆菌LT-1胞外多糖和2,3-丁二醇
将肠杆菌LT-1接种在种子培养基，在30℃，200rpm的摇床条件下培养24h，将 种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有7.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行 培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，空气比控制在1.1VVM，转速为400 rpm，发酵90h，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用盐酸或氨水控制发酵液pH值 在7.0之间。当发酵液中残留还原糖在5g/L时，打开补料装置，将蔗糖加入发酵液中， 进行分批补料，除最后一次补料，其他补料时使发酵液中蔗糖终浓度达到30g/L左右， 进行补料发酵。发酵60h，多糖产量达到45.10g/L，生产速率高达0.50g/L/h，蔗糖转 化率为53.06％；2,3-丁二醇产量达到26.21g/L，生产速率高达0.29g/L/h，蔗糖转化率 为30.84％。底物蔗糖的总转化率为83.90％(图9)。
实例11：1t发酵罐补料合成肠杆菌LT-1胞外多糖和2,3-丁二醇
将肠杆菌LT-1接种在种子培养基，在30℃，300rpm的100L种子罐中培养24h， 将种子液按10％(v/v)的接种量泵入预装有750L灭菌后的发酵培养基的1,000L发酵 罐中培养90h，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，空气比控制在1.4VVM， 转速为300rpm，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用盐酸或氨水控制发酵液pH值 在7.0～7.2之间。当发酵液中残留还原糖在5g/L时，打开补料装置，将蔗糖加入发酵液 中，进行分批补料，除最后一次补料，其他补料时使发酵液中蔗糖终浓度达到30g/L左 右，进行补料发酵，多糖产量达到46.59g/L，生产速率高达0.52g/L/h，蔗糖转化率为 54.81％；2,3-丁二醇产量达到26.81g/L，生产速率高达0.30g/L/h，蔗糖转化率为31.54％。 底物蔗糖的总转化率为86.35％(图10)。
实例12：
此外，该菌及其所产多糖可以促进经济类作物(玉米、小麦、水稻、土豆、红薯、 油菜、棉花、草莓等)生长、提高种子发芽率、果实增产和提早上市的作用。
最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出 或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一株肠杆菌株及其在联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1388
<212> DNA
<213> 肠杆菌LT1(Kosakonia cowanii)
<400> 2
acggtaacag gaagcagctt gctgcttcgc tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct 60
gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt 120
cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt 180
agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg 240
accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg 360
ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggc gatgtggtta ataaccgcgt cgattgacgt 420
tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc 480
aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt 540
gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca tccgaaactg gcaggcttga gtctcgtaga 600
ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg 660
cgaaggcggc cccctggacg aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga 780
ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 840
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 900
gcaacgcgaa gaaccttacc tggtcttgac atccacagaa cttggcagag atgccttggt 960
gccttcggga actgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt ccggccggga 1080
actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1140
ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag aagcaaactc 1200
gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac 1260
tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgtg aatcagaatg tcacggtgaa tacgttcccg 1320
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt 1380
aaccttcg 1388
Claims (8)
1.一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日为2017年12月29日。
2.权利要求1所述的肠杆菌在发酵联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇的应用。
3.权利要求1所述的肠杆菌在制备微生物胞外多糖中的应用。
4.权利要求1所述的肠杆菌在制备2,3-丁二醇中的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将肠杆菌LT-1接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下组分：
蔗糖20～40g/L，酵母粉4～8g/L，硝酸钠4～8g/L，氯化钙0.1～0.5g/L，硫酸锰0.02～0.06g/L，磷酸二氢钾0.2～0.5g/L，氯化锌0.05～0.20g/L，硫酸镁0.2～1.0g/L，pH7.0～7.2，余量为水。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述的好氧培养，其培养条件如下：初始pH为7.0～7.2、通气比1.0～1.5VVM、培养温度为28～32℃、培养时间为48～96h。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述利用发酵罐进行发酵时的发酵方式为分批补料发酵。
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