CN115074299A - 一种可稳定产生臭豆腐气味物质的凝结芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可稳定产生臭豆腐气味物质的凝结芽孢杆菌，属于微生物领域。本发明从卤水中筛选得到了一株凝结芽孢杆菌，该菌株能够生产丰富的十四醇、乙酸芳樟酯、醋酸缩水甘油酯这三种对于臭豆腐风味有显著提升的风味物质。该菌株对十四醇、乙酸芳樟酯、醋酸缩水甘油酯的生产量显著高于现有的常用于制备臭豆腐的微生物，如毕赤酵母、乳酸杆菌、长膜明串珠菌等。并且具备良好的传代稳定性，传代5代，每代菌株能稳定生产这三种物质。可用于新型风味卤水的改良，对于臭豆腐制备及提升臭豆腐的风味具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种可稳定产生臭豆腐气味物质的凝结芽孢杆菌，属于微生物领域。
背景技术
臭豆腐卤水是臭豆腐发酵过程中非常重要的环节。臭豆腐卤水的风味好坏直接决定臭豆腐风味的差异。而在臭豆腐卤水发酵过程中，微生物的种类对于卤水的发酵非常重要，不同的微生物种类对于卤水的风味影响不同。在前期的研究中，发明人发现，十四醇、乙酸芳樟酯、醋酸缩水甘油酯可以作为卤水气味的物质，这三种物质对臭豆腐的风味产生着很大的影响，选择含有该三种风味物质的臭豆腐(H组)卤水与不含有该三种风味物质的卤水(B组)进行感官评价，共有20名志愿者参与感官评价。志愿者通过使用招气入鼻法对两种卤水的气味进行打分。感官评价标准如下表1，结果如图1所示，根据结果可知，含有三种气味物质的组别得分更高，也表明在含有三种气味物质的状态下，卤水风味更好。因此，需要寻找可产生这三种气味物质的微生物。同时，当前尚未有研究表明发现何种微生物可产生类似的物质，因此此三种气味物质一直难以在卤水气味中被发现。因此新型风味的卤水改良一直难以开展。
表1感官评价标准
表2.参与感官评价的两种卤水所含有三种气味味物质的含量(以邻苯二甲酸二丁酯为内标)
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC-YJ，已于2021年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021431。
本发明的第二个目的是提供了含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的微生物菌剂。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂中凝结芽孢杆菌的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
本发明的第三个目的是提供了一种生产臭豆腐风味物质的方法，将所述凝结芽孢杆菌接种至NA培养基进行培养。
在一种实施方式中，在35～40℃下培养不少于24h。
本发明的第四个目的是提供了一种制备臭卤水汁的方法，将制备卤水汁的原料混匀，加入所述凝结芽孢杆菌或所述微生物菌剂，进行发酵，发酵后得到的液体即为臭卤水汁。
在一种实施方式中，所述制备卤水汁的原料为纯碱、绿矾、水发香菇、冬笋、精盐、白酒。
在一种实施方式中，先用10～15kg清水将2～3kg浏阳豆豉煲煮约45min后，将豆豉过滤得豆豉汁。
在一种实施方式中，在豆豉汁中放入75～100g纯碱、2～5g绿矾、2000～3500g水发香菇、2000～3500g冬笋、500～750g精盐、100～150g白酒放入豆豉汁中，再加入嫩豆腐搅碎调匀，接种所述凝结芽孢杆菌，在35～40℃下发酵，至产生臭味为止，得到的液体即为臭卤水汁。
本发明的第五个目的是提供了一种制备臭豆腐的方法，其特征在于，利用所述凝结芽孢杆菌发酵制备得到臭卤水汁；将豆腐块在含有绿矾的溶液中浸泡2～3h；将浸泡过后的豆腐洗净放入臭卤水汁中浸泡2～8h。
在一种实施方式中，臭卤水中浸泡的时间根据季节进行调整，春季和秋季浸泡4.5～6h，夏季浸泡2～3h，冬季浸泡8～9h。
在一种实施方式中，所述臭卤水汁的制备方法为先用10～15kg清水将2～3kg浏阳豆豉煲煮约45min后，将豆豉过滤得豆豉汁；在豆豉汁中放入75～100g纯碱、2～5g绿矾、2000～3500g水发香菇、2000～3500g冬笋、500～750g精盐、100～150g白酒放入豆豉汁中，再加入嫩豆腐搅碎调匀，接种所述凝结芽孢杆菌，在35～40℃下发酵，至产生臭味为止，得到的液体即为臭卤水汁。
本发明的第六个目的是提供了所述凝结芽孢杆菌，或所述微生物菌剂在制备臭豆腐或生产臭豆腐风味物质中的应用。
本发明的有益效果：
本发明从卤水中筛选得到了一株凝结芽孢杆菌，该菌株能够生产丰富的十四醇、乙酸芳樟酯、醋酸缩水甘油酯这三种对于臭豆腐风味有显著提升的风味物质。该菌株对十四醇、乙酸芳樟酯、醋酸缩水甘油酯的生产量显著高于现有的常用于制备臭豆腐的微生物，如毕赤酵母、乳酸杆菌、冒昧、长膜明串珠等。并且具备良好的传代稳定性，传代5代，每代菌株能稳定生产这三种物质。可用于新型风味卤水的改良，对于臭豆腐制备及提升臭豆腐的风味具有重要意义。
生物材料保藏
本发明所提供的凝结芽孢杆菌，分类命名为凝结芽孢杆菌BC-YJ Bacilluscoagulans BC-YJ，已于2021年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2021431，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为感官评价结果图。
图2为凝结芽孢杆菌的菌落形态图。
图3为传代次数与三种气味物质的产生量的变化图。
图4为凝结芽孢杆菌与其他卤水常见菌落比较图。
具体实施方式
实施例1：菌株的筛选
(1)制备合适的样品稀释梯度并培养
通过卫龙集团上海总公司所提供的卤水样本，将卤水利用生理盐水分别稀释为103、104、105、106，将稀释液分别涂布于营养琼脂培养基(NA)平板，放置于37℃恒温培养箱中进行培养24h，挑取形成的分离较为明显的单个白色菌落到新的营养琼脂培养基(NA)平板，进行纯化培养，经过10代纯化后获得了该种微生物，并且通过菌种的16S rDNA测序，并附有的16S RNA基因测序结果于Genebank结果相比较，测序结果在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行比对分析，鉴定送检样品的种属。一般将在NCBI上比对得到的同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为送检样品的种属。并且通过革兰氏染色方法在63倍油镜下观察进一步确定了菌种名称，为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。
(2)划线分离与纯化
用无菌接种针挑取分离较为明显的白色斑点状菌落，在新制的营养琼脂培养基(NA)上进行“之”字形平板划线，放置于37℃恒温培养箱中进行培养24h。并重复该步骤10次，即可获得纯化菌株。
(3)16S rRNA序列扩增
吸取1mL菌液6000rpm离心3min，倾去上清，水洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行PCR扩增，流程如下：
PCR扩增体系20μL：
其中模板量为1μL，双向引物各1μL，Taq酶MasterMix为10μL，ddH2O为7μL。
所用引物为：
27F：AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA，1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。
PCR扩增条件：
预变性：95℃3min；
第一步变性：94℃1min；
第二步退火：60℃37s；
第三步延伸：72℃2min；
循环次数：将第一步至第三步37次循环；
第四步最后延伸：72℃5min；
第五步保持：12℃10min。
(4)琼脂糖凝胶电泳
称取80mL琼脂糖加入锥形瓶中，加入80mL 1×TAE，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入4μL核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入PCR扩增产物，每个孔中加入2μL PCR扩增产物，120V 15min跑胶，结束后取出置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录PCR成功样品的编号，将成功的PCR产物置于-20℃冰箱中保藏。
(7)测序与鉴定
将PCR成功的样品送到英潍捷基(上海)贸易有限公司进行检测，根据反馈的序列结果，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行BLAST检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。通过革兰氏染色方法在63倍油镜下观察，结果如图2所示，经分析鉴定，本发明提供的菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
实施例2：利用凝结芽孢杆菌BC-YJ发酵生产风味物质及其传代稳定性
将实施例1中筛选得到的凝结芽孢杆菌，挑取1.0g菌体接种至NA培养基，37℃培养24h，挖取培养基装入顶空进样小瓶，并采用接种针挑取菌落接种在新的空白NA培养基上，并重复上述操作，可获得下一代菌落。重复5次后，将挖取的培养基进行GC×GC顶空进样检测培养基被发酵所产生的气味物质(以邻苯二甲酸二丁酯为内标)。
GC-MS条件如下：
载气种类：He，气体流速：1.00mL/min，进样口温度：45℃，出口温度：230℃，升温程序：45℃保持3min，以10℃/min升温至230℃，保持6min。色谱柱条件：TR-FFAP，柱长30m，内径250μm，最高耐受温度：250℃。
质谱条件如下：
相对分子质量(m/z)扫描范围：33-450，电离源种类：EI源，离子模式为正离子模式，采用高分辨数据获取方式，保留时间90s。
结果如图3所示：本凝结芽孢杆菌在经过传代后，产生的十四醇、乙酸芳樟酯、醋酸缩水甘油酯含量较为恒定(结果如表3所示)，因此可以判断为可稳定产生该三种气味物质。
表3.培养各代含有三种气味物质含量
实施例3：凝结芽孢杆菌BC-YJ生产风味物质能力的比较
本菌株产生十四醇、乙酸芳樟酯和醋酸缩水甘油酯等三种气味物质的能力与其他发酵卤水中常见菌株的比较。
发酵卤水中常见的菌落有：毕赤酵母(CCTCC KY 2008612)、乳酸杆菌(CCTCC AF207030)、毛霉菌(CGMCC 3.4945)、肠膜明串珠菌(CCTCC AB 2010207)，将其同时接种在NA培养基中，按照上述培养方法与凝结芽孢杆菌共同培养。并挖取培养基进行GC×GC顶空进样检测培养基被发酵所产生的气味物质。GC-MS条件同上，检测三种物质在各菌落中的峰强度。结果如图4所示，凝结芽孢杆菌产生该三种气味物质的能力远强于常见的菌落。
实施例4：凝结芽孢杆菌BC-YJ的制备
取200～600μL的凝结芽孢杆菌BC-YJ接种于10～30mL NA培养基中，28℃下活化2至3代，待凝结芽孢杆菌BC-YJ达到108cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水)和冷冻保护剂(15％～20％(w/v)的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于107cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
实施例5：凝结芽孢杆菌BC-YJ在制备臭豆腐中的应用
(1)卤水汁制作
清水15kg和浏阳豆豉3kg，大火烧开后改小火，煲煮约45min后将豆豉过滤得豆豉汁。
纯碱100g、绿矾20g、水发香菇3500g、冬笋3500g、精盐750g和白酒150g。一同放入装有晾凉豆豉汁的缸里搅匀。随后把3kg嫩豆腐放到缸里并搅碎调匀，接种5g凝结芽孢杆菌BC-YJ的菌体，盖上缸盖进行37℃发酵。发酵期间，每天早晚搅动一次卤水，直至缸里生出“臭味”，倒出来即得到黑色的豆豉味臭卤水汁。
(2)浸卤豆腐块
用绿矾水浸泡：取绿矾5g，倒入开水(约25kg)并搅匀，等到开水晾凉以后，再把凉透的豆腐块放进去浸泡2h。放入卤水汁里浸泡把浸泡过的豆腐块捞出来，用清水漂洗一遍后控净水，随后再放入卤水汁里。接下来浸泡的时间会因不同的季节而有所差异。春秋季节可浸泡5h，夏季浸泡2h。冬季则需浸泡8h左右。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，已于2021年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021431。
2.含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中凝结芽孢杆菌的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
4.一种生产臭豆腐风味物质的方法，其特征在于，将权利要求1所述凝结芽孢杆菌接种至NA培养基进行培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在35～40℃下培养不少于24h。
6.一种制备臭卤水汁的方法，其特征在于，将制备卤水汁的原料混匀，加入权利要求1所述所述凝结芽孢杆菌或权利要求2所述微生物菌剂，进行发酵，发酵后得到的液体即为臭卤水汁。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，先用清水将豆豉煲煮约40～50min后，将豆豉过滤得豆豉汁；在豆豉汁中放入75～100g纯碱、2～5g绿矾、2000～3500g水发香菇、2000～3500g冬笋、500～750g精盐、100～150g白酒放入豆豉汁中，再加入嫩豆腐搅碎调匀，接种所述凝结芽孢杆菌，在35～40℃下发酵，至产生臭味为止，得到的液体即为臭卤水汁。
8.一种制备臭豆腐的方法，其特征在于，将豆腐块放入权利要求6或7所述方法制备得到的臭卤水汁中浸泡2～8h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述豆腐块先在含有绿矾的溶液中浸泡2～3h，将浸泡过后的豆腐洗净放入臭卤水汁中浸泡2～8h。
10.权利要求1所述凝结芽孢杆菌，或权利要求2所述微生物菌剂在制备臭豆腐或生产臭豆腐风味物质中的应用。
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