CN112553120A - 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用 - Google Patents

一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112553120A
CN112553120A CN202011559576.3A CN202011559576A CN112553120A CN 112553120 A CN112553120 A CN 112553120A CN 202011559576 A CN202011559576 A CN 202011559576A CN 112553120 A CN112553120 A CN 112553120A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
escherichia coli
polysialic acid
solution
seed culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011559576.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112553120B (zh
Inventor
张天萌
刘英杰
戚明
刘金钊
王景
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd
Bloomage Biotech Co Ltd
Original Assignee
Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bloomage Biotech Co Ltd filed Critical Bloomage Biotech Co Ltd
Priority to CN202011559576.3A priority Critical patent/CN112553120B/zh
Publication of CN112553120A publication Critical patent/CN112553120A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112553120B publication Critical patent/CN112553120B/zh
Priority to PCT/CN2021/136947 priority patent/WO2022135173A1/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用。本发明自行筛选了一株聚唾液酸生产效率和产量均较高的大肠埃希氏菌，采用该菌株生产聚唾液酸时，不仅能缩短生产时间，降低生产成本，还能得到较高产量的聚唾液酸，具有很好的工业应用前景。

Description

一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用
技术领域
本发明涉及一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用，还涉及一种采用该菌种提高聚唾液酸产量的发酵工艺，属于生物发酵技术领域。
背景技术
聚唾液酸（Polysialic acid，PSA）是以N-乙酰神经氨酸为单体，以α-2,8和/或α-2,9糖苷键连接的线性聚合物。PSA是以荚膜的形式存在于一些哺乳动物和致病性细菌细胞表面的糖蛋白和糖脂糖链末端，可用作蛋白药物的缓释材料和神经修复手术中的支架材料。
目前，生产聚唾液酸的方法只有微生物发酵法。随着近几年聚唾液酸在医药领域应用潜力的不断发现，细菌合成聚唾液酸的文献和报道逐渐增多，提高聚唾液酸的发酵水平的研究也逐步开展。报道的聚唾液酸的产量大多集中在10g/L左右，难以满足市场需求，因此提高聚唾液酸的发酵水平是高校和企业的研究方向。
此外，现阶段微生物发酵法制备聚唾液酸的发酵时间也较长，例如江苏集萃工业生物技术研究有限公司经7个批次连续发酵130h，实现聚唾液酸总产量为48.1g/L，但长时间的连续发酵增加了企业生产成本。专利CN 111733092 A提供了一种发酵法生产多聚唾液酸的方法，该方法连续发酵20h得到的聚唾液酸的产量为10g/L，单位时间发酵速度为0.5g/L·h。这一方法缩短了生产时间，降低了成本，但是发酵过程中有一半的时间都是通入纯氧，一方面增加了生产成本，更重要的是增加了企业生产的安全隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌种发酵生产聚唾液酸时，经过验证具有较快的发酵速度和较高的发酵总产量，解决了现有技术中发酵生产聚唾液酸存在的发酵水平不稳定、聚唾液酸产量低、发酵时间长的问题。
本发明提供了一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，该菌株已于2019年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2019900。
进一步的，本发明菌株是从土壤中筛选得到，经过鉴定，该菌株的16Sr DNA序列如SEQ ID NO：1所示，分类命名及拉丁学名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
本发明还提供了上述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCCNO：M2019900在生产聚唾液酸中的应用，该菌株能够提高聚唾液酸的生产效率，提高聚唾液酸的总产量，具有很好的工业化应用前景。
本发明提供了一种生产聚唾液酸的方法，该方法以上述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900为菌种发酵生产聚唾液酸。
进一步的，在使用上述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCCNO：M2019900进行发酵生产时，所用的工艺方法和条件可以从现有技术中公开和普通使用的工艺方法和条件中进行选择。
进一步的，本发明提供了一种优选的生产聚唾液酸的方法，在发酵时，将种子液接种至发酵培养基中，进行初始发酵，待糖分耗尽时，流加糖分继续发酵，直至发酵结束。
优选的，所用发酵培养基为：玉米浆干粉 8-12g/L，磷酸二氢钾 5-10g/L，一水葡萄糖 （单独灭菌）25-35g/L，硫酸镁 0.5-1.5g/L，维生素溶液（过膜除菌）0.8-1.2mL/L，微量元素溶液（过膜除菌）0.8-1.2mL/L，水余量。其中，维生素溶液中各成分及组成为：硫胺素0.3-0.7 g/L，泛酸钙 2.8-3.6 g/L，生物素0.004-0.008 g/L，水余量。微量元素溶液中各成分及组成为：FeSO4·7H20 40-60g/L，MnSO4·H2O 6-8g/L，CuSO4·5H20 1-1.5g/L，ZnSO4·7H2O 7-10g/L，水余量。
进一步的，当糖分耗尽时，发酵罐中溶氧和pH明显上升。溶氧和pH明显上升指的是，达到某一发酵时间时，溶氧和pH与前一发酵时间相比有梯度式上升，上升在5%以上。
进一步的，在发酵0-20h时，控制体系pH为7-7.5，发酵20h之后，控制体系pH为6.2-6.5。
进一步的，整个发酵期间保持发酵温度为35-37℃。
进一步的，待糖分耗尽时，以8-15g/L·h的速率补加60-75wt%的葡萄糖溶液，以流加的方式补加。从开始流加糖分时计，再发酵24-27h。
进一步的，从发酵起始到流加糖分之间的初始发酵阶段，控制搅拌转速为400-500rpm，通气量为1.5-2vvm。待流加糖分后，调整搅拌转速和通气量保持溶氧量为发酵刚开始（即发酵起始时间）时溶氧量的20-50%。
进一步的，种子液可以采用菌种活化和种子培养的方式获得，步骤为：
a.将大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900接种至一级种子培养基中，35-37℃、200-220rpm下培养16-18h，得到一级种子培养液；
b. 将一级种子培养液接种至二级种子培养基中，35-37℃、200-220rpm下培养6-8h，得到二级种子培养液，即种子液。
进一步的，所述一级种子培养基和二级种子培养基的成分均为：胰蛋白胨 8-12g/L，酵母提取物 4-6g/L，氯化钠 8-12g/L，水余量。
在本发明某一具体实施方式中，提供了一种具体的聚唾液酸生产方法，如下：
（1）菌种活化
取保藏的大肠埃希氏菌（保藏编号为CCTCC NO：M2019900），接种至含有50mL的一级种子培养基中，35-37℃，200-220rpm培养16-18h，得到一级种子培养液。
（2）种子培养
取1-2mL一级种子培养液，接种至含有100-200mL的二级种子培养基中，35-37℃，200-220rpm培养6-8h，得到二级种子培养液。
（3）发酵
取二级种子培养液，按照5-8wt%的接种量，接种至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行初始发酵，待溶氧和pH明显上升时，以8-15g/L·h的速率补加糖分，继续发酵24-27h；发酵0-20h时控制pH为7.2，发酵20h之后控制pH为6.4；在流加糖分之前的初始发酵阶段，设置转速为500rpm、通气量为2vvm；在流加糖分后，调节转速和通气量，控制溶氧为发酵最初时间（发酵最开始时间）溶氧量的20%-50%。
本发明还提供了一种生产唾液酸的方法，该方法包括将聚唾液酸转化为唾液酸的步骤。所述聚唾液酸按照上述生产聚唾液酸的方法制得。
在得到聚唾液酸后，根据现有技术中公开的方式，将聚唾液酸转化为唾液酸。例如，可以将聚唾液酸通过酸水解或酶水解转化为唾液酸。具体的操作方式可以参照现有技术中报道的方法。
在本发明某一具体实施方式中，公开了一种聚唾液酸转化为唾液酸的方法，具体如下：
（1）微滤：将大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900发酵得到的聚唾液酸发酵液用陶瓷膜进行微滤除菌；
（2）超滤：使用超滤膜进行超滤，除去小分子杂质和盐分，得到浓缩液，浓缩液中聚唾液酸的浓度保持30g/L以上；
（3）水解：调节浓缩液pH为1.5，83℃水解4-8h，加碱中和至pH 5.5以上，然后过滤；
（4）纳滤：脱色后使用纳滤膜进行浓缩，进一步除去杂质和盐分，收集浓缩液；
（5）蒸发浓缩：56℃下将浓缩液浓缩至唾液酸浓度为450-600g/L；
（6）结晶：调节上述步骤（5）中溶液pH为1.2-1.5之间，0-4℃结晶12-24h；
（7）洗涤干燥：结晶后分离晶体，洗涤，干燥，得唾液酸产品。
本发明具有以下有益效果：
本发明自行筛选了一株聚唾液酸生产效率和产量均较高的大肠埃希氏菌，采用该菌株生产聚唾液酸时，不仅能缩短生产时间，降低生产成本，还能得到较高产量的聚唾液酸，具有很好的工业应用前景。
微生物保藏信息
大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，已于2019年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2019900。
附图说明
图1为本发明实施例2-6和对比例1在不同发酵时间下聚唾液酸含量曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下述实施例中，如无特别说明，所述浓度均为质量百分浓度。
下述实施例中，发酵液中聚唾液酸的含量采用间苯二酚法测得，步骤如下：
1.R-试剂的配制：准确称量0.2g间苯二酚溶于10mL水中，并加入80mL浓盐酸和0.25mL 0.1mol/L的硫酸铜溶液，用去离子水定容至100mL。
2.标准曲线的绘制：分别吸取0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2mL，1.4 mL，1.6 mL，1.8mL的100mg/L的标准聚唾液酸溶液于比色管中，加水至2.0mL，加入2.0mL R-试剂，沸水浴15min，流水冷却后加入5mL 正戊醇，剧烈振荡后冷水浴冷却10min，1000rpm离心5min，将有机相转入比色皿中，以水作对照，在580nm处测光密度，绘制聚唾液酸浓度与光密度的标准曲线。
3、样品分析：取一定量的发酵液稀释m倍，用0.22微米滤膜过滤后，吸取2mL于比色管中，加入2.0mL R-试剂，按照步骤2的方法测光密度，测得的光密度由标准曲线查算出样品中聚唾液酸量为n，按照下式得出发酵液中聚唾液酸的含量：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例1：菌株筛选和鉴定
1、初筛：称取10g土壤于500mL烧杯中，加入200mL生理盐水溶解，5000rpm离心10min，取上层清液梯度稀释103-104倍，分别取200L涂布到结晶紫中性红胆盐琼脂培养基平板上，放置培养箱中37℃培养18-20h。
2、复筛：挑选结晶紫中性红胆盐琼脂培养基上为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环的菌落制备成菌悬液，将其按照一定比例接入发酵培养基中37℃培养36h，采用间苯二酚法检测聚唾液酸含量，选取吸光值大的菌种作为目标菌种，命名为H03A2190830。
发酵培养基配方：玉米浆干粉 8g/L，磷酸二氢钾 5g/L，硫酸镁 0.5g/L，一水葡萄糖 25g/L，微生素溶液1mL/L，微量元素溶液1mL/L。其中，微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O40g/L，MnSO4·H2O 6g/L，CuSO4·5H20 1g/L，ZnSO4·7H20 7g/L；维生素溶液组成为：硫胺素0.3g/L，泛酸钙 2.8g/L，生物素 0.004g/L。
3、鉴定：将得到的目标菌种H03A2190830送至中国典型微生物保藏中心进行鉴定，其16Sr DNA序列如SEQ ID NO：1所示，分类命名及拉丁学名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。
实施例2
1、取保藏的大肠埃希氏菌（保藏编号 CCTCC NO: M2019900），接种于50mL液体LB培养基中，200rpm，37℃培养18h，得到一级种子培养液。液体LB培养基配方：酵母提取物5g/L，氯化钠 10g/L，蛋白胨 10g/L；pH为7.2。
2、取2mL一级种子培养液接种于200mL液体LB培养基，200rpm，37℃培养6h，得到二级种子培养液。液体LB培养基配方：酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，蛋白胨 10g/L；pH为7.2。
3、将200mL二级种子培养液接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行发酵制备聚唾液酸；发酵培养基配方：玉米浆干粉 8g/L，磷酸二氢钾 5g/L，硫酸镁 0.5g/L，一水葡萄糖 25g/L，维生素溶液1mL/L和微量元素溶液1mL/L。微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O40g/L，MnSO4·H2O 6g/L，CuSO4·5H20 1g/L，ZnSO4·7H20 7g/L；维生素溶液组成为：硫胺素0.3g/L，泛酸钙 2.8g/L，生物素 0.004g/L。
4、发酵温度控制在37℃，发酵0-20h时使用22%氨水控制发酵罐内pH为7.2，发酵20h后控制发酵罐内pH为6.4。在流加葡萄糖以前，设置搅拌转速为500rpm，通气量为2vvm，待发酵6h左右时，溶氧和pH出现明显上升。此时，以12g/L·h的速率补加75%的一水葡萄糖，维持7h，然后以8 g/L·h的速率补加75%的一水葡萄糖，至发酵结束；流加葡萄糖后，调整转速和通气量控制溶氧量为最开始发酵时的初始溶氧的20-50%。
发酵培养33h后进行放罐，检测聚唾液酸含量。
实施例3
按照实施例2的方法生产聚唾液酸，不同的是：发酵培养基配方：玉米浆干粉 10g/L，磷酸二氢钾 7g/L，硫酸镁 1g/L，一水葡萄糖 30g/L，维生素溶液1mL/L和微量元素溶液1mL/L。微量元素溶液组成为： FeSO4·7H2O 50g/L，MnSO4·H2O 7g/L，CuSO4·5H20 1.25g/L，ZnSO4·7H20 9g/L；维生素溶液组成为：硫胺素 0.5g/L，泛酸钙 3.2g/L，生物素 0.006g/L。
发酵培养33h后进行放罐，检测聚唾液酸含量。
实施例4
按照实施例2的方法生产聚唾液酸，不同的是：发酵培养基配方：玉米浆干粉 12g/L，磷酸二氢钾 10g/L，硫酸镁 1.5g/L，一水葡萄糖 35g/L，维生素溶液1mL/L和微量元素溶液1mL/L。微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O 60g/L，MnSO4·H2O 8g/L，CuSO4·5H20 1.5g/L，ZnSO4·7H20 9g/L；维生素溶液组成为：硫胺素 0.7g/L，泛酸钙 3.6g/L，生物素 0.008g/L。
发酵培养33h后进行放罐，检测聚唾液酸含量。
实施例5
按照实施例2的方法生产聚唾液酸，不同的是：待溶氧和pH出现明显上升时，以15g/L·h的速率补加75%的一水葡萄糖，维持7h，然后速率改为10g/L·h，至发酵结束。发酵培养33h后进行放罐，检测聚唾液酸含量。
实施例6
按照实施例2的方法生产聚唾液酸，不同的是：发酵培养30h后进行放罐，检测聚唾液酸含量。
对比例1
参照专利CN 111733092 A中实施例1的方法生产聚唾液酸，不同的是，使用本发明大肠埃希氏菌CCTCC NO: M2019900。步骤为：
（1）所用的基础培养基为葡萄糖25g/L，硫酸铵5g/L，酪蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾20g/L，硫酸镁0.4g/L，混合均匀后，通蒸汽灭菌。至121℃后，维持罐压0 .09MPa，灭菌30 分钟。灭菌过程需用200rpm 连续搅拌。待冷却后，将2ml大肠埃希氏菌CCTCC NO: M2019900种子液接种到200ml基础培养基中，37℃培养12 小时获得种子培养液。
（2）将200ml种子培养液接种于3L含上述基础培养基的发酵罐中，通空气，采用氨水将pH控制在6.6-6 .8，37℃下进行发酵培养，并流加碳源。
（3）在接种种子培养液后开始流加葡萄糖，前6小时流加速度维持葡萄糖在发酵液中的浓度为2-3克/升，发酵温度37℃，用质量百分比浓度为25%氨水将pH控制在6.6-6.8，6小时后，通纯氧，纯氧与空气体积比为0.75：1，温度仍然控制在37℃，pH控制在6 .6-6 .8；10小时后，纯氧与空气体积比为1：1，pH控制为6 .3-6 .5，温度由37℃降为34℃；在6小时到发酵12小时流加速度维持葡萄糖在发酵液中的浓度为5-8克/升；从12小时起开始降低糖浓度，使葡萄糖在发酵液中的浓度为2-3克/升，17小时后停加葡萄糖；发酵17小时后采用质量百分比浓度为0 .5%的Ca(OH)2溶液调节pH 值8 .0-8 .5，停止搅拌，并降温至20℃，此时停止纯氧，改用无菌空气，维持通气2小时，到20小时结束发酵过程。
发酵结束后，检测聚唾液酸含量。
在实施例2-6和对比例1的发酵过程中，每隔一段时间取固定的发酵液，对其中的聚唾液酸含量进行检测，结果如图1所示。从图中可以看出，随着发酵时间的延长，聚唾液酸的含量不断提高。
实施例2-6及对比例1所得聚唾液酸含量如下表1所示。
Figure 637733DEST_PATH_IMAGE002
从表1可以看出，使用实施例3的发酵培养基时，聚唾液酸的含量更高，发酵速度最快。从对比例1的数据与专利CN 111733092 A中数据对比可以看出，在同等的发酵条件和发酵时间下，本发明大肠埃希氏菌产聚唾液酸的速度和总产量明显提高，效果优于专利CN111733092 A中的菌种。从实施例和对比例1的数据对比可以看出，本发明工艺方法也具有一定的提高生产速度的作用。
序列表
<110> 华熙生物科技股份有限公司
<120> 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1477
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli H03A2190830 CCTCC NO：M2019900)
<400> 1
gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa gtcgaacggt 60
aacaggaaac agcttgctgt ttcgctgacg agtggcggac gggtgagtaa tgtctgggaa 120
actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat aatgtcgcaa 180
gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcggatg tgcccagatg ggattagcta 240
gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga ggatgaccag 300
ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 360
acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtatg aagaaggcct tcgggttgta 420
aagtactttc agcggggagg aagggagtaa agttaatacc tttgctcatt gacgttaccc 480
gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag ggtgcaagcg 540
ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca gatgtgaaat 600
ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctga tactggcaag cttgagtctc gtagaggggg 660
gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag 720
gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 780
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg aggttgtgcc cttgaggcgt 840
ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac 900
tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac 960
gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cagaactttc cagagatgga ttggtgcctt 1020
cgggaactgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt 1080
taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggtccggc cgggaactca 1140
aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1200
ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg acctcgcgag 1260
agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1320
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacact tttctgtcac accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc 1440
ttcgggaggg cgcttaccac tttgtgattc atgactg 1477

Claims (10)

1.一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，其特征是：保藏号为CCTCCNO：M2019900。
2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，其特征是：其16Sr DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1或2所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900在生产聚唾液酸中的应用。
4.一种生产聚唾液酸的方法，其特征是：以权利要求1或2所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900为菌种发酵生产聚唾液酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：发酵时，将种子液接种至发酵培养基中，进行初始发酵，待糖分耗尽时，流加糖分继续发酵，直至发酵结束；所述发酵培养基为：玉米浆干粉 8-12g/L，磷酸二氢钾 5-10g/L，一水葡萄糖25-35g/L，硫酸镁 0.5-1.5g/L，维生素溶液0.8-1.2mL/L，微量元素溶液0.8-1.2mL/L，水余量；其中，维生素溶液中各成分及组成为：硫胺素 0.3-0.7 g/L，泛酸钙 2.8-3.6 g/L，生物素0.004-0.008 g/L；微量元素溶液中各成分及组成为：FeSO4·7H20 40-60g/L，MnSO4·H2O 6-8g/L，CuSO4·5H20 1-1.5g/L，ZnSO4·7H2O 7-10g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：发酵0-20h时，控制体系pH为7-7.5，发酵20h之后，控制体系pH为6.2-6.5；整个发酵时间保持温度为35-37℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征是：以8-15g/L·h的速率流加60-75wt%的葡萄糖溶液；优选的，流加糖分后，再发酵24-27h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征是：在流加糖分前的初始发酵阶段，搅拌转速为400-500rpm，通气量为1.5-2vvm；待流加糖分后，调整搅拌转速和通气量保持溶氧量为发酵起始时溶氧量的20%-50%。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征是：种子液的获取方式为：
a.将大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900接种至一级种子培养基中，35-37℃、200-220rpm下培养16-18h，得到一级种子培养液；
b. 将一级种子培养液接种至二级种子培养基中，35-37℃、200-220rpm下培养6-8h，得到二级种子培养液，即种子液；
所述一级种子培养基和二级种子培养基的成分均为：胰蛋白胨 8-12g/L，酵母提取物4-6g/L，氯化钠 8-12g/L，水余量。
10.一种生产唾液酸的方法，包括将聚唾液酸转化为唾液酸的步骤，其特征是：所述聚唾液酸按照权利要求4-9中任一项所述的生产聚唾液酸的方法制得。
CN202011559576.3A 2020-12-25 2020-12-25 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用 Active CN112553120B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011559576.3A CN112553120B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用
PCT/CN2021/136947 WO2022135173A1 (zh) 2020-12-25 2021-12-10 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011559576.3A CN112553120B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112553120A true CN112553120A (zh) 2021-03-26
CN112553120B CN112553120B (zh) 2021-09-14

Family

ID=75034225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011559576.3A Active CN112553120B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112553120B (zh)
WO (1) WO2022135173A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114621892A (zh) * 2021-12-17 2022-06-14 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用
WO2022135173A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 华熙生物科技股份有限公司 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用
WO2024087729A1 (zh) * 2022-10-27 2024-05-02 山东合成远景生物科技有限公司 一种产聚唾液酸的大肠埃希氏菌诱变菌株hcyj-03及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125278B (zh) * 2022-08-25 2022-11-18 山东合成远景生物科技有限公司 一种生产聚唾液酸用的补料液及聚唾液酸制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896263A (zh) * 2006-06-22 2007-01-17 江南大学 一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法
US20080153133A1 (en) * 2006-09-26 2008-06-26 Syracuse University Metabolically Engineered Escherichia Coli For Enhanced Production of Sialic Acid
CN104450978A (zh) * 2014-12-24 2015-03-25 江南大学 一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统
CN109182423A (zh) * 2018-09-26 2019-01-11 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 促进大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2049692T3 (pl) * 2006-07-13 2016-08-31 Serum Inst India Ltd Sposób wytwarzania poli(kwasu sialowego) o wysokiej czystości
CN111733092B (zh) * 2020-05-12 2023-10-31 中科鸿基生物科技有限公司 发酵法生产多聚唾液酸及其提取精制方法
CN111733101B (zh) * 2020-06-29 2023-02-10 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法
CN112553120B (zh) * 2020-12-25 2021-09-14 华熙生物科技股份有限公司 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896263A (zh) * 2006-06-22 2007-01-17 江南大学 一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法
US20080153133A1 (en) * 2006-09-26 2008-06-26 Syracuse University Metabolically Engineered Escherichia Coli For Enhanced Production of Sialic Acid
CN104450978A (zh) * 2014-12-24 2015-03-25 江南大学 一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统
CN109182423A (zh) * 2018-09-26 2019-01-11 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 促进大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MURTHY R V等: "Effect of transition metals on polysialic acid structure and functions", 《CHEM MED CHEM》 *
高霖等: "高分子质量聚唾液酸生产菌株诱变筛选及其发酵优化", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022135173A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 华熙生物科技股份有限公司 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用
CN114621892A (zh) * 2021-12-17 2022-06-14 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用
CN114621892B (zh) * 2021-12-17 2024-04-05 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用
WO2024087729A1 (zh) * 2022-10-27 2024-05-02 山东合成远景生物科技有限公司 一种产聚唾液酸的大肠埃希氏菌诱变菌株hcyj-03及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112553120B (zh) 2021-09-14
WO2022135173A1 (zh) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112553120B (zh) 一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用
CN114480173B (zh) 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-色氨酸中的应用
CN101665813A (zh) 一种l-丙氨酸的微生物发酵生产方法
CN110791462B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用
CN117210343A (zh) 一种热带假丝酵母菌及其应用、以及一种长链二元酸的生产方法
CN110564580B (zh) 一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法
CN113321580B (zh) 一种生产苹果酸的方法
CN116716231B (zh) 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产色氨酸中的应用
CN111826308B (zh) 一株海洋沉积物来源的几丁质高效降解菌及其应用
CN111748480B (zh) 一种维斯假丝酵母及其应用
CN112300953B (zh) 枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用
CN109266578B (zh) 大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用
CN113774004B (zh) 一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ-氨基丁酸的方法
CN115851848A (zh) 一种联产d-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法
CN114621892A (zh) 高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用
CN111197014B (zh) 谷氨酸棒状杆菌诱变菌株及其应用
CN109321613B (zh) 一种生产d-甘露糖的方法
CN111574390A (zh) 氨基酸高效绿色生产提取工艺
CN112852896A (zh) 一种l-精氨酸的发酵生产方法
CN116590203B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-异亮氨酸中的应用
CN116355814B (zh) 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-精氨酸中的应用
EP0972843A1 (en) Continuous fermentation process
CN116083500B (zh) 连续生产赤藓酮糖的工艺方法
CN116144516B (zh) 一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用
CN114806938B (zh) 一株在低糖环境下生产透明质酸的马链球菌兽疫亚种及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230808

Address after: Tianchen Avenue, Ji'nan hi tech Development Zone of Shandong Province, No. 678 250101

Patentee after: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd.

Patentee after: Huaxi Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd.

Address before: Tianchen Avenue, Ji'nan hi tech Development Zone of Shandong Province, No. 678 250101

Patentee before: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd.