CN117143784B - 一种分离内生菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种分离内生菌的方法，涉及内生菌培养技术领域，其步骤包括：S1、待提取玉米的培养；S2、收集含内生菌的玉米组织液；S3、内生菌的分离培养；在培养基中添加CuSO4·5H2O，铜元素促进细胞对于铁元素和钼元素的吸收，利于细胞产生固氮酶，从而提高了固氮菌的固氮能力，同时铜元素是细胞大部分酶的重要成分，提高了固氮内生菌的生存能力，加入酚红试剂，可以在固氮酶产生铵类增高ph后变红，提醒调节ph以免造成ph过高，固氮酶活性降低，且能中和五水硫酸铜的颜色。
Description
技术领域
本发明涉及内生菌培养领域，尤其涉及一种分离内生菌的方法。
背景技术
固氮微生物是指通过生命活动，将空气中游离态的氮素直接转变为含氮化合物的微生物。其中根瘤菌-豆科植物的固氮作用已广为人知，但这一过程仅限于豆科植物。如何从复杂的土壤微生物资源库中分离出可与非豆科作物共生的固氮菌株，补充作物生长发育所需的氮素，减少农业化肥施用，维持作物健康生长和产量提升，已成为新一轮农业绿色革命的重要方向。
限制非豆科作物生物固氮的瓶颈是功能菌株的宿主适应性问题。由于植物自身免疫系统的保护，并不是所有从土壤中分离获得的固氮菌均可以与宿主植物形成互利共生关系。通过长期的生物进化，植物已形成完善的多步筛选机制来控制微生物在植物根表、根内和地上部的定植，允许特定有益微生物在植物体内富集，使得作物具有更强的环境适应性和抗胁迫能力。
如中国专利公告号，CN113174346B，一种高效分离玉米内生固氮菌的方法，获得的玉米输导组织汁液，可直接用于固体培养基的涂布操作，避免了以往固体植物样品研磨等预处理对固氮菌的机械损伤和多样性下降，同时，一定量的原始玉米输导组织汁液保留在培养基上，有利于固氮菌对新培养基的适应性。
但是固氮菌代谢产生的大量有机氮，会污染培养基，影响培养效果，降低产量，且新环境固氮菌对于培养基中的营养物质吸收并不理想。
发明内容
本申请实施例通过提供一种分离内生菌的方法，解决了现有技术中固氮菌代谢产生的大量有机氮，会污染培养基，影响培养效果，降低产量的问题，利于细胞产生固氮酶，从而提高了固氮菌的固氮能力。
本申请实施例提供了一种分离内生菌的方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1、待提取玉米的培养；
S2、收集含内生菌的玉米组织液；
S3、内生菌的分离培养；
步骤S1中玉米应种植在通风良好，地势平坦的土地上，避免在雷雨天气后进行实验，至少间隔一周。
步骤S1中玉米需种植在碱性条件的土地中，土壤总有机碳含量不超过7.5g/kg，土壤总氮含量不高于1.5g/kg，土壤硝态氮含量不高于5mg/kg，可以使用各种肥料调节土壤的各类营养含量，土壤含水量不低于30%。
在S2中从玉米基部以上的第三-四节茎，除去其表面叶片后用75％酒精棉球清理表面3次以上，集液器收集玉米筛管组织中运输的有机物和活细菌。
在S3中将含内生菌的玉米组织液在实验室接种在无氮源的固体培养基上28℃培养3-4天，初步筛选出具有固氮潜力的内生菌，接着挑取初步筛选出的不同的内生菌菌落，在无氮源固体培养基上平板划线分离，继续28℃培养4天，筛选出单个菌落，再持续纯化培养3次。
所述无氮源的固体培养基的制备方法为：K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g，CuSO4·5H2O 0.5g；灭菌后的玉米组织液；葡萄糖30g；加水至1L；调节ph至7.0-7.5；后加入酚红指示剂10mg。
培养开始时，通入空气，空气中氮气占约78%，第二天，降低氮气的浓度至70%，第三天，降低氮气浓度至50%，第三天结束培养。
所述集液器包括左夹板、右夹板、取液装置、转轴、弹簧；
所述左夹板包括左握把与左夹持部；所述右夹板包括右握把与右夹持部；
所述左夹持部与右夹持部皆开有半圆形槽，当左夹持部与右夹持部闭合时，形成一个用于夹持玉米秆的圆形槽；
所述左夹板与右夹板通过转轴活动连接；
所述左握把通过弹簧与右握把连接；
所述弹簧初始状态为拉伸状态；
所述取液装置安装在左夹持部上，且取液装置从左夹持部内伸出至可夹持玉米秆的圆形槽中。
所述取液装置包括止吸囊、弹筒、连接杆、针头、隔膜、负压腔、收集囊、穿刺头；
所述穿刺头上留有集液口，所述收集囊安装在穿刺头远离集液口的一端，且与集液口连通；
所述止吸囊为中空的环状，包围在集液口外周，所述止吸囊与弹筒固定连接；当取液装置未刺入玉米秆时，止吸囊包围封闭集液口；
所述弹筒固定连接在负压腔远离止吸囊的一端；
所述负压腔内安装有隔膜；
所述连接杆一端安装在止吸囊与弹筒连接处，另一端穿过并深入负压腔内；所述连接杆伸入负压腔内的一端上固定安装有针头。
集液器还包括弹簧杆；
所述取液装置与转轴通过弹簧杆转动连接；
所述负压腔内还安装有负压囊、导轨、推送软块、滑块；
所述导轨平行安装在负压腔的侧壁上，且与负压腔之间留有空隙；
所述负压腔内安装有多个负压囊；所述负压囊一端滑动连接在负压腔的侧壁上，另一端与导轨滑动连接；
所述滑块滑动连接在负压腔靠近导轨的侧壁上。
所述滑块上安装有多个推送软块；所述动推送软块为弧形软块，弧面背对针头；所述针头在负压腔内的长度不超过负压囊的宽度当滑块带动推送软块向远离针头的方向移动时，被负压囊挤压而变形，当滑块复位带动推送软块向靠近针头的方向移动时；推送软块推动负压囊向针头移动。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
其一，在培养基中添加CuSO4·5H2O，铜元素促进细胞对于铁元素和钼元素的吸收，利于细胞产生固氮酶，从而提高了固氮菌的固氮能力，同时铜元素是细胞大部分酶的重要成分，提高了固氮内生菌的生存能力，加入酚红试剂，可以在固氮酶产生铵类增高ph后变红，提醒调节ph以免造成ph过高，固氮酶活性降低。
其二，由于固氮菌死亡后有大量有机氮泄出，影响培养基内无氮源的水平，所以减少培养时间可以减少杂菌的存活率，氮气的浓度减少为防止菌体提早自溶，也能降低后期内生菌的生长速度，以防止积累的有机氮泄出，影响培养基氮源的浓度。
其三，设置止吸囊可以防止污染，还能便于控制取液装置的启动与关闭，在停止时已经收集的液体不会泄露；整个装置仅需手动无额外动力，操作简单，结构不复杂，并可以复位重复使用，使用取液装置可以不对玉米造成巨大损伤的情况下提取组织液，负压汲取也可以提高收集量。
其四，通过弹簧杆与转轴的配合使用，可以使在更换集液的玉米秆时，针头刺破新的负压囊再次产生负压，从而可以反复使用，节省提取时间，且节省操作步骤，不需要额外操作。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明的集液器的闭合状态结构示意图；
图3为本发明的打开状态结构示意图；
图4为本发明的取液装置初始状态结构示意图；
图5为本发明的取液装置工作状态结构示意图；
图6为图4中A处放大图；
图7为实施例四的结构示意图；
图8为实施例四取液装置结构示意图；
图9为图7中B处放大图；
图10为推动时B处示意图。
图中：1、左夹板；2、右夹板；3、取液装置；4、转轴；5、弹簧；6、弹簧杆；
11、左握把；12、左夹持部；21、右握把；22、右夹持部；
31、止吸囊；32、弹筒；33、连接杆；34、针头；35、隔膜；36、负压腔；37、收集囊；38、集液口；39、穿刺头；
361、负压囊；362、推送软块；363、滑块；364、导轨。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述；附图中给出了本发明的较佳实施方式，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式；相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
需要说明的是，本文所使用的术语“垂直”、“水平”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例一
本申请一种分离内生菌的方法具体包括：
S1、待提取玉米的培养；
S2、收集含内生菌的玉米组织液；
S3、内生菌的分离培养；
步骤S1中玉米应种植在通风良好，地势平坦的土地上，避免在雷雨天气后进行实验，至少间隔一周；
S1：玉米需种植在碱性条件的土地中，土壤总有机碳含量不超过7.5g/kg，土壤总氮含量不高于1.5g/kg，土壤硝态氮含量不高于5mg/kg，可以使用各种肥料调节土壤的各类营养含量，土壤含水量不低于30%；
S2：从玉米基部以上的第四节茎，除去其表面叶片后用75％酒精棉球清理表面3次以上，同时使用75％酒精棉球擦拭修枝剪，使用集液器收集玉米筛管组织中运输的有机物和活细菌。
S3：将含内生菌的玉米组织液在实验室接种在无氮源的固体培养基上28℃培养3-4天，初步筛选出具有固氮潜力的内生菌，接着挑取初步筛选出的不同的内生菌菌落，在无氮源固体培养基上平板划线分离，继续28℃培养4天，筛选出单个菌落，再持续纯化培养3次。
无氮源的固体培养基的制备方法为：K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g，CuSO4·5H2O 0.5g；灭菌后的玉米组织液；葡萄糖30g；加水至1L；调节ph至7.0-7.5；后加入酚红指示剂10mg。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
在培养基中添加CuSO4·5H2O，铜元素促进细胞对于铁元素和钼元素的吸收，利于细胞产生固氮酶，从而提高了固氮菌的固氮能力，同时铜元素是细胞大部分酶的重要成分，提高了固氮内生菌的生存能力，加入酚红试剂，可以在固氮酶产生铵类增高ph后变红，提醒调节ph以免造成ph过高，固氮酶活性降低。
实施例二
为防止固氮菌所产出的有机氮被杂菌吸收利用，进一步进行改进。
S3：将含内生菌的玉米组织液在实验室接种在无氮源的固体培养基上28℃培养3天，初步筛选出具有固氮潜力的内生菌，接着挑取初步筛选出的不同的内生菌菌落，在无氮源固体培养基上平板划线分离，继续28℃培养4天，筛选出单个菌落，再持续纯化培养3次。
无氮源的固体培养基的制备方法为：K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g，CuSO4·5H2O 0.5g；灭菌后的玉米组织液；葡萄糖30g；加水至1L；调节ph至7.0-7.5；后加入酚红指示剂10mg，培养开始时，通入空气，空气中氮气占约78%，第二天，降低氮气的浓度至70%，第三天，降低氮气浓度至50%，第三天结束培养。
表一为不同浓度氮气下筛选出的内生菌固氮酶活性：
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
由于固氮菌死亡后有大量有机氮泄出，影响培养基内无氮源的水平，所以减少培养时间可以减少杂菌的存活率，氮气的浓度减少为防止菌体提早自溶，也能降低后期内生菌的生长速度，以防止积累的有机氮泄出，影响培养基氮源的浓度。
实施例三
为更好的收集玉米组织液，设计一种集液器。
一种集液器，包括左夹板1、右夹板2、取液装置3、转轴4、弹簧5；
所述左夹板1包括左握把11与左夹持部12；所述右夹板2包括右握把21与右夹持部22；
所述左夹持部12与右夹持部22皆开有半圆形槽，当左夹持部12与右夹持部22闭合时，形成一个可夹持玉米秆的圆形槽；
所述左夹板1与右夹板2通过转轴4连接；
所述左握把11通过弹簧5与右握把21固定连接；
所述弹簧5初始状态为拉伸状态；
所述取液装置3安装在左夹持部12上，且取液装置3从左夹持部12内伸出至可夹持玉米秆的圆形槽中；
所述取液装置3包括止吸囊31、弹筒32、连接杆33、针头34、隔膜35、负压腔36、收集囊37、穿刺头39；
所述穿刺头39上留有集液口38，所述收集囊37安装在穿刺头39远离集液口38的一端，且与集液口38连通；
所述止吸囊31为中空的环状，包围在集液口38外周，所述止吸囊31与弹筒32固定连接；当取液装置3未刺入玉米秆时，止吸囊31包围封闭集液口38；
所述弹筒32固定连接在负压腔36远离止吸囊31的一端；
所述负压腔36内安装有隔膜35；
所述连接杆33一端安装在止吸囊31与弹筒32连接处，另一端穿过并深入负压腔36内；所述连接杆33伸入负压腔36内的一端上固定安装有针头34；
工作时，手持集液器，用力握住左握把11与右握把21，使可夹持玉米秆的圆形槽变大，并套在玉米秆的既定位置上，穿刺头39穿到玉米秆内，并使集液口38位于玉米的韧皮部，而止吸囊31受玉米秆阻力留在杆外，并挤压弹筒32，连接杆33同时更多的伸入负压腔36内，并使针头34穿刺隔膜35，由于负压腔36内负压，韧皮部筛管输送的活细胞经过集液口38被吸入收集囊37中，当收集结束后将集液器拿下，止吸囊31在弹筒32的弹力下复位。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
设置止吸囊31可以防止污染，还能便于控制取液装置3的启动与关闭，在停止时已经收集的液体不会泄露；整个装置仅需手动无额外动力，操作简单，结构不复杂，并可以复位重复使用，使用取液装置3可以不对玉米造成巨大损伤的情况下提取组织液，负压汲取也可以提高收集量。
实施例四
为更好地提高利用率，增加重复利用的能力，在实施例三的基础上进一步改进。
集液器还包括弹簧杆6；
所述取液装置3与转轴4通过弹簧杆6转动连接；
所述负压腔36内还安装有负压囊361、导轨364、推送软块362、滑块363；
所述导轨364平行安装在负压腔36的侧壁上，且留有空隙；
所述负压腔36内安装有多个负压囊361；所述负压囊361，一端滑动连接在负压腔36的侧壁上，另一端与导轨364滑动连接；
所述滑块363滑动连接在负压腔36靠近导轨364的侧壁上；
所述滑块363上安装有多个推送软块362；所述动推送软块362为弧形软块，弧面背对针头34；
所述针头在负压腔内的长度不超过负压囊的宽度当滑块363带动推送软块362向远离针头34的方向移动时，被负压囊361挤压而变形，当滑块363复位带动推送软块362向靠近针头34的方向移动时；推送软块362推动负压囊361向针头34移动；
工作时，需要更换集液的玉米秆时，可夹持玉米秆的圆形槽扩大，弹簧杆6在左夹板1与转轴4的运动下拉伸；滑块363随着向远离穿刺头39的一端位移，推送软块362也随着位移，当集液器再次进行提取作业时，将集液器夹持在新的玉米秆上，此时转轴4复位，弹簧杆6随着复位，滑块363也被带动复位，推送软块362推着未被刺破的负压囊361向针头34方向移动，被刺破的负压囊361被未被刺破的负压囊361替代，当针头34刺破未被刺破的负压囊361时，负压腔36内产生负压进行新一轮的液体收集。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
通过弹簧杆6与转轴4的配合使用，可以使在更换集液的玉米秆时，针头34刺破新的负压囊361再次产生负压，从而可以反复使用，节省提取时间，且节省操作步骤，不需要额外操作。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明精神和原则内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种分离内生菌的方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1、待提取玉米的培养；
S2、收集含内生菌的玉米组织液；
S3、内生菌的分离培养；
步骤S1中玉米应种植在通风良好，地势平坦的土地上，避免在雷雨天气后进行实验，至少间隔一周；玉米需种植在碱性条件的土地中，土壤总有机碳含量不超过7.5g/kg，土壤总氮含量不高于1.5g/kg，土壤硝态氮含量不高于5mg/kg，可以使用各种肥料调节土壤的各类营养含量，土壤含水量不低于30%；
步骤S2中从玉米基部以上的第三-四节茎，除去其表面叶片后用75％酒精棉球清理表面3次以上，集液器收集玉米筛管组织中运输的有机物和活细菌；
步骤S3中将含内生菌的玉米组织液在实验室接种在无氮源的固体培养基上28℃培养3-4天，初步筛选出具有固氮潜力的内生菌，接着挑取初步筛选出的不同的内生菌菌落，在无氮源固体培养基上平板划线分离，继续28℃培养4天，筛选出单个菌落，再持续纯化培养3次；
培养开始时，通入空气，空气中氮气占78%，第二天，降低氮气的浓度至70%，第三天，降低氮气浓度至50%，第三天结束培养；
所述无氮源的固体培养基的制备方法为：K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g，CuSO4·5H2O 0.5g；灭菌后的玉米组织液；葡萄糖30g；加水至1L；调节ph至7.0-7.5；后加入酚红指示剂10mg。
2.如权利要求1所述的一种分离内生菌的方法，其特征在于，所述集液器包括左夹板（1）、右夹板（2）、取液装置（3）、转轴（4）、弹簧（5）；
所述左夹板（1）包括左握把（11）与左夹持部（12）；所述右夹板（2）包括右握把（21）与右夹持部（22）；
所述左夹持部（12）与右夹持部（22）皆开有半圆形槽，当左夹持部（12）与右夹持部（22）闭合时，形成一个用于夹持玉米秆的圆形槽；
所述左夹板（1）与右夹板（2）通过转轴（4）活动连接；
所述左握把（11）通过弹簧（5）与右握把（21）连接；
所述弹簧（5）初始状态为拉伸状态；
所述取液装置（3）安装在左夹持部（12）上，且取液装置（3）从左夹持部（12）内伸出至可夹持玉米秆的圆形槽中。
3.如权利要求2所述的一种分离内生菌的方法，其特征在于，所述取液装置（3）包括止吸囊（31）、弹筒（32）、连接杆（33）、针头（34）、隔膜（35）、负压腔（36）、收集囊（37）、穿刺头（39）；
所述穿刺头（39）上留有集液口（38），所述收集囊（37）安装在穿刺头（39）远离集液口（38）的一端，且与集液口（38）连通；
所述止吸囊（31）为中空的环状，包围在集液口（38）外周，所述止吸囊（31）与弹筒（32）固定连接；当取液装置（3）未刺入玉米秆时，止吸囊（31）包围封闭集液口（38）；
所述弹筒（32）固定连接在负压腔（36）远离止吸囊（31）的一端；
所述负压腔（36）内安装有隔膜（35）；
所述连接杆（33）一端安装在止吸囊（31）与弹筒（32）连接处，另一端穿过并深入负压腔（36）内；所述连接杆（33）伸入负压腔（36）内的一端上固定安装有针头（34）。
4.如权利要求3所述的一种分离内生菌的方法，其特征在于，集液器还包括弹簧杆（6）；
所述取液装置（3）与转轴（4）通过弹簧杆（6）转动连接；
所述负压腔（36）内还安装有负压囊（361）、导轨（364）、推送软块（362）、滑块（363）；所述导轨（364）平行安装在负压腔（36）的侧壁上，且与负压腔（36）之间留有空隙；
所述负压腔（36）内安装有多个负压囊（361）；所述负压囊（361）一端滑动连接在负压腔（36）的侧壁上，另一端与导轨（364）滑动连接；
所述滑块（363）滑动连接在负压腔（36）靠近导轨（364）的侧壁上。
5.如权利要求4所述的一种分离内生菌的方法，其特征在于，所述针头（34）在负压腔（36）内的长度不超过负压囊（361）的宽度。
6.如权利要求5所述的一种分离内生菌的方法，其特征在于，所述滑块（363）上安装有多个推送软块（362）；所述推送软块（362）为弧形软块，弧面背对针头（34）；当滑块（363）带动推送软块（362）向远离针头（34）的方向移动时，被负压囊（361）挤压而变形，当滑块（363）复位带动推送软块（362）向靠近针头（34）的方向移动时；推送软块（362）推动负压囊（361）向针头（34）移动。
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