CN113174346B - 一种高效分离玉米内生固氮菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效分离玉米内生固氮菌的方法，属于微生物领域。本发明利用氮供应不充足条件下玉米对固氮菌的选择性富集效应，在无需外部动力条件下，利用玉米根压作用快速获得包含丰富固氮菌资源的玉米输导组织汁液，并通过对输导组织汁液的两次分离培养，最大限度保持了样本中微生物的种类和活性。本发明借助植物自身的选择富集机制，能够快速筛选到与宿主作物互利共生的高效内生固氮菌株，有效提高了固氮菌的筛选效率，操作简单，时效性好，是一种轻简、快捷、高效的固氮菌分离培养技术。

Description

一种高效分离玉米内生固氮菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种高效分离玉米内生固氮菌的方法。

背景技术

固氮微生物是指通过生命活动，将空气中游离态的氮素直接转变为含氮化合物的微生物。其中根瘤菌-豆科植物的固氮作用已广为人知，但这一过程仅限于豆科植物。如何从复杂的土壤微生物资源库中分离出可与非豆科作物共生的高效固氮菌株，补充作物生长发育所需的氮素，减少农业化肥施用，维持作物健康生长和产量提升，已成为新一轮农业绿色革命的重要方向。

限制非豆科作物高效生物固氮的瓶颈是功能菌株的宿主适应性问题。由于植物自身免疫系统的保护，并不是所有从土壤中分离获得的固氮菌均可以与宿主植物形成互利共生关系。通过长期的生物进化，植物已形成完善的多步筛选机制来控制微生物在植物根表、根内和地上部的定植，允许特定有益微生物在植物体内富集，使得作物具有更强的环境适应性和抗胁迫能力。

目前，内生固氮菌的分离培养方法主要包括两类：1)从土壤等环境样品中直接分离筛选，该类方法由于筛选过程不涉及植物活体，没有考虑固氮菌宿主适应性问题，导致大部分获得的菌株在实际应用过程中不能与宿主作物形成良好的互利共生关系，应用效果不佳；2)从植物某一器官或组织中收集筛选，该类方法筛选的材料尽管是植物体，但属于静态地从单一部位取样，没有考虑植物自身对有益微生物的富集效应，同时需要对固体植物样本进行研磨提取等繁琐操作，无法第一时间完成分离培养，导致时效性差、筛选效率低。

目前，尚缺少一种高效分离玉米内生固氮菌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效分离玉米内生固氮菌的方法，以解决上述现有技术存在的问题。该方法借助植物自身的选择富集机制，能够快速筛选到与宿主作物互利共生的高效内生固氮菌株，有效提高了固氮菌的筛选效率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案之一，提供了一种分离玉米内生固氮菌的方法，具体步骤包括：

采集低肥力土壤生长的玉米植株的输导组织汁液，分离筛选得到玉米内生固氮菌；所述低肥力土壤总有机碳含量不超过7.5g/kg，土壤全氮含量不超过1.6g/kg，土壤硝态氮含量不超过6mg/kg。

低肥力土壤由于无机氮素供应不充足，玉米将充分利用内生菌的固氮作用，从土壤中选择性地富集固氮菌等有益微生物。其输导组织汁液包含丰富固氮菌资源，对其进行分离筛选，即可快速高效得到玉米内生固氮菌。

优选的，所述低肥力土壤当季未施加氮肥。

优选的，所述低肥力土壤质量含水量大于10％，不超过20％。

土壤质量含水量可以通过自然降雨和人工浇水来控制，但降雨或浇水48小时后方可取样。土壤含水量过高使得输导组织汁液过多，存在稀释效应，降低筛选效率，同时土壤含水量过高使得田间操作难度增加，增加污染风险；土壤含水量过低则无法获得充足的输导组织汁液，影响下一步的固氮菌筛选。

优选的，所述玉米植株为生育期处于大喇叭口期至开花期的玉米植株。

优选的，所述输导组织汁液的采集方法为：截断玉米第三节茎，将收集装置连接在截断处进行采集。

其中第三节玉米茎是指茎基部向上数的第三节，茎截断可以使用修枝剪等工具，保证茎横切面的平整；收集装置可以为含有无菌脱脂棉球的无菌袋，或者其他任何无菌容器。收集装置开口需安装在茎截断处2厘米以下并紧密贴合，防止外界杂菌进入。

尽管玉米地上部被去除，但保留了完整的根系和部分茎，剩余的玉米组织在24小时内仍然保持生物活性，在玉米自身根压作用下，根系吸收的水分以及玉米细胞液、组织液、固氮菌等物质通过茎部输导组织向上运输，被无菌袋中的脱脂棉球收集，此过程无需外部动力辅助。

本步骤还可包含空白对照：即将一根长30厘米，直径为3.5厘米的无菌不锈钢圆柱体插入地下5厘米，模拟截断后的玉米秸秆，圆柱体为实心或两侧封闭，在圆柱体上端安装含有无菌水的收集装置，模拟玉米输导组织汁液采集。其余操作及分离筛选步骤均与正常的玉米输导组织汁液采集和固氮菌分离纯培养操作完全相同。

优选的，所述输导组织汁液的采集时间不超过8小时。

优选的，所述输导组织汁液开始采集的最佳时间为每日上午的5:30-8:00。

优选的，所述的分离筛选方法为：首先将所述的输导组织汁液在野外条件下于筛选培养基上涂布进行第一次筛选，再在实验室中使用所述的输导组织汁液第二次筛选，两次筛选获得的菌株进行nifH基因PCR鉴定，得到潜在固氮菌；所述潜在固氮菌进行固氮酶活性测定，判断其是否为固氮菌。

其中第二次筛选根据野外条件下培养结果优化筛选条件，优化标准为：选取第一次野外接种的四类不同碳源无氮(或低氮)培养基中菌落最多的一类培养基作为第二次实验室接种的培养基；并根据该培养基在第一次野外接种后的菌落密度，确定输导组织汁液稀释倍数，利用无菌水进行稀释，使得最后每个固体培养基上的菌落数在100个以内。

第一次野外培养基中接种的微生物最大限度保持了样本中微生物的种类和活性，而第二次实验室接种根据第一次野外接种的相关信息对稀释倍数和培养基种类进行了优化，对潜在固氮菌株进一步筛选。整体上，通过对输导组织汁液的两次分离培养，最大限度保持了样本中微生物的种类和活性，缩短了分离筛选的时间，提高了筛选效率。

优选的，所述的筛选培养基为无氮或低氮培养基。

优选的，所述的无氮培养基为DN固体无氮培养基、Ashby固体无氮培养基或Jensen固体无氮培养基；所述的低氮培养基为CCM固体低氮培养基。

本发明公开了以下技术效果：

1.与以往技术相比，本方法充分利用了低氮胁迫下玉米固氮菌选择富集效应。玉米植株类似于一个“过滤系统”，将土壤中大量能与自身互利共生的固氮菌富集到体内，并通过输导组织向地上部运输，突破了以往固氮菌筛选的盲目性。

2.本方法进一步利用玉米自身的根压作用，在无需外部动力条件下，从玉米茎横切面连续不断地获得包含丰富固氮菌的输导组织汁液。因此，本方法具有轻简、快捷、高效等优点，可操作性强，极大地提高了时效性和筛选效率。

3.本方法获得的玉米输导组织汁液，可直接用于固体培养基的涂布操作，避免了以往固体植物样品研磨等预处理对固氮菌的机械损伤和多样性下降，在仅有酒精灯的条件下，即可完成野外培养基接种，最大限度保证了样本中固氮微生物的原始状态和活性；同时，一定量的原始玉米输导组织汁液保留在培养基上，有利于固氮菌对新培养基的适应性。

4.本方法设置第一次野外小棉球接种培养和第二次实验室接种培养，两次接种培养是相互补充关系，第一次野外接种培养基最大限度保持了样本中微生物的种类和活性，同时也为第二次实验室分离培养提供了优化条件；第二次实验室接种培养是对第一次野外小棉球接种培养的进一步补充和完善。二次接种缩短了优化筛选的时间，提高了工作效率。

5.本方法在整个过程中设置了双时间节点的杂菌污染风险防控措施，通过两次污染验证保证了本方法的可靠性。当空白操作的第一次野外小棉球接种培养基出现杂菌时，表明野外操作过程存在污染，所有样品均不可用；当空白操作的第一次野外小棉球接种培养基无杂菌，而第二次实验室接种培养基出现杂菌，表明玉米输导组织汁液运输途径和实验室操作阶段存在污染，本方法仅利用第一次野外小棉球接种培养基样品进行固氮菌筛选；当空白操作的第一次野外小棉球接种培养基和第二次实验室接种培养基均无杂菌，表明所有操作过程不存在污染，所有样品均可用。

6.本方法在我国山东、河南、江西和湖南四省进行玉米内生固氮菌分离筛选试验，显示出极高的固氮菌筛选效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为玉米输导组织汁液收集过程图；

图2为部分DN固体无氮培养基微生物生长情况；

图3为潜在固氮菌nifH基因PCR检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

本发明所使用的材料、方法及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。

实施例1

本实施例于2019年6月～2020年8月分别在湖南省祁阳县、江西省进贤县、河南省原阳县和山东省禹城县等四个地点进行玉米内生固氮菌分离筛选。其中湖南省祁阳县和江西省进贤县种植制度为南方红壤小麦-玉米轮作或玉米连作体系，河南省原阳县和山东省禹城县为华北平原潮土小麦-玉米轮作体系。

选择标准为：选取在低肥力土壤上生长的、生育期处于大喇叭口期至开花期的玉米植株，取样时土壤质量含水量大于10％，不超过20％。

其中低肥力土壤具体是指土壤总有机碳含量不超过7.5g/kg，土壤全氮含量不超过1.6g/kg，土壤硝态氮含量不超过6mg/kg，当季玉米不使用氮肥。土壤质量含水量可以通过自然降雨和人工浇水来控制，但降雨或浇水48小时后方可取样。

为验证本方法的特点和可靠性，本实施例分别在每个地点选取符合本发明取样条件和不符合本发明取样条件的玉米植株。

1、玉米植株选择

1.1湖南省祁阳县

选取不施用氮肥玉米地块：土壤pH为5.99，土壤总有机碳含量为6.94g/kg，土壤总氮含量为1.59g/kg，土壤硝态氮含量为3.30mg/kg，玉米生长过程中不施用氮肥，此土壤满足本发明中低肥力土壤条件。

选取施用氮肥玉米地块：土壤pH为5.34，土壤总有机碳含量为10.98g/kg，土壤总氮含量为2.13g/kg，土壤硝态氮含量为3.5mg/kg，玉米开始种植时施用氮肥210kg·N/hm²，此土壤不满足本发明中低肥力土壤条件。

在上述两种土壤上各选取3棵玉米，玉米品种均为掖单13号，采样时玉米已生长79天，生育期处于开花期，输导组织汁液采样时间为上午5:30～11:30，共计6个小时。取样时不施用氮肥土壤质量含水量为18％，施用氮肥土壤质量含水量为15％。

1.2江西省进贤县

选取不施用氮肥玉米地块：土壤pH为5.52，土壤总有机碳含量为7.26g/kg，土壤总氮含量为1.43g/kg，土壤硝态氮含量为2.25mg/kg，玉米生长过程中不施用氮肥，此土壤满足本发明中低肥力土壤条件。

选取施用氮肥玉米地块：土壤pH为4.89，土壤总有机碳含量为8.09g/kg，土壤总氮含量为1.82g/kg，土壤硝态氮含量为1.56mg/kg，玉米开始种植时施用氮肥60kg·N/hm²，此土壤不满足本发明中低肥力土壤条件。

在上述两种土壤上各选取3棵玉米，玉米品种均为掖单13号，采样时玉米已生长77天，生育期处于开花期，输导组织汁液采样时间为6:00～13:00，共计7个小时。取样时不施用氮肥土壤质量含水量为17％，施用氮肥土壤质量含水量为20％。

1.3河南省原阳县

选取不施用氮肥玉米地块：土壤pH为8.75，土壤总有机碳含量为6.05g/kg，土壤总氮含量为1.37g/kg，土壤硝态氮含量为4.27mg/kg，玉米生长过程中不施用氮肥，此土壤满足本发明中低肥力土壤条件。

选取施用氮肥玉米地块：土壤pH为8.28，土壤总有机碳含量为7.17g/kg，土壤总氮含量为1.61g/kg，土壤硝态氮含量为19.06mg/kg，玉米开始种植时施用氮肥187kg·N/hm²，此土壤不满足本发明中低肥力土壤条件。

在上述两种土壤上各选取3棵玉米，玉米品种均为浚单20，采样时玉米已生长67天，生育期处于抽雄期，输导组织汁液采样时间为8:00～14:30，共计6.5个小时。取样时不施用氮肥土壤质量含水量为16％，施用氮肥土壤质量含水量为14％。

1.4山东省禹城县

选取不施用氮肥玉米地块：土壤pH为9.20，土壤总有机碳含量为6.38g/kg，土壤总氮含量为1.56g/kg，土壤硝态氮含量为3.53mg/kg，玉米生长过程中不施用氮肥，此土壤满足本发明中低肥力土壤条件。

选取施用氮肥玉米地块：土壤pH为8.88，土壤总有机碳含量为7.97g/kg，土壤总氮含量为1.74g/kg，土壤硝态氮含量为15.93mg/kg，玉米开始种植时施用氮肥250kg·N/hm-2，此土壤不满足本发明中低肥力土壤条件。

在上述两种土壤上各选取3棵玉米，玉米品种均为郑单958，采样时玉米已生长69天，生育期处于抽雄期，输导组织汁液采样时间为7:30～15:30，共计8个小时。取样时不施用氮肥土壤质量含水量为16％，施用氮肥土壤质量含水量为16％。

2、采样前的预先准备

将1.5g大脱脂棉球和0.5g小脱脂棉球一同装入无菌袋，高压灭菌后干燥备用；准备70％酒精棉球备用；准备DN固体无氮培养基、Ashby固体无氮培养基、CCM固体二低氮培养基、Jensen固体无氮培养基备用；将长30厘米、直径为3.5厘米的不锈钢管(上下不锈钢密封)装入灭菌袋，高压灭菌后干燥备用；镊子装入灭菌袋，高压灭菌后干燥备用；准备修枝剪，酒精灯，手持式塑封机。将上述物品带至采样现场。

四类不同碳源的无氮(或低氮)培养基配置：

a)DN固体无氮培养基(g/L)：蔗糖10.0g、苹果酸5g、1水合磷酸氢二钾0.2g、1水合磷酸二氢钾0.4g、氯化钠0.1g、氯化铁0.01g、钼酸钠0.002g、7水合硫酸镁0.02g、1水合氯化钙0.002g、琼脂15.0g；

b)Ashby固体无氮培养基(g/L)：甘露醇10g、磷酸二氢钾0.2g、7水合硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、2水合硫酸钙0.1g、碳酸钙5g、琼脂18g；

c)CCM固体低氮培养基(g/L)：甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸钠0.5mL、酵母膏0.1g、钼酸钠0.025g、磷酸氢二钾0.8g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.1g、7水合硫酸镁0.2g、2水合氯化钙0.1g、琼脂15.0g；

d)Jensen固体无氮培养基(g/L)：蔗糖20.0g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.1g、钼酸钠0.005g、碳酸钙2.0、琼脂15.0g。

3、玉米输导组织汁液采集

选择玉米基部以上的第三节茎，除去其表面叶片后用70％酒精棉球清理表面3次以上，同时使用70％酒精棉球擦拭修枝剪，使用修枝剪在第三节茎中间截断玉米，在茎的截断处套上包含大脱脂棉球和小脱脂棉球的无菌袋，无菌袋口套至茎截断处以下5厘米处，用橡皮筋将无菌袋固定在茎上，保证无菌袋中的大小脱脂棉球在茎截断横切面正上方，并保持紧密接触(图1)。同时设置空白处理，将事先灭菌的无菌不锈钢管插入地下5厘米，模拟截断后的玉米秸秆，在上端套上包含大小脱脂棉球的无菌袋(其中已事先加入9毫升无菌水)，其操作与玉米输导组织汁液收集完全一致。在玉米根压作用下，玉米输导组织汁液向上自动运输，被无菌袋中的大小脱脂棉球收集。采集时间可根据实际收集的液体量确定，但最终采集时间不能超过8小时。

采集结束后，在酒精灯上方，用无菌镊子将小脱脂棉从无菌袋中取出，野外现场涂布于DN固体无氮培养基、Ashby固体无氮培养基、CCM固体低氮培养基和Jensen固体无氮培养基上，而包含大脱脂棉球的无菌袋用手持式塑封机密封后放置于冰面，带回实验室。空白处理操作与上述处理完全一致。

4、固氮菌的分离纯培养与鉴定

输导组织汁液收集后第3天，所有四个地点空白处理的第一次野外小棉球涂布培养基均未出现杂菌，表明野外操作过程不存在污染，所有输导组织汁液样品均可进行下一步操作。

实验室无菌条件下，将大脱脂棉球从无菌袋中取出，装入50ml带滤芯离心管离心5分钟，使大脱脂棉球与输导组织汁液分离。离心管滤芯为网状结构，滤芯小孔直径为1毫米，确保维管束汁液无障碍通过。转速为6000×g，离心后在离心管底部获得输导组织汁液。

第一次野外小棉球涂布培养基中，四个地点均以DN固体无氮培养基菌落数最多(表1)，因此，四个地点第二次实验室筛选培养基选择DN固体无氮培养基(图2)。根据第一次野外小棉球培养基中的菌落数量，为保证每个固体培养基上的菌落数在100个以内，湖南省祁阳县和江西省进贤县玉米输导组织汁液用无菌水稀释10倍，河南省原阳县和山东省禹城县玉米输导组织汁液用无菌水稀释5倍；吸取100微升稀释后的输导组织汁液，涂布于DN固体无氮培养基。空白处理操作与上述处理完全一致。

表1第一次野外小棉球涂布培养基生长情况

实验室接种培养3天后，所有四个地点空白处理的第二次实验室接种培养基均未出现杂菌，表明玉米输导组织汁液运输途径和实验室操作阶段不存在污染。每个采样地点从第一次野外小棉球接种培养基和第二次实验室接种培养基中挑选形态各异的菌株共50株，接种至DN无氮培养基进行验证，在DN无氮培养基上纯化三次后仍能正常生长的菌株，进行nifH基因PCR检测。PCR前引物和后引物分别为Pol-F(TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和Pol-R(ATSGCCATCATYTCRCCGGA)，PCR体系为25微升，包括12.5微升EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司),1微升Pol-F前引物(10μM),1微升Pol-R后引物(10μM)，10.5微升无菌水，用枪头直接将单菌落点入PCR体系中进行扩增。PCR扩增条件为：94℃2分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，进行30个循环；最后72℃10分钟。nifH基因阳性的菌株视为潜在固氮菌株(图3)。在符合本发明取样条件玉米植株中共筛选得到103株潜在固氮菌株，不符合本发明取样条件玉米植株中得到46株潜在固氮菌株，利用本发明方法得到的潜在固氮菌株数量是不使用本发明方法的2.24倍。具体菌株数量如表2所示。

表2各地点获得的潜在固氮菌株数量

对合本发明取样条件玉米植株中筛选得到的103株潜在固氮菌株进行固氮酶活性测定。将潜在固氮菌接种于4mL TSB液体培养基中，160rpm，28℃过夜培养。TSB液体培养基(g/L)成分为：胰酶消化酪蛋白胨17.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物3.0g，葡萄糖2.5g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾2.5g。

次日将菌液5000rpm,4℃条件下离心10min，去除上清液。用等量0.9％生理盐水重悬洗涤菌体2次，在相同条件下离心10min，去除残留的培养基、抗生素以及菌体代谢产物。将洗涤之后的菌液OD₆₀₀调至1.0。在无菌的20mL顶空瓶中加入4.5mL DN无氮液体培养基和0.5mL OD₆₀₀为1.0的相应菌液，使得初始OD₆₀₀为0.1，每菌株5次试验重复。用氩气置换顶空瓶中空气4min，以排净瓶中空气。向每个充好氩气的瓶中分别注入占瓶内体积1％的氧气和占瓶内体积10％的乙炔气体。将注完气的顶空瓶置于160rpm，2℃摇床培养。记录时间，12小时后利用气相色谱仪检测乙烯含量，计算固氮酶活性。

结果显示，所有103个潜在固氮菌株固氮酶活性均超过100nmol·C₂H₄/mg·pro·h，证明全部为固氮菌株(表3)。从表2可知，同一地点中，从符合本发明取样条件的玉米植株中获得的固氮菌株数量均高于不符合本发明取样条件的玉米植株。上述结果表明，本发明是一种轻简、快捷、高效的固氮菌分离培养技术。

表3各地点获得的潜在固氮菌株固氮酶活性

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，具体步骤包括：

采集低肥力土壤生长的玉米植株的输导组织汁液，分离筛选得到玉米内生固氮菌；所述低肥力土壤总有机碳含量不超过7.5 g/kg，土壤全氮含量不超过1.6 g/kg，土壤硝态氮含量不超过6 mg/kg；

所述玉米植株为生育期处于大喇叭口期至开花期的玉米植株；

所述输导组织汁液的采集方法为：截断玉米第三节茎，将收集装置连接在截断处进行采集；

所述的分离筛选方法为：首先将所述的输导组织汁液在野外条件下于筛选培养基上涂布进行第一次筛选，再在实验室中使用所述的输导组织汁液第二次筛选，两次筛选获得的菌株进行nifH基因PCR鉴定，得到潜在固氮菌；所述潜在固氮菌进行固氮酶活性测定，判断其是否为固氮菌。

2.根据权利要求1所述的一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，所述低肥力土壤当季未施加氮肥。

3.根据权利要求1所述的一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，所述低肥力土壤质量含水量大于10%，不超过20%。

4.根据权利要求1所述的一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，所述输导组织汁液的采集时间不超过8小时。

5.根据权利要求1所述的一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，所述输导组织汁液开始采集的最佳时间为每日上午的5:30-8:00。

6.根据权利要求1所述的一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，所述的筛选培养基为无氮或低氮培养基。

7.根据权利要求6所述的一种分离玉米内生固氮菌的方法，其特征在于，所述的无氮培养基为DN固体无氮培养基、Ashby固体无氮培养基或Jensen固体无氮培养基；所述的低氮培养基为CCM固体低氮培养基。

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