CN113755347B

CN113755347B - 一种促进油茶氮素吸收的内生真菌am1

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Publication number: CN113755347B
Application number: CN202111222610.2A
Authority: CN
Inventors: 王晓艳; 吴轩毅; 王晓伟; 苏军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2041-10-20
Also published as: CN113755347A

Abstract

本发明提供一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1，属于微生物技术领域。本发明从木本植物油茶的根部筛选获得一株内生真菌AM1，所述内生真菌AM1的分类命名为锥毛壳（Coniochaetasp.）AM1，已于2021年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 23244。内生真菌AM1制成的菌肥可减少化学肥料的使用、提高土壤微生物活性，影响油茶的土壤理化性质，从而影响油茶的内源激素以及氮素的吸收，促进植物生长发育。

Description

一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1。

背景技术

氮(N)是作物生长所需要的矿质营养元素, 是植物体内许多重要有机化合物的成分，例如蛋白质、核酸、叶绿素、酶、维生素、生物碱和激素等都含有氮(N)，对作物生理功能和生长发育具有重要影响。氮(N)添加可促进根系活力、增加叶绿素含量。在植物生长过程中，如果植物无法吸收充足的氮(N)，对植物生长会产生抑制作用。最常见的氮元素缺乏现象为叶片失绿发黄。氮(N)的吸收降低或者不足会导致植物根系数量减少，进一步降低植物的土壤营养吸收能力，阻碍植物的生长，减少植物的花果数量，进而降低作物产量与质量。

油茶（Camellia oleifera Abel.）隶属山茶科山茶属，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本油料树种。油茶是我国南方丘陵地区重要的木本食用油料作物，年产值1160多亿，在林业产业和丘陵山区经济发展中占有非常重要的地位。同时油茶叶片能吸附空气中的有害物质，具有一定的生态价值。从我国油茶的实际种植情况来看，我国大部分油茶产量不高，极大地打击了种植户的生产积极性。低产低收是油茶产业目前面临的主要问题，提高油茶产量，才能促进油茶产业的健康和可持续发展。矿质营养元素对油茶的生长和产量影响显著。油茶在幼苗和幼林期以营养生长为主，氮素是其主要需求元素。但是在油茶主要分布的南方红壤地区，土壤肥力质量较低，全氮和碱解氮大多处于缺乏状态，氮素常成为油茶林地的主要养分限制因子之一。为促进油茶的生长和增产，生产上要提高油茶的氮素吸收率。

国内外学者已从植物体内筛选出多种具有促生的内生真菌，但目前的研究主要集中于禾木科植物相关菌株的筛选，有关于木本植物，尤其是对油茶内生真菌筛选鉴定的研究鲜见报道。从油茶根筛选出对油茶生长和抗逆性有益的内生真菌，建立油茶-内生真菌共生体系，以期获得可促进油茶生长，提高油茶吸收氮素的内生真菌，为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为油茶林经营制造生物菌肥提供数据基础和参考依据。

发明内容

本发明的目的在于针对木本植物油茶缺乏油茶-内生真菌共生体系的问题，提供一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1，该内生真菌AM1的分类命名为锥毛壳（Coniochaetasp.）AM1，已于2021年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 23244，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1在促进油茶生长中的应用。

上述内生真菌AM1是从油茶的根中分离纯化得到的，其可制备成菌液，通过与有机肥混合沟施的方式促进油茶苗木的生长。

一种含有内生真菌AM1菌液的菌肥，其组成为：内生真菌AM1菌液与有机肥按 1升：10公斤的比例混合成固体菌肥。其中内生真菌AM1菌液的制备方法包括：将内生真菌AM1菌株接入液体培养基中，28℃、220 r/min摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释孢子浓度为0.6×10⁹CFU/ml；所述液体培养基配方为：蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）20.0g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，超纯水1000ml，pH 5.6±0.2。

上述含有内生真菌AM1菌液的菌肥在油茶种植中的应用。

本发明的优点在于：

本发明从木本植物油茶的根部筛选获得一株内生真菌AM1，该菌株能够促进油茶吸收氮素，从而能促进植株生长。内生真菌AM1制成的菌肥可减少化学肥料的使用、提高土壤微生物活性，影响油茶的土壤理化性质，从而影响油茶的内源激素以及氮素的吸收。从而促进植物生长发育。

附图说明：

图1为内生真菌AM1菌落形态图。左：正面；右：背面。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 油茶根内生真菌的分离

培养基：

（1）液体培养基YPDA：（1）蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）20.0g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，超纯水1000ml，pH 5.6±0.2。

（2）固体培养基PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯浸粉6.0g，琼脂20.0 g，葡萄糖20.0g，pH 5.6±0.2。

内生真菌的分离

（1）采用组织分离法，将油茶的根经流水冲洗干净于超净台内吹干并进行组织表面消毒，其操作流程为：75vol%无水乙醇消毒→无菌水清洗2~3遍→15vol%次氯酸钠消毒→无菌水清洗2~3遍。将消毒后的根用无菌刀片切去韧皮部再切成2mm×2mm大小，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上（PDA），28℃恒温避光培养。

（2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，28℃恒温培养4~7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本组织于未使用的PDA培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培养4~7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。

内生真菌的纯化

待组织材料培养3~5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的PDA培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温培养箱内，28℃恒温避光培养4~7d。反复纯化3~4次，得到纯化菌株AM1。将纯化后的菌株接入PDA斜面培养基，于4℃保存。

3 内生真菌AM1的形态特征：

4内生真菌的DNA鉴定

利用真菌18S rDNA通用正、反引物（ ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC），扩增18S rDNA基因序列（SEQ ID NO.1）；将所测的18S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明:AM1菌株与锥毛壳（Coniochaeta sp.）属同处于一个分支上；结合菌落形态，生理生化特征和18S rDNA序列分析，初步鉴定为锥毛壳（Coniochaeta sp.）属菌。

SEQ ID NO.1：

GTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAAGAAGCCGAAAGGCTACTTCAAACCATCGCGAACTCGTCCAAGTTGCTTCGGCGGCGCGGCATCCCGTCACCGGGGCGCCGCAGCCCGGCCTCCCCGGAGGTGCGGGGCGCCCGCCGGAGGTACGAAACTCTGTATT ATAGTGGCATCTCTGAGTAAAAAGCAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGGTAGTACTCTACCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACGGCTGCCGTAGGCCCTGAAAGGAAGTGGCGGGCTCGCTACAACTCCGAGCGTAGTAATTCATTATCTCGCTAGGGAGGTGCGGCGTGCCCCTGCCGTTAAAGACCCCATCTTTAACCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAA

实施例2

菌液制备：将活化后的内生真菌AM1接入20mL液体培养基YPDA中，置于恒温摇床上培养72h（28℃、220 r/min），再吸取1ml接入2个500mL液体培养基YPDA中，用血球计数板计算孢子数量，将培养后的菌液用无菌水按十倍稀释法稀释成浓度为0.6×10⁹ CFU/ml。

菌肥制备：菌肥成分为：菌液：有机肥= 1升：10公斤（有机肥为烟沫、米糠、牛粪、花生渣、草木灰、腐植酸、羊粪等发酵而来，有机质质量分数大于46%、N+P₂O₅+K₂O质量分数大于5%），混合制成固体菌肥。

1月份在油茶林地投影区下方40公分的位置沟施，因为7月份为雨季，所以在6月底采集土样和叶样。

实验方案：本试验采用室外试验，试验所选油茶林场地由福建省三明市清流县清流国有林场提供。在菌肥实验区内和1个空白对照区内选择生长状态良好的油茶林为采样区。1月份将制备好的固体菌肥在油茶林地投影区下方40公分的位置沟施，在，因为7月份为雨季，所以在6月底采集土样和叶样。设置随机选取三个采样点进行叶、根、土壤取样，每个采样点取5份样品混成1个待测样。

菌肥对土壤理化性质的影响

对土壤样品进行了含水率、电导率与pH值三种理化性质的测定，结果如表1所示：

表1 土壤含水率、电导率与pH

由表1可得，由AM1菌株制成的菌肥与对照处理组相比较，含水率，电导率，PH值都与对照组有显著性差异。

菌肥对油茶叶内源激素的影响

分别以Plant GA ELISA KIT（ml072782，MLBIO，Shanghai）、Plant IAA ELISA KIT（ml022829，MLBIO，Shanghai）、Plant ABA ELISA KIT（ml064270，MLBIO，Shanghai）与PlantBR ELISA KIT（ml036309，MLBIO，Shanghai）试剂盒内标准物的浓度为横坐标，测得的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得到直线回归方程式，计算得出样品含量（表2）。

表2 GA、IAA、ABA、BR含量

由表2可得，由AM1菌株制成的菌肥与对照处理组相比较，GA(pmol/ml)的含量为233.28±8.60，ABA(ng/ml)为140.99±5.53，与对照组有显著性差异。

菌肥对油茶吸收氮磷钾元素的影响

对油茶叶片内源的N、P、K等三种元素的相对含量进行了测定，结果如表3所示：

表3 内源的N、P、K等三种元素的相对含量

由表3可得，由AM1菌株制成的菌肥与对照处理组相比较，N的相对含量为1.00±0.16与对照组有显著性差异，表明菌株AM1能够显著促进油茶吸收氮素（N）。

土壤是植物生长发育、营养物质汲取的必要条件，土壤理化性质是气候、植被、地形和土壤结构的综合反映，通过施加微生物菌肥可减少化学肥料的使用、提高土壤微生物活性，从而影响植物的生长发育。本实验从上述结果可得由内生真菌AM1制成的有机菌肥对油茶的土壤生长环境是有积极的影响的，在一定程度上可影响油茶的土壤理化性质，从而影响油茶的内源激素以及氮素的吸收。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 王晓艳、吴轩毅、王晓伟

<120> 一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 589

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt acaagaagcc gaaaggctac 60

ttcaaaccat cgcgaactcg tccaagttgc ttcggcggcg cggcatcccg tcaccggggc 120

gccgcagccc ggcctccccg gaggtgcggg gcgcccgccg gaggtacgaa actctgtatt 180

atagtggcat ctctgagtaa aaagcaaata agttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 240

ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag 300

tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccggtagt actctaccgg gcatgcctgt 360

tcgagcgtca tttcaaccct caagccctgc ttggtgttgg ggccctacgg ctgccgtagg 420

ccctgaaagg aagtggcggg ctcgctacaa ctccgagcgt agtaattcat tatctcgcta 480

gggaggtgcg gcgtgcccct gccgttaaag accccatctt taaccaaggt tgacctcgga 540

tcaggtagga atacccgctg aacttaagca tatcaataag gcggaggaa 589

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> ITS1

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1，其特征在于：所述内生真菌AM1的分类命名为锥毛壳（Coniochaeta sp.）AM1，已于2021年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 23244，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述促进油茶氮素吸收的内生真菌AM1在促进油茶生长中的应用。

3.一种含有内生真菌AM1菌液的菌肥，其特征在于：所述菌肥的制备包括：内生真菌AM1菌液与有机肥按1升：10公斤的比例混合成固体菌肥；所述内生真菌AM1菌液的制备方法包括：将权利要求1所述内生真菌 AM1 菌株接入液体培养基中，28℃、220 r/min摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释孢子浓度为0.6×10⁹CFU/ml。

4.根据权利要求3所述的菌肥，其特征在于：所述液体培养基配方为：蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖20.0g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，超纯水1000ml，pH 5.6±0.2。

5.权利要求3所述的菌肥在油茶种植中的应用。