CN103725636A - 用于降解黄曲霉毒素b1的芬氏纤维微菌slaq001及其应用 - Google Patents

用于降解黄曲霉毒素b1的芬氏纤维微菌slaq001及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芬氏纤维微菌SLAQ001（Cellulosimicrobium funkei stain SLAQ001），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2013564。本发明还公开了芬氏纤维微菌SLAQ001在降解黄曲霉毒素B1中的应用。本发明的芬氏纤维微菌SLAQ001对黄曲霉毒素B1具有很好的降解能力，可耐受动物体胃肠道环境，在动物体内发挥解毒效果，适用于畜牧业生产中的黄曲霉毒素B1的去除。可将该菌灌服家禽，用于降低黄曲霉毒素B1对家禽的毒性，缓解黄曲霉毒素B1对家禽肝脏的损伤。

Description

用于降解黄曲霉毒素B1的芬氏纤维微菌SLAQ001及其应用
技术领域
本发明涉及芬氏纤维微菌SLAQ001（Cellulosimicrobium funkei stain SLAQ001）及其在降解黄曲霉毒素B1中的应用。 
背景技术
霉菌毒素是霉菌在生长繁殖中产生的有毒次级代谢产物，普遍存在于饲料和饲料原料中。据世界粮农组织报道每年全球大约有25%的作物受到霉菌毒素的污染，给畜牧业造成直接或间接的损失高达数百亿美元。在污染比较严重的几种霉菌毒素中，黄曲霉毒素被认为是一种致癌性最强且存在最为普遍的一种毒素。它广泛存在于玉米、花生、坚果等原料中，被世界卫生组织认定为“ⅠA级危险物”。在目前已经分离出来的黄曲霉毒素中，以黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性最强，具有致癌、致畸和引起肝脏损伤的作用，并且在天然污染的饲料中AFB1量也最多，对畜牧业有极大的危害。因此，AFB1解毒技术的研究对保障饲料和食品安全具有重大意义。目前国内外常规AFB1去毒方法主要是碱处理法、氧化处理法、吸附剂脱毒等。由于这些脱毒方法存在化学物质残留、效果不稳定、营养物质损失等问题限制了其大规模应用。利用微生物或其代谢产物进行解毒具有特异性强，效率高以及对环境和饲料无污染等优点，成为学者们关注的热点。至今为止，未见关于芬氏纤维微菌及其代谢产物降解AFB1的报道。 
发明内容
本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素B1的芬氏纤维微菌SLAQ001。本发明的另一目的是提供上述芬氏纤维微菌SLAQ001的应用。 
本发明筛选得到一株芬氏纤维微菌，申请人将其鉴定为芬氏纤维微菌SLAQ001（Cellulosimicrobium funkei stain SLAQ001），并于2013年11月11日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：M2013564。 
体外试验表明：芬氏纤维微菌SLAQ001对黄曲霉毒素B1具有很好的降解能力。在降解8h时，就可去除54.90%的黄曲霉毒素B1，降解24h时，可去除71.68%的黄曲霉毒素B1，随着时间的延长，菌株对黄曲霉毒素B1的降解能力不断增强，当降解时间达到72h时，对AFB1的降解率可达96.82%。 
所述的芬氏纤维微菌SLAQ001可在动物体内发挥降解黄曲霉毒素B1的功能。雏鸭连续摄入一周0.1mg/kg·BW的黄曲霉毒素B1，然后对中毒雏鸭每天灌服1×108cfu的芬氏纤维微菌SLAQ001，可显著缓解黄曲霉毒素B1对雏鸭生长的影响以及对肝脏的损伤作用。 
本发明的有益效果是： 
1）本发明所述的芬氏纤维微菌可耐受动物体胃肠道环境，在动物体内发挥解毒效果，适用于畜牧业生产中的黄曲霉毒素B1的去除。可将该菌灌服家禽，用于降低黄曲霉毒素B1对家禽的毒性，缓解黄曲霉毒素B1对家禽肝脏的损伤。 
2）本发明降解黄曲霉毒素B1的活性高，降解率可达96.82%。由于该菌还可以降解纤维素，因此不仅不会破坏饲料中的营养成分，还可以提高营养物质的利用率。 
附图说明
图1对照组AFB1的紫外检测图谱； 
图2芬氏纤维微菌SLAQ001处理组（72h）AFB1的紫外检测图谱； 
图3芬氏纤维微菌SLAQ001对AFB1的降解时间曲线图； 
图4芬氏纤维微菌SLAQ001对AFB1攻毒雏鸭肝脏组织结构的影响。 
具体实施方式
实施例1：芬氏纤维微菌SLAQ001的筛选、鉴定、培养 
1、菌株的筛选 
取多环芳烃化合物污染的土壤样品加入100ml液体初筛培养基中，37℃，140r/min富集培养72h。培养结束后分别取0.5ml培养液加入4.5ml灭菌生理盐水，依次梯度稀释，使其浓度梯度为10-1、10-2、10-3和10-4。各取10-3和10-4稀释液100μL，加入固体初筛培养基平板中，涂布均匀至所有液体吸干，倒置于37℃培养箱中培养。 
挑取生长的菌落，划线接种于新的固体初筛培养基中，连续转接三次分离纯化菌株，取转接三次后的生长菌株为初筛菌株。 
其中，液体初筛培养基：（NH4)2SO42.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·H2O0.2g，CaCl20.1g，香豆素1g，蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min。 
固体初筛培养基另加琼脂15g。 
将初筛得到的菌株进行降解AFB1纯品复筛。挑取分离纯化的初筛菌株加入30mL灭菌LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值为6.5）中，37℃，140r/min培养72h，取1.9mL发酵液加入100μL AFB1（10μg/mL），以加菌不加AFB1溶液为空白对照，以不加菌加AFB1溶液为阳性对照，37℃震荡培养72h。高效液相色谱法（HPLC法）测定培养液AFB1含量。降解效果最好的菌株对AFB1的降解率为94.16%，后经鉴定该菌株为芬氏纤维微菌SLAQ001。 
2、菌株的鉴定 
上述芬氏纤维微菌是发明人筛选得到的芬氏纤维微菌SLAQ001（Cellulosimicrobium funkei SLAQ001），其细胞形态和理化特征见表1。 
表1细胞形态和理化特征 
鉴定指标 结果 鉴定 结果 鉴定指标 结果
菌落颜色 黄色 V.P.反应 - 发酵产酸： +
革兰氏染色 阳性 明胶液化 + 葡萄糖 -
细胞形状 杆状 Tween80降解 - 麦芽糖 -
芽孢 - 氧化酶 - 木糖 -
纤维素降解 + 酵母细胞溶解 - 半乳糖 +
硝酸盐还原 + 有机酸利用 + 山梨醇 -
接触酶 + 酸性培养基生长 - 棉籽糖 +
甲基红反应 + 脲酶活性 + 蔗糖 +
氧化酶 - 木聚糖降解 - 甘油 +
淀粉水解 - 酵素水解 + 卵磷脂降解 -
[0025] 芬氏纤维微菌SLAQ001的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。 
3、菌株的培养 
取芬氏纤维微菌SLAQ001（活菌浓度为109cfu/mL）以5%的接种量接种于发酵培养基培养，发酵pH值6.5，温度35，℃转速140r/min，发酵时间24h。 
其中发酵培养基组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值为6.5。 
实施例2：芬氏纤维微菌SLAQ001用于降解纯品黄曲霉毒素B1
发酵结束后，取所述芬氏纤维微菌发酵液，5000r/min离心15min，取上清液经0.22μm无菌过滤器过滤除去残余细菌细胞。取1.9mL上清滤液加入100μL黄曲霉毒素B1（10μg/mL），将反应体系pH值调为6.5，温度35，℃分别反应1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。向反应后的样品加入4mL三氯甲烷，剧烈震荡10min，静置分层，取三氯甲烷层加入10mL玻璃管，重复提取一次后，用空气泵吹干提取液，加入2mL流动相重新溶解玻璃管中的凝结物，旋涡混合3min，溶解液用0.45μm微孔过滤器过滤，采用高效液相色谱法检测黄曲霉毒素B1的浓度。 
检测条件：分析柱：C18柱ODS-BP，5μm×4.6mm×250mm；流动相：甲醇:乙腈：水=1:1:2（v/v/v） 
紫外检测波长：365nm；流速：1.0mL/min；柱温：30。℃72h时对照组和处理组的出峰时间分别为10.812min（图1）和10.788min（图2） 
检测结果：芬氏纤维微菌SLAQ001对AFB1的降解时间曲线图见图3。在降解时间为8h时，菌株就可去除54.90%的AFB1，而当降解时间达到24h时，菌株可去除反应液中71.68%的AFB1。随着反应时间的延长，菌株对AFB1的降解能力不断增强，当降解时间达到72h时，细菌发酵液对AFB1的降解率可达96.82%。 
实施例3：芬氏纤维微菌SLAQ001用于降解雏鸭体内AFB1
1日龄樱桃谷肉鸭，基础日粮预饲3d后，随机选取健康、体重相近的雏鸭，随机分为3个组，每组4个重复，每个重复5只雏鸭。具体分组如下：空白对照组；AFB1攻毒组；AFB1攻毒+芬氏纤维微菌SLAQ001组。其中AFB1攻毒量 为0.1mg/kg·BW，芬氏纤维微菌SLAQ001加菌量为每天108cfu。芬氏纤维微菌SLAQ001以灌胃方式加入，连续灌胃1周。 
试验结果：AFB1攻毒组雏鸭料重比（饲养畜禽增重一公斤所消耗的饲料量；料重比=消耗饲料总量/畜禽增重总量）与空白对照组相比显著升高，加菌后可显著降低AFB1对雏鸭料重比的影响，达到空白对照水平（表2）。AFB1攻毒组雏鸭肝脏损伤严重，对AFB1攻毒雏鸭添加芬氏纤维微菌SLAQ001可显著缓解AFB1对肝脏的损伤作用（见表3和图4）。 
表2芬氏纤维微菌SLAQ001对AFB1攻毒雏鸭料重比的影响 
组别 料重比F/G
空白组 1.76±0.10b
AFB1攻毒组 2.07±0.21a
AFB1+108cfu加菌组 1.70±0.03b
表3芬氏纤维微菌SLAQ001对AFB1攻毒雏鸭血清生化指标的影响 
Figure BDA0000452329860000051
Figure IDA0000452329960000011

Claims (2)

1.一种用于降解黄曲霉毒素B1的芬氏纤维微菌SLAQ001（Cellulosimicrobium funkei stain SLAQ001），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2013564。
2.权利要求1所述的芬氏纤维微菌SLAQ001在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
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