CN108998393A - 一株枯草芽孢杆菌及其制备具有调节肠道功能的普洱茶方法 - Google Patents
一株枯草芽孢杆菌及其制备具有调节肠道功能的普洱茶方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其制备具有调节肠道功能的普洱茶的方法。本发明所述的枯草芽孢杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15959。本发明所述的枯草芽孢杆菌菌株应用于普洱茶加工工艺中，能够有效抑制其他有害微生物的生长，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、黄曲霉及其他产毒真菌；其制备得到普洱茶具有调节肠道功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物和食品生物技术领域，涉及一株枯草芽孢杆菌 0061-BS及其在普洱茶加工工艺中的应用，以及茶叶的调节肠道功能。
背景技术
普洱茶以云南大叶种晒青茶为原料制成，被认为是变化最丰富、最有 故事的中国茶。普洱熟茶属于后发酵茶，是以晒青毛茶为原料经过一个月 以上的渥堆发酵制得。普洱茶的发酵生产过程中可能会进入一些不利于普 洱发酵的杂菌，且在后期如果在高湿高温的环境下存放，会增加食源性致 病菌的污染机会。
枯草芽孢杆菌是一类好氧菌杆菌，存在于土壤和自然界中，无致病性， 能够分泌多种酶，其分泌枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等在 医药界应用较多。在亚洲地区的一些发酵食品，如纳豆等，也经常发现由 枯草芽孢杆菌，尤其分泌的丝氨酸纤溶性蛋白酶可有效参与发酵。
发明内容
为此，本发明主要解决的技术问题是提供了一株能够有效抑制其他有 害微生物的生长，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等食源性致病菌以及黄 曲霉等产毒真菌的菌株，并同时具有调节肠道功能的普洱茶。
为解决上述技术问题，本发明所述的一株枯草芽孢杆菌0061-BS，已保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No.15959。
上述的微生物菌株，由昆明中茶普洱茶存储仓中分离纯化得到，遗传 稳定，符合普洱茶高温汽蒸等生产要求的菌株，包括如下步骤：
1、在昆明中茶普洱茶储存仓选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂 抹取样法进行取样；
2、取样后于PCA固体培养基进行培养，于37℃条件下培养24-48小 时进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相 互区别的菌落进行下一步纯化；
4、挑取菌落划线接种至PCA固体培养基上，于37℃条件下培养24-48 小时，直至得到各个菌株的单菌落；
5、将获得的单菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，可应用 于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株。
本发明所述的枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)遗传稳定，符合普 洱茶生产要求。枯草芽孢杆菌在生长过程中产生的枯草菌素等活性物质能 够有效抑制致病菌，在茶叶中应用能够减少普洱茶中可能存在的有害微生 物，尤其是有害真菌微生物，在提供独特发酵口味的同时，产生乳酸等有 机酸类，降低肠道PH值，促进肠道益生菌生长，辅助调节肠道功能，缓 解腹泻，提供有益的健康功效。
利用本专利的枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)进行普洱茶工艺的 接种发酵，在渥堆发酵前接入含有所述保藏编号为CGMCC No.15959的 单一菌种经培养后得到的液体种子；所述液体种子通过如下方法制备：
1、取活化后的枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)菌株接种至液体培 养基。所述的液体培养基是利用茶叶、茶粉制备为茶汁的液体培养基。
2、将于37℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体种子 的密度为107cfu/mL以上。
本发明的枯草芽孢杆菌菌株的制备普洱茶产品，应用于普洱茶生产加 工中，对普洱茶的品质有很大的积极作用，能够有效抑制其他有害微生物 的生长，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等食源性致病菌以及黄曲霉等产 毒真菌的菌株，此外，其制备得到普洱茶含有抑菌素，具有调节肠道功能。 所述普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干 燥，按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，接种量为28％-33％，要求菌 液喷洒均匀、茶叶不结块；
3、将接种后的茶叶堆放成高(0.5-1)米、长宽为(1-2)*(1-2)米的 小型茶堆，进行渥堆发酵；
4、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆 芯温度以及水分含量；
5、发酵15-20天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述的PCA培养基按照现有技术中常规方法制 备。
本发明中枯草芽孢杆菌的选育方法，包括如下步骤：
1、在昆明中茶普洱茶储存仓选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂 抹取样法进行取样；
2、将取样后的PCA培养基，于37℃条件下培养24-48小时进行倒置 培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相 互区别的菌落进行下一步纯化；
4、挑取菌落划线接种至PCA固体培养基上，于37℃条件下培养24-48 小时，直至得到各个菌株的单菌落；
5、将获得的单菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，可应用 于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株。
由上述步骤中分离得到的菌株0061-BS，在PCA培养基上培养后，菌 落乳白色，白色、扁平、不透明，边缘不整齐。在营养琼脂培养基上菌体 为杆状，革兰氏阳性菌，芽孢为柱状，单个、成对或链状排列。通过菌体 形态、菌落形态、生理生化鉴定等确认该菌株为枯草芽孢杆菌。该菌株遗 传稳定性稳定，有良好的耐热性，符合生产要求，送样编号为0061-BS，菌 株于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCCNo.15959，Bacillus subtilis。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2018年6月19日，目前状态为存活。
将该菌株用于普洱茶发酵生产，在常规工艺中增加制备液体种子和接 种步骤，增加后的工艺为晒青茶精制、制备液体种子、接种、渥堆发酵、 翻堆、干燥、压制成型。
所述的液体种子是利用枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)按照如下 方法制备：
1、取活化后的枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)菌株接种至液体培 养基。所述的液体培养基是利用茶叶、茶粉制备为茶汁的液体培养基。
2、将于37℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体种子 的密度为107cfu/mL以上。
按如下方式制备调节肠道功能普洱茶：
所述普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开 沟干燥，按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，接种量为28％-33％，要求菌 液喷洒均匀、茶叶不结块；
3、将接种后的茶叶堆放成高(0.5-1)米、长宽为(1-2)*(1-2)米的 小型茶堆，进行渥堆发酵；
4、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆 芯温度以及水分含量；
5、发酵15-20天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥后压制成型。
实施例1专利普洱茶
按照本发明的方法，采用单菌株发酵工艺，利用枯草芽孢杆菌 (CGMCC No.15959)制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，接种量为28％，要求菌液喷 洒均匀、茶叶不结块，液体种子的密度为5*107cfu/mL
3、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为1*1米的小型茶堆，进行 渥堆发酵；
4、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆 芯温度以及水分含量；
5、发酵15天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥后压制成型。
本实施例制备的普洱熟茶，品质稳定，其滋味醇爽，能够有效抑制其 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等食源性致病菌以及黄曲霉等有害微生物的生 长，并具有调节肠道功能，缓解腹泻等作用。
对比例1普洱茶常规制备
按照《地理标志产品-普洱茶》(GB/T 22111)中记载，将茶叶原料制备 为普洱熟茶。
对比例2黑曲霉菌株制备的普洱茶
按照本发明的方法，利用黑曲霉制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将由黑曲霉制备的液体种子接种到茶叶原料中，接种量为30％，要 求菌液喷洒均匀、茶叶不结块，液体种子的密度为106cfu/mL；
3、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为1*1米的小型茶堆，进行 渥堆发酵；
4、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆 芯温度以及水分含量；
5、发酵25天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥后压制成型。
对比例3其他枯草芽孢杆菌制备的普洱茶
按照本发明的方法，采用单菌株发酵工艺，利用其他株枯草芽孢杆菌 制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，接种量为28％，要求菌液喷 洒均匀、茶叶不结块，液体种子的密度为107cfu/mL；
3、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为1*1米的小型茶堆，进行 渥堆发酵；
4、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆 芯温度以及水分含量；
5、发酵15天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥后压制成型。
对上述实施例的普洱熟茶成分和品质进行检测和评审。茶多酚在一定 范围内向其他物质的转变速度代表了茶叶转化的速度，实验中以茶多酚和 茶褐素(茶多酚转化产物)含量表示茶叶转化速度。普洱茶调节肠道功能 通过体外的抑菌试验(志贺氏菌)来评价。每个实施例制备五个批次，检 测结果分别记录于下表1。
表1普洱熟茶品质的检测结果
由表1的普洱熟茶数据可知，实施例1的茶褐素含量高于对比例；实 施例1的抑菌效果远远优于对比例1的传统熟普和对比例2和3的由其他 微生物制备的熟普，对于肠道腹泻微生物志贺氏菌的抑制率更为突出。总 体而言，利用枯草芽孢杆菌制备的实施例1能够有效抑制普洱茶中可能存 在的有害微生物，且抑制肠道有害微生物的效果优于对比例。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌0061-BS，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15959。
2.根据权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，由昆明中茶普洱茶存储仓中分离纯化得到，遗传稳定，符合普洱茶高温汽蒸等生产要求的菌株，包括如下步骤：
S11、在昆明中茶普洱茶储存仓选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；
S12、取样后于PCA固体培养基进行培养，于37℃条件下培养24-48小时进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
S13、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；
S14、挑取S13筛选菌落划线接种至PCA固体培养基上，于37℃条件下培养24-48小时，直至得到各个菌株的单菌落；
S15、将S14获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株，其保藏编号为CGMCC No.15959。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株制备普洱茶工艺，其特征在于，所述的普洱发酵工艺是在渥堆发酵工序前接入含有所述保藏编号为CGMCC No.15959菌株经培养后得到的液体种子，所述液体种子通过如下方法制备：
S21、取活化后的枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基是利用茶叶、茶粉制备为茶汁的液体培养基；
S22、将于37℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体种子的密度为107cfu/mL以上。
4.利用权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌菌株的制备普洱茶产品，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌(CGMCC No.15959)菌株接种制备普洱茶产品，所述的普洱制备工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥，按如下方法进行：
S31、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
S32、将权利要求3制备的液体种子接种到茶叶原料中，接种量为28％-33％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
S33、将接种后的茶叶堆放成高(0.5-1)米、长宽为(1-2)*(1-2)米的小型茶堆，进行渥堆发酵；
S34、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；
S35、发酵15-20天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20181214 |