CN104059856B - 一种冠耳霉th130914及其应用 - Google Patents
一种冠耳霉th130914及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种冠耳霉(Conidiobolus coronatus)TH130914及其应用，该冠耳霉TH130914于2014年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9019。本发明是初次从家蝇体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对家蝇成虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于家蝇的防治。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种冠耳霉TH130914及其应用。
背景技术
家蝇Musca domestica是重要的卫生害虫，它不仅能污染食物使食品变质，而且还能通过其机体携带病原微生物传播疾病。对家蝇的防治，杀虫剂的研制也从第一代有机氯开发到了第四代拟除虫菊酯卫生杀虫剂。化学杀虫剂虽然具有见效快、成本低的优点，但蝇类的生活周期短(15～18天)，分布范围广，繁殖能力强，无滞育现象。若常年用药防治次数过多，不仅会造成严重的环境污染，而且易杀死蝇类的天敌，并使目标害虫产生抗药性。这些负面影响使人们在防治中更加关注起生物防治。生物防治对人、畜、植物安全，害虫极少或不产生抗性，有利于环境保护。因此，研究蝇类的生物防治，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题，已成为蝇类科学治理和可持续控制的重要课题。
冠耳霉Conidiobolus coronatus(Cost.)Batko属于接合菌亚门虫霉目新月霉科耳霉属。据记载，冠耳霉可侵染扁豆蚜Aphis craccivora(Koch.)(同翅目:蚜科)、桃蚜Myzus persicae(Sulzer)(同翅目：蚜科)、大青叶蝉Tettigella viridis(Linn.)、蚁、舞毒蛾幼虫、毛蠓Psychoda sp等，而家蝇的侵染还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冠耳霉TH130914及其应用，旨在克服现有冠耳霉未发现能寄生家蝇的不足，通过生物技术手段防治蝇类，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。
本发明是这样实现的，一种冠耳霉(Conidiobolus coronatus)TH130914，于2014年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9019，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的进一步的目的在于提供上述冠耳霉TH130914在家蝇防治方面的应用。本发明于2012年9月，在云南省玉溪市通海县田间调查时发现冠耳霉在家蝇中大量发生流行，引起大量家蝇感染死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的寄生家蝇、流行性很强的虫生真菌，在防治家蝇中具有很大的开发应用前景。
本发明从罹病家蝇成虫上分离获得冠耳霉野生菌株，将野生菌株回接于家蝇成虫上复壮得到冠耳霉菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的冠耳霉菌。在光学显微镜(400倍)可以看到在该菌株的分生孢子球形，具乳突。在SDAY培养基上培养时，生长旺盛，菌落表面白色像一层雪，少许脑折状。背面褶皱。初生分生孢子大小为(39.42±3.57)μm×(32.41±3.04)μm[(30.40～45.50)×(24.76～40.22)]μm，L/D＝(1.22±0.10)[(1.01～1.38)]，次生分生孢子与初生分生孢子形状相似，但顶部无乳突，大小差异较大，大小为(23.34±5.24)μm×(21.66±5.45)μm[(15.87～36.38)×(13.28～35.56)]μm；产生柔毛孢子和小分生孢子。在SDAY培养基上生长较快，接种后24小时开始菌落直径日增长0.45cm。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是初次从家蝇体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对家蝇成虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于家蝇的防治。
附图说明
图1是冠耳霉感染的家蝇及病原真菌的形态特征图；其中，a图为被冠耳霉TH130914感染的家蝇；b图为初生分生孢子；c.图为次生分生孢子；d图为小分生孢子；e图为柔毛孢子；f图为分生孢子梗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一、病原菌的分离、鉴定
1.1材料与方法
1.1.1材料
在云南省通海县采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病家蝇Boettcheriscaperegrine(Diptera：Sarcophagidae)成虫。
萨氏培养基(SDAY)：1％蛋白胨+1％酵母粉+4％葡萄糖+1.5～2％琼脂粉+1000ml水。
无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
培养条件：置于25℃光照(12L：12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管SDAY斜面，培养2～3天，转入4℃冰箱储存。
1.1.2病原菌的分离和纯化
分离：从罹病家蝇成虫尸体上分离病原菌。将家蝇成虫罹病虫体带回实验室，将处理好的家蝇成虫尸体用双面胶粘于培养盖上，再将该培养皿盖盖于含有SDAY培养基的培养皿上。在温度为25℃条件下培养，长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株冠耳霉C.coronatus(Cost.)Batko，转移到SDAY斜面上生长3～4天，在4℃冰箱储存。
复壮：将分离到的菌株在SDAY上培养2～3天后，产生大量分生孢子，再将该分生孢子挑入含1％吐温-80的无菌水，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度(108孢子/ml)的孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于家蝇成虫体表(以虫体表面湿润为度)，保持相对湿度80％以上。收集死虫并保湿，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。
纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新的培养基上。如此培养2～3代，菌株就被纯化。
1.1.3病原菌的鉴定
根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜，镜检菌丝、绒毛孢子和分生孢子的形态。
1.2结果
从被虫生真菌自然侵染的家蝇成虫虫体上分离获得野生菌株，在萨氏琼脂培养基(SDAY)上培养，并回接于家蝇成虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即冠耳霉TH130914。
在光学显微镜(400倍)下，如图1所示，可以看到初生分生孢子大小为(39.42±3.57)μm×(32.41±3.04)μm[(30.40～45.50)×(24.76～40.22)]μm，L/D＝(1.22±0.10)[(1.01～1.38)]，次生分生孢子与初生分生孢子形状相似，但顶部无乳突，大小差异较大，大小为(23.34±5.24)μm×(21.66±5.45)μm[(15.87～36.38)×(13.28～35.56)]μm；具柔毛孢子和小分生孢子。
根据田间感染症状\采集罹病虫体室内分离观察，并根据《中国真菌志第十三卷：虫霉目》(李增智，2000)有关冠耳霉感染症状、分生孢子及柔毛孢子和小分生孢子的形态特征进行鉴定，确定为冠耳霉。
实施例二、冠耳霉纯化菌株生物学特性
2.1材料与方法
2.1.1供试菌株
选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到SDAY上，于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。
2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定
将事先培养好的冠耳霉取一皿用8mm的打孔器打孔，接种于另外一个培养基上，做3个重复，置于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养，每天定时测定其直径并记录，直到菌落长满培养基为止。用直径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1％吐温-80和15mL SDY(萨氏培养液)中，25℃、80r/min振荡培养48h，再转入40mL SDY(萨氏培养液)中，恒温箱中培养48h，所得菌液为初始接种液。初始接种液每10ml转到含40mL的SDY(萨氏培养液)中在20℃，80r/min振荡培养72h，取菌液15ml均匀涂布于水琼脂平板(90mm)上，用滤纸吸去多余水分，5点法放置5块盖玻片(15×15mm)。产孢盛期将平板倒置，使暴露在平板上主动弹落的分生孢子落下，每隔4h时更换盖玻片，在显微镜下每个盖玻片上观察3个视野，记数单位面积上孢子数量。同时，另取10mL菌丝液移至事先称重的滤纸上，用蒸馏水清洗3次后，在50℃下烘干3h后测定菌丝干重。
单位菌丝体产孢量(孢子/mg)，C的计算公式为C＝Dπr2/(VW)，其中D为累计产孢浓度(孢子，mm2)，r为水琼脂平板半径，V为菌液体积，W为菌丝生物量(mg/mL)(Feng et al.，1998)。
2.1.3孢子萌发率的测定
将菌株培养2～3天，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持湿度在100％RH，培养24小时后镜检，每个处理3次重复。
2.2结果
在SDAY培养上于25℃条件下生长良好，表1结果表明，培养前3天时菌落直径平均生长速度为0.76cm/d，其中在培养24、32、36h时菌落生长速度分别为3.34，4.71和6.02cm/d。表2结果表明，该菌株产孢快、产孢量较高，培养至第2天时产孢量可达6.7×105孢子/mg。表3结果表明，24小时孢子的萌发率平均可以达到85％左右，表明该菌株的生长情况较好，生物学活性较好。
表1 菌落直径的生长速度
表2 产孢量测定结果
表3 分生孢子萌发率(24小时)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种冠耳霉(Conidiobolus coronatus)TH130914，于2014年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9019。
2.权利要求1所述的冠耳霉TH130914在家蝇防治方面的应用。
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