CN105087393B - 一种粉蚧耳霉cpmd140813及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种粉蚧耳霉CPMD140813及其应用，该耳霉CPMD140813于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10136。本发明是初次从烟蚜体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对烟蚜致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于烟蚜的防治。

Description

一种粉蚧耳霉CPMD140813及其应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种粉蚧耳霉(Conidioboluspseudococci)CPMD140813及其应用。

背景技术：

烟蚜Myzus persicae是危害烟草的重要害虫，它不仅能刺吸烟叶汁液影响烟草的光合作用,从而影响烟叶生长发育，而且还能携带传播烟草病毒病。对烟蚜的防治，长期以来一直依赖施用化学杀虫剂，然而杀虫剂频繁大量的使用带来了农药环境染污、害虫抗药性及害虫再暴发现象。近年来，利用饲养和释放烟蚜茧蜂防治烟蚜取得了成功，然而烟蚜茧蜂是一种寄生性天敌昆虫,每年需要大量投入人力和物力来饲养获得大量烟蚜茧蜂,才能供田间释放应用,同时烟蚜茧蜂在环境中易受到农药等化学物质的影响,再加上烟蚜茧蜂具有一定的迁飞扩散能力,在田间释放后会出现随意迁移扩散而不能长期在释放田定殖,因而投入量大而增加了应用成本。昆虫病原真菌因其在自然条件下的流行性明显，致病力强，且在建立种群后会引起寄主昆虫的流行病而达到持续控制的作用,再加上昆虫病原真菌是唯一能侵染蚜虫类害虫的病原微生物。由此，以昆虫病原真菌为基础的害虫生物防治已成为害虫生物防治的热点。生物防治对人、畜、植物安全，害虫极少或不产生抗性，有利于环境保护。因此，研究烟蚜的生物防治，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题，已成为烟蚜科学治理和可持续控制的重要课题。

粉蚧耳霉(Conidiobolus pseudococci)属于接合菌亚门虫霉目新月霉科耳霉属。据记载，粉蚧耳霉在安徽东至可侵染大青叶蝉(Tettigella viridis Linn)(同翅目:叶蝉科)，在浙江黄岩侵染橘蚜[Toxoptera citricidus(Kirkaldy)]，而对烟蚜的侵染还未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种粉蚧耳霉CPMD140813及其应用，旨在克服现有粉蚧耳霉未发现能寄生烟蚜的不足，通过生物技术手段防治烟蚜，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。

本发明是这样实现的，一种粉蚧耳霉(Conidiobolus pseudococci)CPMD140813，于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10136，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的进一步的目的在于提供上述粉蚧耳霉CPMD140813在烟蚜防治方面的应用。本发明于2014年7月，在云南省弥渡烟田调查时发现粉蚧耳霉在烟蚜种群中大量发生流行，引起烟蚜种群中90％的个体感染死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的寄生烟蚜、流行性很强的虫生真菌，在烟蚜防治中具有很大的开发应用前景。

本发明从罹病烟蚜上分离获得粉蚧耳霉野生菌株，将野生菌株回接于烟蚜上复壮得到粉蚧耳霉菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的粉蚧耳霉菌。初生分生孢子无色或淡黄色，透明，多核，内含物粗粒状。分生孢子球形，大小为23～37.80um×22.5～35μm,平均为31.8±3.48μm。分生孢子具乳突，乳突略去钝圆或略尖，与孢子体界线清楚，部分孢子乳突与本体交界处有一明显的缢缩痕。次生分生孢子与初生分生孢子同形而略小。分生孢子可方向不定地萌发出多根小芽管，末端形成小分生孢子，球形或近球形，大小为5～10μm±3.8～7.5μm。菌丝段带状，不规则分枝状，平均粗12.3μm。分生孢子梗简单，不分枝，直立。具假根，假根粗状，末端裂片状或毛发状。囊状体缺如。在SDAY培养基上可形成分生孢子和休眠孢子，休眠孢子为假接合孢子，光滑、透明，直径35～55μm。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是初次从烟蚜体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对烟蚜致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于烟蚜的防治。

附图说明：

图1是粉蚧耳霉感染的烟蚜症状及粉蚧耳霉分生孢子的形态特征图；其中，a图为被粉蚧耳霉CPMD140813感染的烟蚜；b图为被粉蚧耳霉CPMD140813的分生孢子。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一、病原菌的分离、鉴定

1.1材料与方法

1.1.1材料

在云南省大理州弥渡县采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病烟蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]。

萨氏培养基(SDAY)：1％蛋白胨+1％酵母粉+4％葡萄糖+1.5～2％琼脂粉+1000mL水。

无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。

培养条件：置于25℃光照(12L：12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管SDAY斜面，培养2-3天，转入4℃冰箱储存。

1.1.2病原菌的分离和纯化

分离：从罹病烟蚜尸体上分离病原菌。将罹病烟蚜带回实验室，将处理好的烟蚜尸体用双面胶粘于培养皿盖上，再将该培养皿盖盖于含有SDAY培养基的培养皿上。在温度为25℃条件下培养，长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株粉蚧耳霉(Conidiobolus pseudococci)，转移到SDAY斜面上生长3-4天，在4℃冰箱储存。

复壮：将分离到的菌株在SDAY上培养2～3天后，产生大量分生孢子，再将该分生孢子挑入含1％吐温-80的无菌水，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度(10⁸孢子/mL)的孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于烟蚜体表(以虫体表面湿润为度)，保持相对湿度80％以上。收集死虫并保湿，得到的虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。

纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新的培养基上。如此培养2～3代，菌株就被纯化。

1.1.3病原菌的鉴定

根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜，镜检菌丝、分生孢子和休眠孢子的形态。

1.2结果

从被虫生真菌自然感染的烟蚜上分离获得野生菌株，在萨氏琼脂培养基(SDAY)上培养，并回接于烟蚜复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即粉蚧耳霉CPMD140813。

在光学显微镜(40×10倍)下，如图1所示，初生分生孢子无色或淡黄色，透明，多核，内含物粗粒状。分生孢子球形，大小为23～37.80μm×22.5～35μm,平均为31.8±3.48μm。分生孢子具乳突，乳突略去钝圆或略尖，与孢子体界线清楚，部分孢子乳突与本体交界处有一明显的缢缩痕。次生分生孢子与初生分生孢子同形而略小。分生孢子可方向不定地萌发出多根小芽管，末端形成小分生孢子，球形或近球形，大小为5～10μm±3.8～7.5μm。菌丝段带状，不规则分枝状，平均粗12.3μm。分生孢子梗简单，不分枝，直立。具假根，假根粗状，末端裂片状或毛发状。囊状体缺如。在SDAY培养基上可形成分生孢子和休眠孢子，休眠孢子为假接合孢子，光滑、透明，直径35～55μm。

根据田间感染症状、采集罹病虫体室内分离观察，并根据《中国真菌志第十三卷：虫霉目》(李增智，2000)有关粉蚧耳霉感染症状、分生孢子的形态特征进行鉴定，确定为粉蚧耳霉。

实施例二、粉蚧耳霉纯化菌株生物学特性

2.1材料与方法

2.1.1供试菌株

选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到SDAY上，于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。

2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定

将事先培养好的粉蚧耳霉取一皿用8mm的打孔器打孔，接种于另外一个培养基上，做3个重复，置于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养，每天定时测定其直径并记录，直到菌落长满培养基为止。用直径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1％吐温-80和15mL SDY(萨氏培养液)中，25℃、80r/min振荡培养48h，再转入40mL SDY(萨氏培养液)中，恒温箱中培养48h，所得菌液为初始接种液。初始接种液每10ml转到含40mL的SDY(萨氏培养液)中在20℃，80r/min振荡培养72h，取菌液15ml均匀涂布于水琼脂平板(90mm)上，用滤纸吸去多余水分，5点法放置5块盖玻片(15×15mm)。产孢盛期将平板倒置，使暴露在平板上主动弹落的分生孢子落下，每隔4h时更换盖玻片，在显微镜下每个盖玻片上观察3个视野，记数单位面积上孢子数量。同时，另取10mL菌丝液移至事先称重的滤纸上，用蒸馏水清洗3次后，在50℃下烘干3h后测定菌丝干重。

单位菌丝体产孢量(孢子/mg)，C的计算公式为C＝Dπr²/(VW)，其中D为累计产孢浓度(孢子，mm²)，r为水琼脂平板半径，V为菌液体积，W为菌丝生物量(mg/mL)(Feng et al.，1998)。

2.1.3孢子萌发率的测定

将菌株培养2～3天，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持湿度在100％RH，培养24小时后镜检，每个处理3次重复。

2.2结果

在SDAY培养上于25℃条件下生长良好，表1结果表明，培养前3天时菌落直径平均生长速度为1.06cm/d，其中在培养0.5、1、1.5、2d时菌落生长速度分别为3.15、4.98、6.27和4.35cm/d。表2结果表明，该菌株产孢快、产孢量较高，培养至第2天时产孢量可达7.52×10⁵孢子/mg。表3结果表明，24小时孢子的萌发率平均可以达到近90％，平均萌发率达90.58％，表明该菌株的生长情况较好，生物学活性较好。

表1菌落直径的生长速度

表2产孢量测定结果

表3分生孢子萌发率(24小时)

实施例三、粉蚧耳霉纯化菌株对烟蚜的室内毒力测定

3.1、材料与方法

3.1.1供试虫源

在室内利用烟株饲养繁殖烟蚜,选择健康、大小一致的同日龄烟蚜作为试虫，将供试烟蚜置于光照培养箱中，在25±1℃、12L：12D的条件下饲养。

3.1.2孢子悬浮液的制备

取长势良好的纯化粉蚧耳霉用无菌水将分生孢子洗下并过滤配置成10⁸孢子/mL分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，用含0.5％吐温80的无菌水依次稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴五个浓度梯度的孢子悬浮液，以含0.5％吐温80的无菌水为空白对照，用于致病力测定。

3.1.3孢子浴法

采用“孢子浴”法接种。接种时，将产孢盛期的水琼脂平板倒置于盛有烟草叶片的培养皿上，使叶片上的蚜虫暴露在平板上主动弹落的分生孢子“雨”下，每隔1/4时间将培养皿旋转90°使孢子能够均匀的落到蚜虫体表。同时在菜叶上放一盖玻片(15×15mm)收集孢子，10点取样镜检(1.257mm²/每视野)并计数孢子量以确定蚜虫实际接种的剂量(孢子数/mm²)，获得5个剂量处理，相对湿度控制在85％以上，25℃、12D:12L光周期的光照培养箱。接种后每隔24h观察被接种蚜虫的死亡情况，并作记录，发现的病死蚜虫及时移出，保湿过夜培养后镜检确诊死因。

3.2、结果

测定了粉蚧耳霉对烟蚜的毒力，实验结果表明：粉蚧耳霉菌株CPMD140813对烟蚜具有较高的毒力，供试烟蚜在不同接种剂量下的累积死亡率结果表明(表4)，随接种剂量的增加，各种蚜虫被感染致病死亡率增加，在剂量15.72、24.56、35.43、47.65、58.54孢子/mm²的接种剂量下,接种处理后第5天时烟蚜的累积校正死亡率分别为34.65％、45.48％、75.52％、87.45％、98.68％。该菌株对烟蚜的毒力回归方程为Y＝4.26+0.50X(r＝0.92)，式中Y代表死亡率机率值，X代表接种剂量孢子/mm²。LC₅₀(孢子/mm²)为30.19孢子/mm²，LT₅₀＝3.38天。表明粉蚧耳霉菌株CPMD140813具有开发为控制烟蚜微生物农药的潜力。

表4接种粉蚧耳霉后烟蚜的累积死亡率(％)

该菌株是我们首次从烟蚜成蚜上分离纯化获得的粉蚧耳霉菌株CPMD140813，CGMCC No.10136，该菌株在温度为25℃、相对湿度80％以上在PDA培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高，孢子萌发快、侵染速度快。其分生孢子对烟蚜的致病力较好，可以广泛地用于烟蚜的生物防治。此外，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治烟蚜，可谓典型的害虫生物防治，可避免化学农药所带来的害虫抗药性的产生及环境污染等问题，将为烟蚜绿色防控提供依据，符合绿色植保发展需要。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种粉蚧耳霉(Conidiobolus pseudococci)CPMD140813，于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10136。

2.权利要求1所述的粉蚧耳霉CPMD140813在烟蚜防治方面的应用。