KR100815531B1 - 곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균에 관한 것으로, 특히 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis)(Waterhouse)로부터 분리된 곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균인 프로비덴시아 sp. ANU201 (Providencia sp. ANU201, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91278P) 및 플라보박테리움 sp. ANU301 (Flavobacterium sp. ANU301, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91279P)에 관한 것이다. 본 발명에서는 이들 병원세균의 살충효과가 밝혀지고, 해충의 생물적 방제 인자로서의 용도가 제공된다.
곤충병원선충, 곤충병원세균, 등얼룩풍뎅이, Entomopathogenic Nematode, Blitopertha orientalis, Providencia vermicola, Flavobacterium

Description

곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균 {New Entomopathogenic Bacteria Isolated from an Entomopathogenic Nematode}
도 1은 Providencia sp. ANU201 (KACC 91278P)과 Flavobacterium sp. ANU301 (KACC 91279P)의 성장패턴을 나타낸 그래프이다.
Ciche TA, Darby C, Ehlers RU, Forst S, Goodrich-Blair H. 2006. Dangerous liaisons: the symbiosis of entomopathogenic nematodes and bacteria. Biol. Control 38: 22-46.
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본 발명은 곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균에 관한 것으로, 특히 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis)(Waterhouse)로부터 분리된 곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균인 프로비덴시아 sp. ANU201 (Providencia sp. ANU201, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91278P) 및 플라보박테리움 sp. ANU301 (Flavobacterium sp. ANU301, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91279P)에 관한 것이다.
농경지는 물론 골프장, 각종 운동 경기장, 공원 등의 잔디밭에서도 병충해를 방제하기 위해 살충제가 사용되고 있다. 현재의 살충제는 대부분 유기 합성된 화학농약으로, 화학농약은 그 동안 해충 방제에 중요 방제자로서 역할을 담당하여 왔으나, 이러한 화학 살충제의 과다 사용과 연용은 해충의 약제에 대한 저항 성(resistance) 발현, 기존 생물들의 먹이사슬 파괴 및 이로 인한 제2차 해충의 격발(resurgence) 현상 등과 같은 또 다른 많은 문제를 낳고 있다. 그리고 그 결과 화학농약의 사용은 더욱 가속화되고, 환경오염 (environmental pollution) 또한 더욱 심각해지는 악순환이 초래되고 있다.
이러한 화학농약의 폐단을 보완하고자 생물농약 (biopesticide)의 개발이 진행되고 있다. 그러나 아직까지 생물농약은 선택성 때문에 대상 해충의 종류가 제한되어 있고, 화학농약과 비교하여 살충효과면에서 문제점들이 지적되고 있다.
본 발명에서는 국내 골프장에 서식하는 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis (Waterhouse)로부터 곤충병원선충을 분리하고, 이 곤충병원선충으로부터 공생세균을 분리, 동정한다. 본 발명은 특히 이 공생세균의 살충효과를 밝히고, 이들 병원세균을 해충의 생물적 방제 인자로 응용하는 것에 관한 것이다.
본 발명자들은 국내 골프장에 서식하는 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis (Waterhouse)에서 곤충병원선충을 분리하였고, 이 선충으로부터 공생세균인 새로운 균주를 분리, 동정하게 되었다. 즉, 본 발명에서는 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis)(Waterhouse)로부터 분리한 곤충병원선충에서 유래한 새로운 곤충병원세균인 프로비덴시아 sp. ANU201 (Providencia sp. ANU201, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91278P) 및 플라보박테리움 sp. ANU301 (Flavobacterium sp. ANU301, 기탁기관: 농업생명공학 연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91279P)이 분리, 동정된다.
또한, 본 발명에서는 이들 병원세균의 살충효과가 밝혀지고, 해충의 생물적 방제 인자로서의 용도가 제공된다.
기타 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 더 잘 알게 될 것이다.
본 발명에서는, 국내 골프장에 피해를 주고 있는 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis (Waterhouse)로부터 곤충기생선충을 채집하고 동정하였다. 동정 결과, 이 선충은 부틀레리우스(Butlerius)에 속하는 종으로 판명되었다. 부틀레리우스(Butlerius) 속에 속한 선충은 토양에 서식하면서 일부 딱정벌레류에서 발견되었다(Hunt, 1980). Butlerius 선충류는 주로 다른 선충을 섭식하는 역할자로서 알려져 있다(Taylor, 1964; Pillai and Taylor, 1968; Grootaert and Jacques, 1979). 최근 남아프리카공화국의 그레이박사(Dr. Gray) 연구실에서 토양중 서식하는 곤충친화형 선충으로서 Butlerius sp. MJ-2005의 18S rRNA gene의 염기서열을 발표하였다(www.ncbi.nlm.nih.gov/: NCBI access number DQ121437).
곤충병원선충의 감염태는 이들 장내에 존재하는 공생세균의 도움으로 대상 곤충을 치사시키고, 기생생활을 유지하게 된다(Ciche et al., 2006). 이들 선충은 헤테로랍디티다에(Heterorhabditidae)와 스테이너네마티다에(Steinernematidae)의 두 개과에 분포하고 있으며, 이들의 공생세균은 장내세균과의 포토랍두 스(Photorhabdus)와 제노랍두스(Xenorhabdus) 속에 각각 속한 것으로 알려지고 있다(Poinar and Thomas, 1966; Poinar et al., 1977). 최근의 연구에서 프로비덴시아 버미콜라(Providencia vermicola)가 스테이너네마 써모필럼(Steinernema thermophilum)에서 발견되어, 전형적 공생세균 이외의 다른 속에 속하는 세균이 곤충병원선충에 공생한다는 것이 밝혀지고 있다(Somvanshi et al., 2006).
본 발명에서는, 곤충병원선충인 부트렐리우스 속(Butlerius sp.)에 공생하는 두 세균을 분리, 동정하였다. 우점종은 엔테로박테리아과(Enterobacteriaceae)에 속하는 프로비덴시아 sp. ANU201 (Providencia sp. ANU201, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91278P)이고, 다른 하나는 플라보박테리아과(Flavobacteriacea)에 속하는 플라보박테리움 sp. ANU301 (Flavobacterium sp. ANU301, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91279P)이다.
상기 두 균주는 모두 주요 전작해충인 파밤나방(Spodoptera exigua)에 대해 병원성을 보였다. 실험결과, Providencia sp. ANU201 (KACC 91278P)이 Flavobacterium sp. ANU301 (KACC 91279P)에 비해 병원성이 높았으며, 두 세균은 상호 배양 촉진 효과를 보였다. 이 두 균주는 해충의 생물적 방제 인자로서 이용될 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 토대로, 본 발명에서는 프로비덴시아 sp. ANU201 (KACC 91278P) 및 플라보박테리움 sp. ANU301 (KACC 91279P)의 해충 방제제 또는 식물병원균 방제제로서의 용도가 제공된다.
이하, 실험예와 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실험예 및 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.
선충동정
선충의 ITS (internal transcribed spacer) 염기서열 분석을 위해 게놈 DNA가 0.5g의 선충체로부터 추출되었다(Sambrook et al., 1989). ITS 영역은 이 부위의 일반 보존영역 프라이머인 5'-TTGATTACGTCCCTGC-3'(서열 1)과 5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'(서열 2)를 이용하였다. Polymerase chain reaction은 사슬분리 94℃에서 1분, 48℃에서 1분, 72℃에서 2분씩 35회 반복 반응함으로써 이루어졌다. 반응용액은 Taq polymerase (Bioneer, Daejon, Korea)의 제품 지시사항에 따랐다.
표 1은 한국에서 분리된 우점종 곤충병원선충의 partial 18S rDNA, complete internal transcribed spacer-1, 및 partial 5.8S rDNA의 염기서열을 비교한 것이다. 서열 3은 Oriental beetle(Blitopertha orientalis)로부터 분리된 선충의 partial 18S rDNA, complete internal transcribed spacer-1, 및 partial 5.8S rDNA 의 염기서열이다. rDNA의 영역 가운데 분류학적 유전좌위인 ITS (intergenic transcription site)의 DNA 염기서열을 바탕으로 Butlerius sp. MJ-2005와 유사도 가 가장 높은 것으로 판명되었다.
Figure 112006092122769-pat00001
공생세균 동정
Butlerius sp.에 존재하는 공생세균을 분리하기 위해 약 2,000마리의 선충을 250 ppm의 스트렙토마이신이 함유된 0.06%의 소디움 하이포클로라이드(sodium hypochloride)를 사용하여 30분간 표면살균하였다. 이후 살균수로 3회 세척한 후 균질하여 얻은 세균추출용액을 TSA(tryptic soy agar)에 도말하였다. 세균의 증식은 25℃ 혐기성 배양기에서 48시간 배양하였다.
배양 후 얻어진 세균은 모두 유사한 균총 구조를 가졌으나, 균총의 색깔이 흰색과 노랑색으로 구분되었다. 대부분은 흰색의 균총이었으며, 일부 노랑색의 균총이 포함되어 있었다.
1. 세균 16S rDNA 염기서열동정
각 세균의 게놈 DNA가 Sambrook et al. (1989) 방법으로 추출되었다. 16S DNA 영역은 이 부위의 일반 보존영역 프라이머인 5'-GAAGAGTTTGATCATGGCTC-3'(서열 4)과 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(서열 5)를 이용하였다. Polymerase chain reaction은 사슬분리 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분씩 35회 반복 반응함으로써 이루어졌다. 반응용액은 Taq polymerase (Bioneer, Daejon, Korea)의 제품 지시사항에 따랐다.
서열 6은 흰색 균주의 16S rDNA 염기서열이다. 서열 7은 노란색 균주의 16S rDNA 염기서열이다. 표 2는 우점종인 흰색 균주와 노란색 균주의 16S rDNA 염기서열을 비교한 것이다. 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 흰색 균주는 Providencia vermicola (서열 6), 노랑색 균주는 Empedobacter brevis (Flavobacterium의 일종) (서열 7)와 가장 유사도가 높은 것으로 판명되었다.
Figure 112006092122769-pat00002
2. 세균의 형태 및 생화학적 동정
흰색과 노랑색 콜로니의 두 균주에 대해서 과(family) 동정을 위한 주요 형태학적 특징을 조사하였다. 결과는 다음의 표 3과 같다. 흰색 균주는 장내세균과와 동일한 반응을 보인 반면, 노랑색 균주는 운동성과 편모 구조에서 뚜렷한 차이를 나타냈다. 이러한 결과는 노랑색 균주가 장내세균과에 속하지 않음을 의미하는 것이다.
Figure 112006092122769-pat00003
두 균주의 속(genus) 동정을 위한 주요 생화학적 특징을 표 4에 나타내었다. 그 결과 흰색 균주는 Providencia, 노랑색 균주는 Flavobacterium으로 각각 동정되었다.
Figure 112006092122769-pat00004
종 동정을 위해서 Biolog 미생물동정 장치의 GN 진단키트를 제조회사의 사용자 매뉴얼에 따라 처리한 후 분석하였다. 이 동정장치를 통해 얻어진 다양한 탄소원 이용 특징을 흰색균주는 표 5에, 노란색 균주는 표 6에 나타냈었다. 이러한 결과를 Somvanshi et al. (2006)이 보고한 P. vermicola의 특성 및 버기스 매뉴얼(Bergey's manual)에 기록된 Flavobacterium sp.의 특성과 비교하였다. 그 결과 흰색 균주는 프로비덴시아 버미콜라(Providencia vermicola)에 속하는 새로운 균주로, 노랑색 균주는 플라보박테리움 속의 새로운 세균(Flavobacterium sp.)으로 각각 동정되었다.
Figure 112006092122769-pat00005
Figure 112006092122769-pat00006
공생세균의 생물학적 특징
1. 공생세균의 성장 패턴
선충의 체내에 존재하는 프로비덴시아 sp. ANU201(KACC 91278P) 및 플라보박테리움 sp. ANU301 (KACC 91279P)의 존재 비율을 조사하기 위해 멸균 처리된 선충 개체로부터 세균을 추출하여 도말하였다. 성장된 세균 수를 측정한 결과, 프로비덴시아 sp. ANU201 (KACC 91278P)과 플라보박테리움 sp. ANU301 (KACC 91279P)은 약 5:1의 밀도비를 보였다.
두 세균이 TSB 배지에서 성장하는 속도를 각 세균별로 조사하고 또한 혼합하여서도 조사하였다. 이를 위해 단일균총의 각 세균을 20 ㎖ 배양액 속에서 37℃ 온도로 16시간 배양하였다. 이후 1L 배양액에 약 2.7 x 107 cfu의 세균을 단독 또는 혼합 배양하였다. 성장은 600 nm에서 흡광도 변화로 측정하였다. 결과는 도 1과 같다.
표 7은 배양 12시간 후의 균 밀도를 나타낸 것이다. 균 밀도는 cfu(colony forming units)로 나타내었다. 배양 12시간 이후 모든 처리에서 최대 성장기에 이르게 되었다. 그러나 두 세균을 혼합하여 배양한 배양액("P+F"로 표시)에서 가장 많은 균총수를 보였고, 이때 Providencia sp. ANU201 (KACC 91278P) 배양액("P"로 표시)이 Flavobacterium sp. ANU301 (KACC 91279P) 배양액("F"로 표시)에 비해 약 1.5배 정도 높은 밀도를 나타냈다. 이러한 결과는 이들 두 세균이 서로의 증식에 도움을 준다는 사실을 보여주는 것이다.
Figure 112006092122769-pat00007
2. 공생세균의 병원성 검정
두 세균의 병원성을 검정하기 위해 파밤나방 5령충 혈강에 세균을 직접 주입하였다. 결과는 표 8과 같다. 처리된 파밤나방은 24시간 이후부터 치사하기 시작했고, 반수치사약량 조사는 48시간에 이루어졌다. 두 세균 모두 파밤나방을 치사시킬 수 있는 병원성을 지녔지만, 반수치사약량 수치로 볼 때 Providencia sp. ANU201 (KACC 91278P)("P"로 표시)이 Flavobacterium sp. ANU301 (KACC 91279P)("F"로 표시) 보다 현격하게 높은 병원성을 갖는 것으로 나타났다.
Figure 112006092122769-pat00008
두 세균의 섭식 병원성을 파밤나방 3령충을 대상으로 조사하였다. 서로 다른 세균 농도용액(102∼107/㎖)에 배추잎을 침지시킨 후 건조시켰다. 이렇게 처리된 배추잎을 파밤나방 3령충에게 공급하고, 25℃ 온도조건에서 24시간 섭식시켰다. 이후 24시간 간격으로 사망 수를 조사하였다. 결과는 표 9와 같다. 반수치사약량 수치로 볼 때 Providencia sp. ANU201 (KACC 91278P)("P"로 표시)이 Flavobacterium sp. ANU301 (KACC 91279P)("F"로 표시) 보다 높은 병원성을 보였다. 그러나 혼합 세균액("P+F")은 단일 처리된 Providencia sp. ANU201 (KACC 91278P) 보다 높은 병원성을 보이지는 않았다.
Figure 112006092122769-pat00009
본 발명에서 분리, 동정된 새로운 곤충병원세균인 프로비덴시아 sp. ANU201 (KACC 91278P) 및 플라보박테리움 sp. ANU301 (KACC 91279P)은, 해충의 생물적 방제 인자로서 농업 분야나 각종 운동 경기장, 골프장, 공원 등의 잔디 및 식물 보호에 활용될 수 있다.
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Claims (6)

  1. 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis)로부터 분리된 곤충병원선충에서 유래한 프로비덴시아 sp. ANU201 (Providencia sp. ANU201, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91278P).
  2. 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis)로부터 분리된 곤충병원선충에서 유래한 플라보박테리움 sp. ANU301 (Flavobacterium sp. ANU301, 기탁기관: 농업생명공학연구원, 수탁일: 2006년 11월 22일, 수탁번호: KACC 91279P).
  3. 프로비덴시아 sp. ANU201 (KACC 91278P) 또는 플라보박테리움 sp. ANU301 (KACC 91279P) 또는 이들을 함께 포함하는 해충 방제제.
  4. 삭제
  5. 프로비덴시아 sp. ANU201 (KACC 91278P) 또는 플라보박테리움 sp. ANU301 (KACC 91279P) 또는 이들을 함께 사용하는 해충 방제방법.
  6. 삭제
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