CN1792170A - 苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂及制备方法 - Google Patents

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闫建平
张景涛
袁志明
蔡全信
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Abstract

本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂及制备方法，该微胶囊悬浮剂由苏云金芽孢杆菌、海藻酸钠、氯化钙、聚乙二醇6000、苯甲酸钠、黄原胶、水按一定比例配制而成。其步骤是首先进行苏云金芽孢杆菌发酵；其次是将苏云金芽孢杆菌发酵液加入海藻酸钠，混匀；第三是将混匀液泵入雾化装置，喷入凝固浴溶液并搅拌；第四是静置沉淀，加入苯甲酸钠、黄原胶制成悬浮剂。本发明配方合理，抗紫外性能好，杀虫效率高，防治效果好，成本低廉，生产工艺简单，解决了海藻酸钠微胶囊规模化生产的问题。

Description

苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂及制备方法
                            技术领域
本发明涉及生物农药领域，更具体涉及一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，该剂尤其适用于生物防治，同时还涉及该剂的制备方法。
                            背景技术
苏云金芽孢杆菌为一种绿色生物杀虫剂，毒力强特异性高，对人及环境无害。但其活性成分芽孢和晶体对阳光中的紫外线极其敏感，在野外环境中持效期短，已成为其推广和应用的瓶颈。此外，苏云金芽孢杆菌的气味易引起目标昆虫拒食，芽孢和晶体易被雨水冲刷等原因，使其实际使用效果不够理想。
微胶囊化是解决苏云金芽孢杆菌野外使用的最佳方法，它可以抵抗紫外线照射，缓慢释放从而延长苏云金芽孢杆菌使用的残效期等。但限于微胶囊化的载药量、成本和工艺等问题，目前我国还没有商品化的苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂。
目前世界上公认的海藻酸钠微胶囊化方法有三种：1.锐孔滴入法，即将含有药物的海藻酸钠溶液通过不同孔径的针头滴入轻轻搅拌的二价交联溶液，微胶囊的大小取决于针头的大小和海藻酸钠的黏度。2.乳化凝结法为一种水包油乳化技术，这种方法所得微胶囊的大小高度依赖搅拌速度和交联溶液的添加速率。3.复凝集法，其原理是利用带有相反电荷的胶体溶液混合时，因电荷中和而产生凝集。目前，海藻酸钠与明胶、壳聚糖、白蛋白等复凝集微胶囊已成功制备。前一种方法工艺简单，但微胶囊粒径较大，速率慢不宜大规模生产。后两种可以大规模生产但工艺复杂。本文所采用改进的海藻酸钠微胶囊化方法，成本低，药物包封率高且其生产工艺简单，易实现规模生产。
                            发明内容
本发明的目的在于提供一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬剂，配方合理，杀虫效率高，防治效果好，成本低廉。尤其是该剂紫外抗性强，野外残效期长。
本发明的另一个目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬剂的制备方法，药物包封率高，生产工艺简单、稳定，解决了海藻酸钠微胶囊规模生产的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
主要成份为苏云金芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌(B.t.kurstaki一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽胞杆菌菌株及制备方法，专利号：ZL 02 1 15581.X；B.t.israelensis中国病毒学，2000年15卷：112-115)为一种绿色生物杀虫剂，毒力强特异性高，对人及环境无害，是世界上最成功的生物杀虫剂之一。但其活性成分芽孢和晶体对阳光中的紫外线极其敏感，在野外环境中持效期短。此外，苏云金芽孢杆菌的气味易引起目标昆虫拒食，芽孢和晶体易被雨水冲刷等原因，使其实际使用效果不够理想。微胶囊化是解决苏云金芽孢杆菌野外使用的最佳方法，它可以抵抗紫外线照射，缓慢释放从而延长苏云金芽孢杆菌使用的残效期等。但限于微胶囊化的载药量、成本和工艺等问题，目前我国还没有商品化的苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂。本发明的微胶囊悬浮剂，它由以下重量配比的原料制成：
配方一A苏云金芽孢杆菌(40-50亿/ml)    8-10％
      B海藻酸钠                      1-4％
      C氯化钙(CaCl2)               1-4％
      D聚乙二醇PEG6000溶液           1-2％
      E苯甲酸钠溶液                  0.3-0.5％
      F黄原胶                        0.2-0.3％
      G水                            79.2％-88.5％
配方二A苏云金芽孢杆菌(40亿/ml)       10％
      B海藻酸钠                      4％
      C氯化钙(CaCl2)               4％
      D聚乙二醇PEG6000溶液           2％
      E苯甲酸钠溶液                  0.3％
      F黄原胶                        0.2％
      G水                            79.5％配方三A苏云金芽孢杆菌(46亿/ml)       9％
      B海藻酸钠                      3％
      C氯化钙(CaCl2)               2％
      D聚乙二醇PEG6000溶液           2％
          E苯甲酸钠溶液              0.3％
          F黄原胶                    0.3％
          G水                        83.4％
配方四A苏云金芽孢杆菌(45亿/ml)       8％
          B海藻酸钠                  2％
          C氯化钙(CaCl2)           2％
          D聚乙二醇PEG6000溶液       2％
          E苯甲酸钠溶液              0.5％
          F黄原胶                    0.2％
          G水                        85.3％
其步骤是：
A发酵：苏云金芽孢杆菌经德国贝朗BIOSTAT C-20发酵罐38-42小时发酵，镜检30％芽孢释放放罐；
B加入0.75-3％海藻酸钠，搅拌混匀；
C将混匀液泵入雾化装置，距液面10-20厘米喷入含1-4％氯化钙(CaCl2)和1-2％聚乙二醇(PEG)的凝固浴溶液并搅拌；
D静置沉淀24小时，加入0.3-1％的苯甲酸钠和0.2-0.3％黄原胶制成悬浮剂。
本发明的优点是(1)生产工艺简单稳定，成本低廉，芽孢及晶体载药量4.45x1011CFU/g，包封率可达86.8％.微胶囊粒经分布范围均匀(见图1)，70％～80％分布于200～600微米之间。(2)紫外抗性得以明显改善(见图2)，常温保藏一年杀虫活性没有显著下降。(3)囊壁材料可使得芽孢和晶体免受外界温度、氧气、紫外线、雨淋等环境因素的影响。且随着囊壁的自然降解，缓慢释放到环境中，从而减少施药量和施药频率，降低了农业综合成本。实验条件下，在室温PH5.0缓冲液中，三个月累积释放85.84％
同时，本发明的微胶囊可以为药物缓释剂型、细胞及酶的固定化、发酵工程、组织工程、基因治疗等方面提供有益参考。
                        附图说明
图1为本发明微胶囊光镜(10x)及电镜(1060x)照片，从图中可见本发明微胶囊成球性好，粒经分布范围均匀。
图2为本发明不同浓度海藻酸钠微胶囊紫外抗性曲线，从图中可见本发明微胶囊对细菌无毒，并可以有效保护菌体免受紫外线伤害。
                        具体实施方式
一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，它由以下重量配比的原料制成：(所涉及的苏云金芽孢杆菌不占本发明的重量配比。)
实施例1：
A苏云金芽孢杆菌(48亿/ml)      10％
B海藻酸钠                     3.5％
C氯化钙(CaCl2)              3％
D聚乙二醇PEG6000溶液          2％
E苯甲酸钠溶液                 0.3％
F黄原胶                       0.3％
G水                           80.9％
A、苏云金芽孢杆菌经德国贝朗BIOSTAT C-20发酵罐38或39或40或41或42小时发酵，镜检30％芽孢释放放罐。
B、加入海藻酸钠，搅拌混匀。
C、将混匀液泵入雾化装置，距液面10或12或16或19或20厘米喷入等体积的含氯化钙(CaCl2)和聚乙二醇(PEG)的凝固浴溶液并搅拌。
D、静置沉淀24小时，加入苯甲酸钠和黄原胶制成悬浮剂
上述实施例的苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂的杀虫活性见表1
表1
  菌株   试虫   感染时间   毒力回归方程   相关系数   LC50(ul/ml)±SEM
  B.t.israelensis未微胶囊化微胶囊化   二龄致倦库蚊 24h24h Y＝3.43X-17.44Y＝1.08X-1.06 0.950.95 0.34±0.060.04±0.003
  B.t.kurstaki未微胶囊化微胶囊化   初孵棉铃虫 72h72h Y＝0.62X+0.13Y＝1.47X-5.02 0.950.95 3.56±0.1360.67±0.019
本发明为海藻酸钠微胶囊化苏云金芽孢杆菌未经\经紫外照射2小时后对目标昆虫在30℃下进行生物测定。结果表明采用本发明生产的微胶囊化苏云金芽孢杆菌标准株B.t.israelensis和B.t.kurstaki HD-1经紫外照射(波长254nm高度25cm)2小时后对目标昆虫毒力的LC50值分别降低了88.2％和81.2％。
实施例2：
A苏云金芽孢杆菌(45亿/ml)    9％
B海藻酸钠                   2.5％
C氯化钙(CaCl2)            3％
D聚乙二醇PEG6000溶液        1.5％
E苯甲酸钠溶液               0.3％
F黄原胶                     0.2％
G水                         83.5％
制备方法与实施例1相同。
实施例3：
A苏云金芽孢杆菌(47亿/ml)    10％
B海藻酸钠                   2.6％
C氯化钙(CaCl2)            2.4％
D聚乙二醇PEG6000溶液        1.2％
E苯甲酸钠溶液               0.4％
F黄原胶                     0.2％
G水                         83.2％
制备方法与实施例1相同

Claims (8)

1、一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，它由以下重量配比的原料制成：
A 苏云金芽孢杆菌                                     8-10％
B 海藻酸钠                                           1-4％
C 氯化钙                                             1-4％
D 聚乙二醇6000溶液                                   1-2％
E 苯甲酸钠溶液                                       0.3-0.5％
F 黄原胶                                             0.2-0.3％
G 水                                                 79.2-88.5％。
2、根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，其特征在于它由以下重量配比的原料制成：
A 苏云金芽孢杆菌                                     10％
B 海藻酸钠                                           4％
C 氯化钙                                             4％
D 聚乙二醇PEG6000溶液                                2％
E 苯甲酸钠溶液                                       0.3％
F 黄原胶                                             0.2％
G 水                                                 79.5％。
3、根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，其特征在于它由以下重量配比的原料制成：
A 苏云金芽孢杆菌                                     8％
B 海藻酸钠                                           3％
C 氯化钙                                             2％
D 聚乙二醇PEG6000溶液                                2％
E 苯甲酸钠溶液                                       0.3％
F 黄原胶                                             0.2％
G 水                                                 84.5％。
4、根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，其特征在于它由以下重量配比的原料制成：
苏云金芽孢杆菌                                    10％
B 海藻酸钠                                        2％
C 氯化钙                                          2％
D 聚乙二醇PEG6000溶液                             2％
E 苯甲酸钠溶液                                    0.5％
F 黄原胶                                          0.3％
G 水                                              83.2％。
5、根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，其特征在于它由以下重量配比的原料制成：
A 苏云金芽孢杆菌                                  9％
B 海藻酸钠                                        3.5％
C 氯化钙                                          3％
D 聚乙二醇PEG6000溶液                             2％
E 苯甲酸钠溶液                                    0.3％
F 黄原胶                                          0.2％
G 水                                              82.0％。
6、根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，其特征在于它由以下重量配比的原料制成：
A 苏云金芽孢杆菌                                  10％
B 海藻酸钠                                        2.5％
C 氯化钙                                          3％
D 聚乙二醇PEG6000溶液                             1.5％
E 苯甲酸钠溶液                                    0.3％
F 黄原胶                                          0.2％
G 水                                              82.5％。
7、根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂，其特征在于它由以下重量配比的原料制成：
A 苏云金芽孢杆菌                                  9％
B 海藻酸钠                                    2.6％
C 氯化钙                                      2.4％
D 聚乙二醇PEG6000溶液                         1.2％
E 苯甲酸钠溶液                                0.4％
F 黄原胶                                      0.3％
G 水                                          84.1％。
8、一种用于实现权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂的制备方法，它包括下列步骤：
A、发酵：苏云金芽孢杆菌经发酵罐38-42小时发酵，镜检30％芽孢释放放罐；
B、加入海藻酸钠，搅拌混匀；
C、将混匀液泵入雾化装置，距液面10-20厘米喷入含氯化钙和聚乙二醇的凝固浴溶液并搅拌；
D、静置沉淀24小时，加入苯甲酸钠和黄原胶制成悬浮剂。
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