CN112568240A - 一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法 - Google Patents

一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法。本发明将优化的苏云金芽孢杆菌HD109菌株与茶皂素复配，然后通过海藻酸钠、明胶和氯化钙制备成微胶囊杀虫剂，不仅减少药剂的使用量，还解决了苏云金芽孢杆菌不耐受紫外光照射的问题，从而提高杀虫防病效果，使药效更持久。

Description

一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法
技术领域
本发明属于微胶囊杀虫剂制备技术领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)属革兰氏阳性菌，在其芽孢形成的过程中会产生杀虫晶体蛋白——伴胞晶体，使得Bt具有特殊的杀虫活性，而被广泛应用于卫生害虫、林业、农业的生物防治。但Bt制剂还存在杀虫谱窄、防效不稳定、杀虫速度缓慢等缺陷，因此，为了提高Bt制剂的防治效果，对其增效研究已经成为世界研究热点之一。
茶皂素(Tea Saponin)是一种植物源化合物，有杀螨、杀菌、杀虫等生物活性。国内外研究表明茶皂素作为一种生物农药增效剂，不仅能改变杀菌剂的物理性质、化学性质，还能增加某些杀菌剂在植物叶表的附着力，提高农药的有效成分在植物体内的渗透。采用叶片药膜法研究茶皂素对小菜蛾的拒食作用与毒力，结果表明茶皂素对小菜蛾有拒避作用但无毒杀作用，在一定程度上会抑制幼虫期小菜蛾的生长。研究茶皂素对草甘磷、杀虫双、乐果、苯丁锡等农药沉积量、表面张力、接触角等性质的影响，表明茶皂素能大大降低药液的表面张力，减小药液在靶标生物表面的接触角，从而提高了药液在靶标生物的有效沉积量，使之展布、湿润，有利于药效充分发挥。
目前Bt制剂已有120多种，占微生物农药的90％以上，其常用剂型包括可湿性粉剂、油剂、油乳剂、悬浮剂、缓释剂等，其中可湿性粉剂具有不含有机溶剂、有效成分含量较高、防治效果好等优点，在农药市场中占比重较大，但可湿性粉剂悬浮率较低，易导致喷雾器的喷头堵塞，且药液的浓度不均匀易产生药害；乳油是各国农药制剂主要剂型之一，具有制备工艺简单，防治效果佳的特点，但生产时消耗大量的二甲苯、甲苯等有机溶剂，会污染环境，有待进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将苏云金芽孢杆菌HD109(Bacillus thuringiensis entomocidus HD109)菌株以1.5-1.6％的接种量接入到含1.9-2.1g/L的L蔗糖、18-22g/L的蛋白胨和2.3-2.6％胶体几丁质的优化培养基中，该优化培养基的初始pH为7.9-8.1，在29-31℃并180-220rpm的条件下，振动培养45-50h，获得优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株；
(2)将上述优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株以0.8-1.2％的接种量接入到BPY培养基中，在29-31℃并190-210pm的条件下，振荡培养20-25h以活化菌种，再将其以2.8-3.2％的接种量转接入另一BPY培养基中，在29-31℃并190-210pm的条件下，振荡培养50-60h后，进行离心分离，弃上清液，获得菌体胞晶混合物；
(3)将上述菌体胞晶混合物进行冷冻干燥，然后研磨，获得菌体胞晶混合物冻干粉；
(4)将上述菌体胞晶混合物冻干粉用水稀释2000～3000倍后，与浓度为250-4000mg/L的茶皂素溶液复配制得复配溶液；
(5)将上述复配溶液、浓度为0.8-1.2wt％的海藻酸钠溶液和浓度为2.8-3.2wt％的明胶溶液于38-41℃下以380-410rpm的速度搅拌混合均匀后，用醋酸调剂pH至3.8-4.0，接着降温至24-26℃，以290-310rpm的速度搅拌混合均匀，然后加入浓度为0.18-0.22wt％的氯化钙溶液以固化囊壁，即得所述苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂；上述复配溶液、海藻酸钠溶液、明胶溶液和氯化钙溶液的体积比为18-22∶18-22∶18-22∶0.14-0.16。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将所述苏云金芽孢杆菌HD109菌株以1.572％的接种量接入到含2g/L的L蔗糖、20g/L的蛋白胨和2.5％胶体几丁质的优化培养基中，该优化培养基的初始pH为8，在30℃并200rpm的条件下，振动培养48h，获得优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：将所述优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株以0.1％的接种量接入到BPY培养基中，在30℃并200pm的条件下，振荡培养24h以活化菌种，再将其以3％的接种量转接入另一BPY培养基中，在30℃并200pm的条件下，振荡培养50-60h后，进行离心分离，弃上清液，获得菌体胞晶混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中的冻干具体为：将所述菌体胞晶混合物装载培养皿中，用保鲜膜密封并扎孔，然后置于-25℃下，预冻24h，用真空干燥机冻干处理24h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)：将所述菌体胞晶混合物冻干粉用水稀释2000-3000倍后，与浓度为250-4000mg/L的茶皂素溶液以0.8-1.2∶0.8-1.2的体积比复配制得复配溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)为：将所述复配溶液、浓度为1wt％的海藻酸钠溶液和浓度为3wt％的明胶溶液于40℃下以400rpm的速度搅拌混合均匀后，用醋酸调剂pH至3.9，接着降温至25℃，以300rpm的速度搅拌混合均匀，然后加入浓度为0.2wt％的氯化钙溶液以固化囊壁，即得所述苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂。
进一步优选的，上述复配溶液、海藻酸钠溶液、明胶溶液和氯化钙溶液的体积比为20∶20∶20∶0.15。
在本发明的一个优选实施方案中，所述胶体几丁质的制备方法为：将几丁质与浓度为36-38wt％的HCl溶液混合，搅拌25-35min后，加入1-3℃的蒸馏水搅匀，在3-5℃下静置22-26h，待分层后弃上清液，重新加1-3℃的蒸馏水，重复以上步骤至pH为4.8-5.2时，弃上清液，即得胶体几丁质。
进一步优选的，所述几丁质与HCl溶液的比例为1.8-2.2g∶18-22mL
本发明的有益效果是：
1、本发明通过优化的苏云金芽孢杆菌HD109菌株与茶皂素复配制备微胶囊杀虫剂，苏云金芽孢杆菌HD109菌株本身具有杀虫的作用，且苏云金芽孢杆菌HD109菌株可以产生几丁质酶，通过单因素和均匀设计法优化菌株HD109的产几丁质酶培养基和培养条件，产生的几丁质可通过降解昆虫细胞壁和破坏昆虫肠上皮的保护层，导致昆虫消化道损伤而致死，达到杀虫效果；同时由于真菌细胞壁常以坚硬的几丁质复合物结晶状态存在，且菌丝顶端的几丁质具有可塑性，对几丁质酶敏感，因此可利用产几丁质酶的Bt菌株降解真菌菌丝顶端的几丁质或破坏几丁质对真菌性病害进行生物防治。
2、本发明中的茶皂素作为是一种植物源化合物，常被作为生物农药增效剂，兼具杀螨、杀菌、杀虫等生物活性，通过茶皂素与苏云金芽孢杆菌HD109复配，提高了苏云金芽孢杆菌HD109杀虫、防病二合一的功效，同时克服了这两种成分单一作用效果迟缓和杀虫防病率低的缺点。
3、本发明将优化的苏云金芽孢杆菌HD109菌株与茶皂素复配，然后通过海藻酸钠、明胶和氯化钙制备成微胶囊杀虫剂，不仅减少药剂的使用量，还解决了苏云金芽孢杆菌不耐受紫外光照射的问题，从而提高杀虫防病效果，使药效更持久。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
本发明所用的苏云金芽孢杆菌HD109(Bacillus thuringiensis entomocidusHD109)菌株在2006年12月的激光生物学报的第15卷第6期，林毅，彭锟，关雄发表的《苏云金杆菌entomocidus亚种几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析》中有详细的记载和公开。
实施例1
(1)将苏云金芽孢杆菌HD109菌株以1.572％的接种量接入到含2g/L的蔗糖、20g/L的蛋白胨和2.5％胶体几丁质的优化培养基，优化培养基的初始pH为8，在30℃下，200rpm的条件下，振动培养48h，获得优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株(OD600值为3.8645，酶活性值高达2.7961U/mL)；
(2)将上述优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株以1％的接种量接入到BPY培养基中，在30℃、200pm的条件下，振荡培养24h活化菌种，再将活化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株以3％的接种量转接入另一BPY培养基中，在30℃、220rpm的条件下，振荡培养50-60h后，进行离心分离，弃上清液，得苏云金芽孢杆菌HD109菌体胞晶混合物；
(3)将上述苏云金芽孢杆菌HD109菌体胞晶混合物装载培养皿中，用保鲜膜密封并扎孔，然后置于-25℃下，预冻24h，用真空干燥机冻干处理24h后，研磨得苏云金芽孢杆菌HD109菌体胞晶混合物冻干粉，再置于-80℃下保存备用；
(4)取0.1g上述苏云金芽孢杆菌HD109菌体胞晶混合物冻干粉用水稀释3000倍(质量比)后，与2000mg/L的茶皂素溶液以1∶1的体积比复配制得苏云金芽孢杆菌HD109菌株-茶皂素复配溶液；
(5)在容器中加入20mL溶度为1wt％的海藻酸钠溶液，调节搅拌速度为400rpm，升温至40℃时，加入20mL的苏云金芽孢杆菌HD109菌株-茶皂素复配溶液、20mL浓度为3wt％的明胶溶液，搅拌10min后用醋酸溶液调节溶液pH至3.9，调整搅拌速度为300rpm，降温至25℃，搅拌30min，加入0.15mL浓度为0.2wt％的氯化钙溶液固化囊壁，即得粒径为77.1um且包埋率为69.8％的苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂(Bt微胶囊)。
其中，步骤(1)中的胶体几丁质的制备方法为：称取2g几丁质，加20mL浓度为37±1wt％的HCl溶液，搅拌30min，加入1-3℃的蒸馏水搅匀，在4±1℃下静置24±2h，待分层后弃上清液，重新加1-3℃的蒸馏水，重复以上步骤至溶液pH为5±0.2时，弃上清液，即得胶体几丁质。
实施例2
一、微胶囊杀虫剂终产品贮藏稳定性指标测定
将实施例1制备好的苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂(Bt微胶囊)，稀释50倍后在显微镜下测定微胶囊剂的粒径大小，并观察其形态，紫外灯照射后测定芽孢分解率(划平板)和包埋率(使用血球计数板，在显微镜下对微囊化的苏云金芽孢杆菌和未微囊化的苏云金芽孢杆菌进行计数)测定评判微胶囊杀虫剂质量是否达到标准，并将微胶囊杀虫剂剂在-15℃、0℃、25℃、50℃下分别保存14d后，观察微胶囊杀虫剂的贮存和稳定性。
表1微胶囊杀虫剂终产品贮藏稳定性指标测定
Figure BDA0002219012020000051
通过表1可知，苏云金芽孢杆菌原粉(Bt原粉)的平均粒径虽然较小，但分散性差，芽孢分解率高，实施例1制备的苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂(微胶囊)的平均粒径为71.5μm，符合喷雾施药的要求，并且分散性极好，芽孢分解率-15℃、0℃、25℃、都较低，50℃时芽孢分解率明显升高，但不超过百分之五十，包埋率高，放置于常温下三个月后悬浮性、稳定性等依然良好。
二、田间药效试验
在泉州露绿园蔬菜基地选取一块种有花椰菜的基地作为试验田，试验田平均分为15个小区，每小区约为10m2，苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂设定为500倍、1000倍、3000倍稀释，百护Bt悬浮剂1000倍、Bt原粉1000倍作为对照，共5个处理，每个处理分别重复3次，各个小区采用随机排列，用3WBD-188背负式电动喷雾器喷雾，每个小区施药量1.5kg水溶液。
虫口基数的调查：施药前查卵，幼虫数目作为虫口基数，施药后1、5、9、14d查幼虫，蛹数作为虫口数，各重复分别计算防治效果，计算小菜蛾的校正死亡率。
通过表2可知，喷药5d以后，稀释3000倍的苏云金芽孢杆菌微胶囊制剂(微胶囊)与百护Bt悬浮剂1000倍施用效果相当，高于Bt原粉1000倍施用效果。施药9d以后苏云金芽孢杆菌微胶囊剂药效略有下降，但显著高于百护Bt，Bt原粉1000倍稀释效果最差，施药两周后，Bt微胶囊防效仍高于50％，而Bt原粉由于受到环境温度、pH值、紫外光照等因素的影响，防效显著降低。
表2苏云金芽孢杆菌微胶囊杀虫剂对小菜蛾田间防效试验
Figure BDA0002219012020000061
三、病害防治试验
试验设在泉州露绿园蔬菜基灰霉病普遍发生的花椰菜种植区内。试验设3个处理，分别为Bt微胶囊1000倍液、38％唑醚·啶酰菌WG30g/667m2、1亿CFU/g哈茨木霉菌WG80g/667m2，以生产上常用药剂62％嘧环·咯菌腈WG作对照。各处理重复3次，随机区组排列。用卫士15型背负式喷雾器进行喷药，喷药时使药液淋湿整棵植株，叶片的正、反两面和茎、花、果实都要喷到，并使药液下渗到根，每667m2用水量60L。试验前后20d未使用其它杀菌剂。试验期间各处理田间管理基本一致。
每个小区随机选定3个点取样，每点调查5株，记录每株花椰菜的发病情况和发病级别。
防治效果(％)＝[1-(CK0×PT1)(/CK1×PT0)]×100，其中CK0为空白对照区施药前发病率、CK1为空白对照区施药后发病率、PT0为药剂处理区施药前发病率、PT1为药剂处理区施药后发病率。
由表3结果可知，Bt微胶囊1000倍液对花椰菜灰霉病具有较好的防效，且持效期较长，远高于Bt原粉施用效果。
表3苏云金芽孢杆菌微胶囊杀虫剂对花椰菜灰霉病田间防效试验
Figure BDA0002219012020000062
Figure BDA0002219012020000071
本发明通过优化的苏云金芽孢杆菌HD109菌株与茶皂素复配制备微胶囊杀虫剂，苏云金芽孢杆菌HD109菌株本身具有杀虫的作用，且苏云金芽孢杆菌HD109菌株可以产生几丁质酶，通过单因素和均匀设计法优化菌株HD109的产几丁质酶培养基和培养条件，产生的几丁质可通过降解昆虫细胞壁和破坏昆虫肠上皮的保护层，导致昆虫消化道损伤而致死，达到杀虫效果；同时由于真菌细胞壁常以坚硬的几丁质复合物结晶状态存在，且菌丝顶端的几丁质具有可塑性，对几丁质酶敏感，因此可利用产几丁质酶的Bt菌株降解真菌菌丝顶端的几丁质或破坏几丁质对真菌性病害进行生物防治。茶皂素作为是一种植物源化合物，常被作为生物农药增效剂，兼具杀螨、杀菌、杀虫等生物活性，通过茶皂素与苏云金芽孢杆菌HD109复配，提高了苏云金芽孢杆菌HD109杀虫、防病二合一的功效，同时克服了这两种成分单一作用效果迟缓和杀虫防病率低的缺点；将优化的苏云金芽孢杆菌HD109菌株与茶皂素复配，然后通过海藻酸钠、明胶和氯化钙制备成微胶囊杀虫剂，不仅减少药剂的使用量，还解决了苏云金芽孢杆菌不耐受紫外光照射的问题，从而提高杀虫防病效果，使药效更持久。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将苏云金芽孢杆菌HD109菌株以1.5-1.6％的接种量接入到含1.9-2.1g/L的蔗糖、18-22g/L的蛋白胨和2.3-2.6％胶体几丁质的优化培养基中，该优化培养基的初始pH为7.9-8.1，在29-31℃并180-220rpm的条件下，振动培养45-50h，获得优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株；
(2)将上述优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株以0.8-1.2％的接种量接入到BPY培养基中，在29-31℃并190-210pm的条件下，振荡培养20-25h以活化菌种，再将其以2.8-3.2％的接种量转接入另一BPY培养基中，在29-31℃并190-210pm的条件下，振荡培养50-60h后，进行离心分离，弃上清液，获得菌体胞晶混合物；
(3)将上述菌体胞晶混合物进行冷冻干燥，然后研磨，获得菌体胞晶混合物冻干粉；
(4)将上述菌体胞晶混合物冻干粉用水稀释2000-3000倍后，与浓度为250-4000mg/L的茶皂素溶液复配制得复配溶液；
(5)将上述复配溶液、浓度为0.8-1.2wt％的海藻酸钠溶液和浓度为2.8-3.2wt％的明胶溶液于38-41℃下以380-410rpm的速度搅拌混合均匀后，用醋酸调剂pH至3.8-4.0，接着降温至24-26℃，以290-310rpm的速度搅拌混合均匀，然后加入浓度为0.18-0.22wt％的氯化钙溶液以固化囊壁，即得所述苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂；上述复配溶液、海藻酸钠溶液、明胶溶液和氯化钙溶液的体积比为18-22∶18-22∶18-22∶0.14-0.16。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将所述苏云金芽孢杆菌HD109菌株以1.572％的接种量接入到含2g/L的L蔗糖、20g/L的蛋白胨和2.5％胶体几丁质的优化培养基中，该优化培养基的初始pH为8，在30℃并200rpm的条件下，振动培养48h，获得优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)为：将所述优化后的苏云金芽孢杆菌HD109菌株以0.1％的接种量接入到BPY培养基中，在30℃并200pm的条件下，振荡培养24h以活化菌种，再将其以3％的接种量转接入另一BPY培养基中，在30℃并200pm的条件下，振荡培养50-60h后，进行离心分离，弃上清液，获得菌体胞晶混合物。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的冻干具体为：将所述菌体胞晶混合物装载培养皿中，用保鲜膜密封并扎孔，然后置于-25℃下，预冻24h，用真空干燥机冻干处理24h。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)：将所述菌体胞晶混合物冻干粉用水稀释2000-3000倍后，与浓度为250-4000mg/L的茶皂素溶液以0.8-1.2∶0.8-1.2的体积比复配制得复配溶液。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)为：将所述复配溶液、浓度为1wt％的海藻酸钠溶液和浓度为3wt％的明胶溶液于40℃下以400rpm的速度搅拌混合均匀后，用醋酸调剂pH至3.9，接着降温至25℃，以300rpm的速度搅拌混合均匀，然后加入浓度为0.2wt％的氯化钙溶液以固化囊壁，即得所述苏云金芽孢杆菌与茶皂素复配微胶囊制剂。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：上述复配溶液、海藻酸钠溶液、明胶溶液和氯化钙溶液的体积比为20∶20∶20∶0.15。
8.如权利要求1至7任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述胶体几丁质的制备方法为：将几丁质与浓度为36-38wt％的HCl溶液混合，搅拌25-35min后，加入1-3℃的蒸馏水搅匀，在3-5℃下静置22-26h，待分层后弃上清液，重新加1-3℃的蒸馏水，重复以上步骤至pH为4.8-5.2时，弃上清液，即得胶体几丁质。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述几丁质与HCl溶液的比例为1.8-2.2g∶18-22mL。
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