CN103719163A - 一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂及其制备方法，本发明的制备方法，以海藻酸钠为载体，氯化钙为交联剂，加入杀蚊苏云金杆菌原粉为有效活性成分，具有高效的杀蚊活性；通过空心玻璃微珠使剂型达到悬浮缓释作用，抵抗了紫外线辐射，延长了残效期。其制剂，配方合理，杀虫毒力高，防治效果好，抗紫外辐射能力强，野外残效期长。实验表明，本发明的产品在水中杀蚊子幼虫效果好，随着处理时间的延长，试虫平均相对死亡率呈逐渐升高趋势，至192h试虫相对死亡率达到100%；并且有着良好的机械性能和持久的悬浮性，直到144h才开始出现下沉，到192h悬浮率仍保持58.3%。

Description

一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂及其制备方法

技术领域   本发明涉及生物农药缓释剂及其制备方法，具体涉及一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂及其制备方法，属于生物农药技术领域。

背景技术    苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一种革兰氏阳性细菌，在其形成芽孢的同时在菌体内形成具有蛋白质性质的一个或多个伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）或δ~内毒素，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目、虱目和蚤目昆虫以及吸虫、鞭毛虫、线虫、蜱螨有较强的毒杀作用，而又克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、容易产生抗性等缺点，并具有选择性强、安全、所使用的原料简单等优点，逐步成为世界上应用最广的微生物杀虫剂。Bt以色列亚种（B. thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti）对多种蚊虫具有高效活性，已成功开发为生物杀虫剂用于蚊虫等卫生害虫的防治，在疟疾、登革热、黄热病等蚊媒疾病的控制上发挥了重要的作用。然而，目前生产应用的Bt菌在使用中其活性成分芽孢和晶体易受环境中紫外线的影响而影响其杀虫效果及持效期，已成为Bt杀虫剂难于普及的主要限制因素之一。

目前提高Bt杀虫剂抗紫外辐射能力的方式主要有两种，一种是利用剂型研究或添加助剂的方法，通过包裹等制剂形式或者在菌剂中添加紫外吸收剂和保护剂，以减少紫外线对菌体的直接辐射。主要是着色剂和荧光增白剂等，包括有刚果红、荧光素钠、七叶灵、小檗碱、抗坏血酸、苯丙三唑类化合物、脱脂牛奶、木质素、黑色素、腐植酸、对氨基苯甲酸及糖浆等超过100种的紫外保护剂。这些添加剂对Bt制剂起到了很好的紫外保护作用，大大延长了Bt制剂的有效期。目前报道已上市商品化的Bt剂型主要分为固体型和液体型，固体有粉剂、颗粒剂、粉末剂、球剂；液体有悬浮剂、乳剂、胶囊剂等。这些剂型使得Bt菌起到很好的保护作用。另一种是基因调控手段，通过转导抗紫外辐射功能基因构建多功能工程菌株，从而提高了Bt菌株的抗紫外辐射能力。虽然转基因多功能工程菌也具有很好的抗紫外辐射的作用，但存在稳定性差的缺点。通过诱导手段获得的Bt菌株具有发酵速度变慢以及杀虫活性降低等问题。剂型不仅使得杀虫剂在运输与保存中具有稳定作用，而且对不利的环境因素如紫外线辐射等具有很好的保护作用，并且在剂型中添加一些紫外保护等添加剂也能够起到很好的紫外保护作用，并大大延长了Bt制剂的有效期。 

微胶囊化的悬浮缓释剂是解决Bt菌野外使用的最佳方法，它可以使其免受紫外线辐射，缓慢释放又延长了Bt菌使用的残效期。目前海藻酸钠微胶囊化最常用的方法有三种：1.锐孔滴入法，即将含有微生物的海藻酸钠溶液通过不同孔径的针头滴入到二价交联溶液中，微胶囊的大小取决于针头的大小和海藻酸钠溶液的粘度。2.乳化凝结法，是一种水包油乳化技术，这种方法所得到的微胶囊大小和高度依赖搅拌速度和交联溶液的添加速率。3.复凝集法，其原理是利用带有相反电荷的胶体溶液混合时，因电荷中和而产生凝集。但后两种方法工艺复杂，成本高。而第一种方法工艺简单、操作方便。本文采用锐孔滴入法并且添加一些紫外保护剂、诱食剂以及杀蚊剂等，不仅起到保护作用，而且还增强制剂毒力和延长了残效期。

发明内容    本发明的目的在于提供一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 

本发明的杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂，其特征在于由杀蚊苏云金杆菌原粉、海藻酸钠、氯化钙、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠、鱼粉、天然菊酯和水组成；悬浮缓释剂中各种原料所占的重量百分率如下：

   原    料                            重量百分率

杀蚊苏云金杆菌原粉                      1%~5%

 海藻酸钠                               1%~5%

 氯化钙                                 1%~5%

 空心玻璃微珠                           1%~2%

 黑色素                                 0.3%~0.5%

 苯甲酸钠溶液                           0.1%~0.5%

 鱼粉                                   0.5%~2.5%

天然菊酯                               0.1%~0.5%  

 水                                     84%~95% 。

本发明的杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）取海藻酸钠、杀蚊苏云金杆菌原粉、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠溶液、鱼粉、天然菊酯和水，配制成混合溶液，各原料占悬浮缓释剂的重量百分比分别为1%~5%、1%~5%、1%~2%、0.3%~0.5%、0.1%~0.5%、0.5%~2.5%、0.1%~0.5%和84%~95%；

（2）配制重量百分浓度为1%~5%的氯化钙溶液；

（3）用无菌注射器将步骤（1）的混合溶液逐滴加入到步骤（2）的氯化钙溶液中，液滴形成颗粒状微珠并凝固；

（4）步骤（3）的液滴在氯化钙溶液中硬化时间不少于4h，弃氯化钙溶液，将硬化的颗粒状微珠用蒸馏水清洗，风干，然后室温保存。

所述海藻酸钠为化学纯，氯化钙、苯甲酸钠为分析纯；杀蚊苏云金杆菌为Bt以色列亚种（已公开，菌株保藏号为：CGMCC 1.1754）；杀蚊苏云金杆菌原粉，纯度为5400ITU/mg；空心玻璃微珠的规格为OLH-D，粒度范围10-125微米；上述原料均由市场购得。

本发明的优点及技术原理：本发明以海藻酸钠为载体，氯化钙为交联剂。加入杀蚊苏云金杆菌原粉为有效活性成分，具有高效的杀蚊活性。通过空心玻璃微珠使剂型达到悬浮缓释作用，抵抗了紫外线辐射，延长了残效期。加入黑色素为紫外保护添加剂，也增强了该菌的抗紫外辐射能力。为了避免悬浮缓释剂在水中的微生物变质发霉而使得菌的毒力下降等情况发生，添加苯甲酸钠对菌株起到防腐保护作用。加入鱼粉具有诱食作用，诱使幼虫啃食，提高了杀虫效果，同时避免了剂型长时间在水中下沉现象，延长了残效期。使用天然菊酯是国际公认的最安全的无公害天然杀虫剂，为触杀性杀虫剂，提高了剂型的杀虫效果。杀蚊苏云金杆菌剂型配方与其野外杀虫效果密切相关，决定着其产品的实际杀蚊效果及经济效益。本发明的的制剂，配方合理，杀虫毒力高，防治效果好，抗紫外辐射能力强，野外残效期长，为杀蚊苏云金杆菌生物制剂的开发推广与普及应用提供了方便。

具体实施方式    为了充分公开本发明的一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂的制备方法，以下结合实施例加以说明。   

实施例1：一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂，由海藻酸钠、氯化钙、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠、鱼粉和天然菊酯组成，悬浮缓释剂中各种原料所占的重量百分率如下：

原料                                    重量百分率

 杀蚊苏云金杆菌原粉                              3%

 海藻酸钠                                        3%

 氯化钙                                          5%

 空心玻璃微珠                                    1.5%

 黑色素                                          0.3%

苯甲酸钠溶液                                    0.3%

 鱼粉                                            1.5%

天然菊酯                                        0.4%    

水                                              85% 。

实施例2：一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）取海藻酸钠、杀蚊苏云金杆菌原粉、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠溶液、鱼粉、天然菊酯和水，配制成混合溶液，各原料占悬浮缓释剂的重量百分比分别为3%、3%、1.5%、0.3%、0.3%、1.5%、0.4%和85%； 

（2）配制重量百分浓度为5%的氯化钙溶液；

（3）用10mL的无菌注射器将步骤（1）的混合溶液逐滴加入到步骤（2）的氯化钙溶液中，液滴形成颗粒状并凝固；

（4）步骤（3）的液滴在氯化钙溶液中硬化时间为4h，弃氯化钙溶液，将硬化的颗粒状微珠用蒸馏水清洗2次，风干，然后室温保存。

称取1g本发明的杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂加入到8L的水中，放入500只致倦库蚊Ⅳ龄幼虫，实验重复3次并对照。观察 24h死亡率，当处理死亡率超过50%时，更换新鲜水及移入新的试虫；每24h统一更换新鲜水和新鲜试虫。本发明的杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂杀虫效果如表1所示，其悬浮率如表2所示。

表1杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂处理后不同时间内对致倦库蚊Ⅳ龄幼虫平均校正死亡率

备注：以上数据结果为3次重复的平均值。

表2杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂处理后不同时间内平均悬浮率

备注：以上数据结果为3次重复的平均值。

如表1所示，杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂处理后，随着处理时间的延长，试虫平均相对死亡率呈逐渐升高趋势，至192h试虫相对死亡率达到100%。如表2所示，杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂有着较好的机械性能和持久的悬浮性，直到144h才开始出现下沉，到192h悬浮率仍保持58.3%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂，其特征在于由杀蚊苏云金杆菌原粉、海藻酸钠、氯化钙、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠、鱼粉、天然菊酯和水组成；悬浮缓释剂中各种原料所占的重量百分率如下：

   原  料                              重量百分率

杀蚊苏云金杆菌原粉                      1%~5%

 海藻酸钠                               1%~5%

 氯化钙                                 1%~5%

 空心玻璃微珠                           1%~2%

 黑色素                                 0.3%~0.5%

 苯甲酸钠溶液                           0.1%~0.5%

 鱼粉                                   0.5%~2.5%

天然菊酯                               0.1%~0.5%  

 水                                     84%~95% 。

2.一种如权利要求1所述的杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）取海藻酸钠、杀蚊苏云金杆菌原粉、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠溶液、鱼粉、天然菊酯和水，配制成混合溶液，各原料占悬浮缓释剂的重量百分比分别为1%~5%、1%~5%、1%~2%、0.3%~0.5%、0.1%~0.5%、0.5%~2.5%、0.1%~0.5%和84%~95%；

（2）配制重量百分浓度为1%~5%的氯化钙溶液；

（3）用无菌注射器将步骤（1）的混合溶液逐滴加入到步骤（2）的氯化钙溶液中，液滴形成颗粒状微珠并凝固；

（4）步骤（3）的液滴在氯化钙溶液中硬化时间不少于4h，弃氯化钙溶液，将硬化的颗粒状微珠用蒸馏水清洗，风干，然后室温保存。

3.根据权利要求2所述的一种杀蚊苏云金杆菌悬浮缓释剂的制备方法，其特征在于操作步骤如下： 

（1）取海藻酸钠、杀蚊苏云金杆菌原粉、空心玻璃微珠、黑色素、苯甲酸钠溶液、鱼粉、天然菊酯和水，配制成混合溶液，各原料占悬浮缓释剂的重量百分比分别为3%、3%、1.5%、0.3%、0.3%、1.5%、0.4%和85%； 

（2）配制重量百分浓度为5%的氯化钙溶液；

（3）用10mL的无菌注射器将步骤（1）的混合溶液逐滴加入到步骤（2）的氯化钙溶液中，液滴形成颗粒状并凝固；

（4）步骤（3）的液滴在氯化钙溶液中硬化时间为4h，弃氯化钙溶液，将硬化的颗粒状微珠用蒸馏水清洗2次，风干，然后室温保存。