CN102744022B - 一种空微胶囊、可酸性或碱性控释的微胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种空微胶囊、可酸性或碱性控释的微胶囊及其制备方法，属于生物制剂领域。本发明通过层层自组装的方法，以碳酸钙为核心，选用两种在制备条件下带相反电荷的聚电解质阴阳离子制备微胶囊，然后将核心去除，得到空微胶囊。该空微胶囊的囊壁由PAH/PSS交替形成，可以在酸性条件下对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry原毒素进行装载，得到可在碱性条件下控释的微胶囊剂型。该剂型保持了Cry原毒素的杀虫活性，并能够帮助其抵抗一些环境因素的影响。同时该使杀虫蛋白能够在昆虫中肠具有的碱性环境中特异性释放而在一般环境中保持稳定，将在Bt杀虫蛋白在害虫防治的实际应用中起到重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，特别是涉及一种空微胶囊、可酸性或碱性控释的微胶囊及其制备方法。
背景技术
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽胞杆菌属，广泛分布于叶面、虫尸、土壤、贮藏尘埃、污水之中。它在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生虫线虫等有特异性毒杀作用，而对人和家畜无害，不污染环境，在农林卫生害虫防治中应用广泛。
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白又称δ-内毒素，是一类在苏云金芽孢杆菌芽孢形成期产生的具有特异杀虫活性的晶体蛋白。Cry蛋白在伴孢晶体内以原毒素的形式存在，当被特定种类的昆虫摄食后在其中肠中转变为具有杀虫活性的毒素。活化过程是一系列相继的蛋白水解，从C末端开始向N末端延伸直到形成对蛋白酶稳定的毒素。研究表明，晶体蛋白被敏感幼虫吞食后，在幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下释放出活性毒素，可与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合并形成孔道，破坏细胞渗透压平衡，最终导致昆虫死亡
Bt菌株的特性使得其在农业害虫的防治方面有很重要的作用，逐渐发展成了主要的微生物杀虫剂，被广泛用于粮食、经济作物、蔬菜、林果以及卫生害虫的防治。虽然Bt在实际中有了广泛的应用，但仍存在一定得局限性。截至2011年，Bt的应用在害虫防治领域取得较大成功，占据了杀虫剂市场2%的份额，但其使用后较短的残留活性成为制约其发展的一个重要因素。紫外辐射、雨水冲刷、温度等环境因素都会导致晶体蛋白的失活。目前国内外苏云金芽胞杆菌的剂型主要有：油悬剂、微囊剂、漂浮块剂、油烟雾剂、火箭抛洒剂型、紫外线防护剂型、水悬浮剂和土壤矿物颗粒吸附剂型等。其中胶囊剂型已开发了几种类型，包括可喷洒性制剂、传统的颗粒饵剂以及粘着性颗粒剂。
微胶囊的形状多种多样，由于成囊工艺、囊材、芯材的不同使得微囊表观形貌差异很大，一般地呈球形，有的是谷粒及无定形等形状。微胶囊的大小形状，与制备工艺有关。微胶囊制备方法很多，据统计有200多种。基于正负聚电解质静电作用的层层自组装技术（Layer-by-Layerself-assemble technique，LbL是基于聚电解质阴阳离子所带正负电荷间相互作用的一种自组装超分子技术。该技术的主要特点是在表面带电的基材表面通过静电相互作用交替地吸附上带相反电荷的聚电解质阴阳离子。1998年，等采用可被去除的胶体颗粒作为组装模板，通过LbL技术将聚电解质沉积到胶体颗粒上，然后将作为模板的胶体颗粒溶解或分解，制备了一类新的聚合物中空微囊（Gleb B S,Edwin D,Sean D et al.Stepwise polyelectrolyte assembly onparticles surfaces:a novel approach to colloid design[J].Polymers for Advanced Technologies,1998,9:759-767.）这种方法得到的微囊与传统意义上的微囊相比，显示出独特的结构与多变的性能:其制备工艺简单；制备条件温和，可在常温水溶液中进行，可以保证生物分子具有维持生物活性的天然构像；此外，该方法适用的材料种类多，可在具有复杂体型结构的装置和材料上实现。因此，该技术在生物医用材料领域的研究中得到广泛的应用。
Bt的微胶囊剂型最早出现于二十世纪六十年代，并在之后得到广泛关注。但这些研究主要是针对苏云金芽胞杆菌菌体的微胶囊化，而针对杀虫蛋白的微胶囊化目前还没有报道。并且，已有胶囊剂型对菌体保护的持效性不长，包封的内容物会随时间的增加而释放至环境中。
发明内容
针对上述领域中的空白，本发明提供一种空微胶囊，采用层层自组装技术制成，可以载入特定的蛋白如苏云芽胞杆菌杀虫蛋白，并对杀虫蛋白的活性起到保护作用。
进一步，本发明提供一种可酸性或碱性控释微胶囊，在碱性或酸性条件下，将药物载入上述空微胶囊中，可控制在酸性或碱性条件下的药物缓慢释放。
本发明的实施例制备的可碱性控释微胶囊，在酸性条件下将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白载入上述的空微胶囊中，该使杀虫蛋白能够在昆虫中肠具有的碱性环境中特异性释放而在一般环境中保持稳定，将在Bt杀虫蛋白在害虫防治的实际应用中起到重要作用。
本发明还提供上述空微胶囊的制备方法。
进一步，本发明还提供可碱性控释的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白微胶囊的制备方法。
空微胶囊，采用层层自组装技术制成，其特征在于：其微胶囊壁由聚丙烯胺盐酸盐(PAH)与聚苯乙烯磺酸钠(PSS)交替形成。
所述微胶囊壁有5层。
所述微胶囊壁由里至外分别为PAH/PSS/PAH/PSS/PAH。
上述空微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备胶囊核心，
（2）配制胶囊壁溶液：PAH(聚丙烯胺盐酸盐)溶于Tris溶液中，pH7.0的溶液A，PSS(聚苯乙烯磺酸钠)溶于Tris溶液中，pH7.0的溶液B；
（3）将碳酸钙核心顺次分别在溶液A、溶液B中混匀后形成囊壁，再交替反复，得到球形微胶囊，
（4）去除微胶囊核心，得到空微胶囊。
所述球形微胶囊大小为3~5μm，有5层囊壁。
所述溶液A为用100mM Tris配制成1mg/ml PAH(聚丙烯胺盐酸盐)的溶液，HCl调节pH至7.0，所述溶液B为用100mM Tris配制成1mg/mlPSS（聚苯乙烯磺酸钠）的溶液，HCl调节pH至7.0。
所述胶囊核心为碳酸钙核心。
所述胶囊核心的制备方法为：在Na2CO3水溶液中加入与Na2CO3相同质量的PSS(聚苯乙烯磺酸钠)混匀，再加入CaCl2水溶液混合，快速搅拌，离心，去上清，得到碳酸钙核心沉淀。
所述Na2CO3水溶液的浓度为0.2M，CaCl2水溶液的浓度为0.2M，等量的Na2CO3水溶液和CaCl2水溶液混合。
所述制备方法还包括碳酸钙核心沉淀的清洗步骤，将沉淀水洗后离心，弃上清，重复3次。
所述步骤（4）的方法为：配制EDTA水溶液，调节pH至7.0，将它与上述微胶囊混合，反复振荡后水洗离心，弃上清，得到内部明显塌陷的空微胶囊。
所述EDTA水溶液的浓度为0.2M，用NaOH溶液调节pH。
所述水洗离心，弃上清步骤重复3次。
可碱性或酸性控释的微胶囊，在酸性或碱性条件下将药物装载入上述空微胶囊中。
所述药物为苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白，微胶囊为可碱性控释，装载时采用酸性条件。
上述可碱性或酸性控释的微胶囊的制备方法，将所述苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白制成水溶液，醋酸调节其pH至3.0，将空微胶囊与其混合，快速搅拌离心，除上清，得微胶囊沉淀。
所述制备方法还包括微胶囊的纯化，将微胶囊沉淀水洗，离心，弃上清，重复3次。
本发明通过层层自组装的方法，以碳酸钙为核心，选用两种在制备条件下带相反电荷的聚电解质阴阳离子制备微胶囊，然后将核心去除，得到空微胶囊。该空微胶囊的囊壁由PAH/PSS交替形成，可以将药物通过囊壁装载入空微胶囊中，对药物形成一定的保护作用，并在使用状态下形成控释或缓释的效果。该空胶囊由于特定的囊壁材料的选用，可以载入一定分子量和一定电荷的蛋白药物，并使该微胶囊具有控释或缓释的作用。
同时可选用酸性或碱性条件将药物导入，使得药物在碱性或酸性条件下产生控释作用。
本发明在酸性条件下对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry原毒素进行装载，得到可在碱性条件下控释的微胶囊剂型。该剂型保持了Cry原毒素的杀虫活性，并能够帮助其抵抗一些环境因素的影响。同时该使杀虫蛋白能够在昆虫中肠具有的碱性环境中特异性释放而在一般环境中保持稳定，将在Bt杀虫蛋白在害虫防治的实际应用中起到重要作用。
附图说明
图1扫描电镜下微胶囊结构，
图2扫描电镜下空心微胶囊结构，
图3原毒素装载结果，
1.Marker2.装载前的原毒素样品3.混合物离心后的上清4.装载后的胶囊，
图4微胶囊控释结果，
1.Marker2.水中混匀的微胶囊3.水中微胶囊离心后上清4.Na2CO3溶液中混匀的微胶囊5.Na2CO3溶液微胶囊离心后上清，
图5原毒素及微胶囊剂型在高温条件下的稳定性，
A:1.4℃下保存的原毒素2.37℃下保存5天后的原毒素3.4℃下保存的微胶囊4.37℃下保存5天后的微胶囊，
B:1.4℃下保存的原毒素2.50℃下保存5天后的原毒素3.4℃下保存的微胶囊4.50℃下保存5天后的微胶囊。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例并不对本发明作限定作用。
1空载微胶囊的制备
1.1制备碳酸钙核心
配制0.2M NaCO3溶液，并加入与NaCO3相同质量的PSS(聚苯乙烯磺酸钠)混匀。
配制0.2M CaCl2溶液。
将上述等量的NaCO3溶液及CaCl2溶液各100ml，混合后快速搅拌30min。
离心，5000rpm,10min,去除上清。将沉淀水洗后离心，5000rpm,10min，弃上清，重复3次。
1.2以自组装法制备胶囊壁
用100mM Tris配制1mg/ml PAH(聚丙烯胺盐酸盐)溶液，HCl调节pH至7.0。
用100mM Tris配制1mg/ml PSS溶液，HCl调节pH至7.0。
取100ml PAH溶液与上步中沉淀混匀，震荡15min。离心，5000rpm,10min,去除上清。将沉淀水洗后离心，5000rpm,10min，弃上清，重复3次。包裹第一层囊壁。
取100ml PSS溶液与上步中沉淀混匀，震荡15min。离心，5000rpm,10min,去除上清。将沉淀水洗后离心，5000rpm,10min，弃上清，重复3次。包裹第二层囊壁。
重复上述步骤，按照PAH-PSS-PAH顺序包裹第3-5层囊壁。
1.3得到以CaCO3为核心，PAH/PSS/PAH/PSS/PAH顺序包裹的微胶囊。通过扫描电镜观察其形态结构，得到了大小约3~5μm的球形微胶囊，如图1所示。
1.4去除微胶囊的碳酸钙核心
配制0.2M EDTA溶液，NaOH溶液调节pH至7.0。
将EDTA溶液与上述微胶囊沉淀混合，反复振荡后水洗离心，5000rpm,10min，弃上清，重复3次。
通过扫描电镜观察其形态结构，得到了内部明显塌陷的微胶囊，如图2所示。说明其核心已经除去。
2 Cry原毒素的装载与控释
2.1Cry原毒素的装载
将Cry原毒素用水稀释至100ml，醋酸调节其pH至3.0。
溶液与制备的空载微胶囊混合，快速搅拌30min。
样品离心，5000rpm,10min,去除上清。将沉淀水洗后离心，5000rpm,10min，弃上清，重复3次。
向装载后的沉淀中加入蒸馏水，置于4℃保存。
通过电泳检测原毒素的装载结果，如图3所示。表明原毒素已成功装载于微胶囊中。
2.2装载后原毒素的体外控释
将装载后的微胶囊混匀，取出2组，每组10ml。离心，5000rpm,10min，弃上清。向2组沉淀分别加入10ml50mM Na2CO3溶液（pH10.2）及10ml水。2小时后将两组样品的混合液分别取样，离心（5000rpm,10min，）后的上清分别取样，电泳检测蛋白释放效果，如图4所示。结果表明原毒素在水溶液中保持稳定装载状态，在pH10.2的碱性环境下发生完全释放。
3Cry原毒素微胶囊剂型生物活性测试
使用亚洲玉米螟进行杀虫活性测定。将装载了Cry原毒素的微胶囊稀释为7个梯度分别于与玉米螟的食物均匀混合。每400mg食物放入24孔细胞培养板的一个孔中，每孔1只初孵幼虫，每个浓度的原毒素共测试96只。未装载的Cry原毒素作为阳性对照进行同样的测试。未装载的空胶囊和水作为阴性对照进行活性测试。在适宜条件下培养7天后，记录各组活虫及死虫数并进行计算其半致死浓度（LC50）。
生测结果表明装载的原毒素依然保持良好的杀虫活性，如表1所示。空胶囊及水的致死率均处于较低水平，属于正常死亡率，未在表中列出。
表1装载装载后原毒素生物活性测定
4微胶囊剂型在高温条件下的稳定性
原毒素及装载了原毒素的微胶囊均在37℃及50℃培养箱中保存。5天后，用电泳检测样品，结果如图5所示。结果表明，在高温环境下，原毒素不稳定易发生降解。而微胶囊装载的原毒素可以保持其结构稳定。对在50℃条件下处理的原毒素及微胶囊进行生物活性测定。选择上文测得的LC50浓度，将样品与亚洲玉米螟食物混合后测定其7天后的死亡率，结果如表2所示。
表2高温处理后原毒素及微胶囊剂型杀虫的死亡率
从上表可以看出，在高温条件下，原毒素样品基本失活。装载在微胶囊中的原毒素依然具有很高的杀虫活性，说明该剂型对杀虫蛋白具有良好的保护性。
Claims (2)
1.碱性控释的微胶囊制备方法，包括如下步骤：
(1)制备碳酸钙胶囊核心：在0.2M Na2CO3水溶液中加入与Na2CO3相同质量的聚苯乙烯磺酸钠混匀，再加入等量0.2M CaCl2水溶液混合，快速搅拌，离心，去上清，得到碳酸钙核心沉淀，将沉淀水洗后离心，弃上清，重复3次；
(2)制备空微胶囊：将聚丙烯胺盐酸盐溶于Tris溶液中，制备pH7.0的溶液A；将聚苯乙烯磺酸钠溶于Tris溶液中，制得pH7.0的溶液B；将碳酸钙核心顺次分别在溶液A、溶液B中混匀后形成囊壁，再交替反复，得到球形微胶囊；配制EDTA水溶液，调节pH至7.0，将它与球形微胶囊混合，反复振荡后水洗离心，弃上清，得到内部明显塌陷的空微胶囊，所述水洗离心，弃上清，步骤重复3次，
(3)酸性装载蛋白：将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白制成水溶液，醋酸调节其pH至3.0，将空微胶囊与其混合，快速搅拌离心，除上清，得微胶囊沉淀，将微胶囊沉淀水洗，离心，弃上清，重复3次即可；
所述囊壁有5层，由里至外分别为聚丙烯胺盐酸盐/聚苯乙烯磺酸钠/聚丙烯胺盐酸盐/聚苯乙烯磺酸钠/聚丙烯胺盐酸盐，
所述溶液A为用100mM Tris配制成1mg/ml聚丙烯胺盐酸盐的溶液，HCl调节pH至7.0，所述溶液B为用100mM Tris配制成1mg/ml聚苯乙烯磺酸钠的溶液，HCl调节pH至7.0。
2.根据权利要求1所述的方法，所述球形微胶囊大小为3～5μm。
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