CN101554180A - 一株解淀粉芽孢杆菌无菌滤液的应用 - Google Patents
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Abstract
一株解淀粉芽孢杆菌无菌滤液的应用。该菌株为分离于甘肃省兰州市安宁区茄子地土壤中的一株解淀粉芽孢杆菌I7(保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M206027)。室内及大田实验表明I7菌的无菌滤液对黄瓜枯萎病具有较好的防治效果，且对生长具有明显的促进作用；该无菌滤液安全性测定表明其无毒无刺激。本发明所需原料简单易得，易于实施，防治病害和促进生长效果显著，对人畜无毒无刺激，对生态环境友好，便于保存和运输，可制备成无菌滤液生物农药菌剂运用于生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌无菌滤液的应用。该无菌滤液为一株解淀粉芽孢杆菌I7(保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M206027)发酵液经滤膜过滤除菌而得，对黄瓜枯萎病表现出明显的防治作用，对作物生长表现出明显的促进作用，且对人畜无毒无刺激，对生态环境友好，可制备成一种防治黄瓜枯萎病的生物农药制剂。
技术背景
在农业生产上，植物病害是引起农作物产量损失和品质下降的主要原因之一[1]，据统计，全世界每年因病害引起的农作物产量损失相当于总产量的10％[2]，而植物病害的80％是由真菌感染引起的[3]，如何有效地防治植物真菌病害一直是农业生产上亟待解决的问题。上世纪50年代以后，大量、广泛使用化学农药造成病原菌对化学农药产生抗性，高残留引起环境污染，以及化学农药对人畜产生毒害等加速了人们寻求新的、安全有效的植物病害防治途径，生物防治在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用[4]。
自1921年，Hartely利用拮抗真菌防治棉苗猝倒病开始[5]，利用有益微生物防治植物病害的研究开始引起了人们的注意。1973年，澳大利亚植物病理学家Kerr利用放射土壤杆菌[6]成功地防治植物根癌病，并迅速形成商品化制剂，在美、澳、日等国迅速的推广应用，进一步促进了人们对植物病害生物防治的兴趣。目前成功应用于防治植物病害的生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas等属的一些菌株。目前国际上有很多生防菌已被开发成生物制剂，并广泛应用于生产。美国Alabama州农业实验室发现根围细菌B.subtilis GBO3，既能有效防治Fusarium spp.和Rhizoctonia spp.引起的植物病害，也可以促进植物生长，在美国和欧洲大面积推广使用，其商品名为Kodiak[7，8]。Taensa公司利用B.subtilis FZB24研制的TaegroTM产品，施用于温室或室内栽培的树苗、灌木和装饰植物根部可防治Fusarium和Rhizoctonia引起的根腐病和枯萎病。Agroquest公司利用B.subtilis QST713菌株开发出活菌杀菌剂SerenadeTM，叶面施用能防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等[9，10]。此外，日本东京技术研究所的B.subtilis RB14和B.subtilis NB22分别对Rhizoctonia solani、fusarium oxysporum和Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好作用[11]。澳大利亚开发的B.subtilisA-13对麦类和胡罗卜立枯病以及其它土传病害具有很好的防治和增产作用[12]。
许多研究表明，利用芽胞杆菌进行生物防治或生产微生物杀菌剂以代替剧毒化学农药是一种可行的策略[13，14，15，16，17]。芽胞杆菌(Bacillus spp.)是一类好氧和兼性厌氧、产生芽胞的G+杆状细菌。芽胞杆菌其生理特征丰富，在自然界分布及其广泛，是土壤和植物体表根际的重要为生物种群，同时其与人类关系极为密切，是越来越引起人们重视和研究的一个重要微生物类群。田间应用研究已经证实芽胞杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物年份防效的一致性等方面，明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂[10，18，19，20 ，21，22]。从而较其他生防菌更受厂家和商家的青睐。目前用于植物病害生物防治的主要为B.subtilis、B.cereus、和B.pumilus。
本发明中所涉及的解淀粉芽孢杆菌I7无菌滤液，不但对黄瓜枯萎病表现出明显的防治作用，而且对黄瓜的的生长有明显的促进作用，可用减少化学农药的使用，保护西北地区的生态环境。
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发明内容
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌无菌滤液的应用，具体内容如下：
解淀粉芽孢杆菌I7经过不同的培养基、温度、pH、金属离子、碳源和氮源等生长条件的优化，其在NA培养基、转速120rpm/min，20-55℃温度范围、4.5-9.5pH范围内培养30h左右，均能很好的生长。用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到该解淀粉芽孢杆菌无菌滤液。将这种无菌滤液作用于黄瓜种子，则种子萌发率及胚根伸长率都明显高于无菌水对照；对黄瓜枯萎病而言，这种无菌滤液浸种处理的防治效果为66.67％，较对照市售农药(商品名“菌无菌”，河南中威高科技化工有限公司制造，下同)组47.62％的防效高出近20％，这种无菌滤液灌根处理的防治效果为47.62％，高出对照农药组(38.09％)近10％。大田试验显示，同样处理的相对防效分别为64.4％，55.7％。表明该菌株的无菌滤液具有较好的防治黄瓜枯萎病的效果，根据《农药登记毒理学学试验方法》，并对该菌株的抗生素进行了安全性测定，测试结果表明，其对人、畜无毒无刺激作用。
因此，本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌无菌滤液对黄瓜枯萎病具有良好的防效，且对黄瓜的的生长有促进作用，对环境友好，制备设备要求简单、运输、保存及使用方便。
具体实施方式
实施例一解淀粉芽孢杆菌无菌滤液的制备
按照0.2％的接种量，将解淀粉芽孢杆菌I7菌株在NA液体培养基中震荡培养，转速120rpm/min，20-55℃温度范围、4.5-9.5pH范围内培养30h左右，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，获取其无菌滤液。
实施例二室内防效测定
(1)解淀粉芽孢杆菌无菌滤液对种子萌发的促进作用
黄瓜种子在用1％次氯酸钠溶液表面消毒20min后，用无菌水漂洗3次，然后浸于滤液中5小时处理。处理后种子放置于湿滤纸(每张40粒)保湿培养，农药菌无菌(按照商品说明书配置)与无菌水处理的种子作为对照，每处理3个重复，萌发率、促芽率在2天后被记录。
表1 I7菌无菌滤液处理对种子萌发率、促芽率的影响
结果如表1所示，I7无菌滤液能够明显促进种子的萌发。
促芽率％＝(各菌株处理种子发芽数-对照种子发芽数)/对照种子发芽数×100％(芽的长度为2mm算作发芽)
(2)解淀粉芽孢杆菌无菌滤液对种子胚根的促进作用
从每处理的萌发种子中任取10粒测其胚根长度
表2 I7无菌滤液处理对种子胚根的影响
如表2所示(表中I7菌为I7菌无菌滤液)，I7无菌滤液对胚根的伸长具有明显的促进作用。
胚根伸长率％＝(各菌株处理胚根长度-对照胚根长度)/对照胚根长度×100％
(3)解淀粉芽孢杆菌无菌滤液的室内防效
温室盆栽中，种子的处理如前所述。浸种处理与灌根处理按照常规方法进行。
防治效果％＝(空白对照病株率-处理区病株率)/空白对照区病株率×100％
病株率(％)＝病株数/调查总株数×100％
(1)浸种处理
将黄瓜枯萎病菌按比例混合于灭菌的土中，然后装入塑料盆。黄瓜种子在用1％次氯酸钠溶液表面消毒20min后，用无菌水漂洗3次，然后分别浸于无菌水，对照农药、I7菌无菌滤液中处理5小时。之后每盆播种10粒处理后的种子，塑料盆随即排列并定期浇灌，处理和对照被重复三次，定期观察病害发生的情况。
表3 I7无菌滤液浸种处理对黄瓜枯萎病的防治效果
| 处理 | 总株数 | 14天病株数 | 病株率(％) | 防治效果(％) | 28天病株数 | 病株率(％) | 防治效果(％) |
| I7滤液 | 135 | 21 | 15.56 | 74.07 | 42 | 31.11 | 66.67 |
| 农药 | 135 | 33 | 24.44 | 59.27 | 66 | 48.89 | 47.62 |
| 接病菌土壤 | 135 | 81 | 60 | - | 126 | 93.33 | - |
| 未接病菌土壤 | 135 | 0 | 0 | - | 0 | 0 | - |
结果如表3，在14天时很明显可以看出，I7无菌滤液处理的病株率及农药处理的病株率与对照存在较显著的差异，病株率均低于50％，说明在苗期各处理对黄瓜枯萎病均有一定的防效，I7无菌滤液的防治效果最高达74.07％，但是在28天调查时，各处理的病株率明显上升，防治效果较14天时有所降低，但I7无菌滤液的防治效果仍然为最高，达66.67％。
(2)灌根处理
当黄瓜幼苗发病后，将I7菌的无细菌滤液及对照农药(25ml/次/棵)施于病株。(间隔7天，共5次)。
表4 I7无菌滤液灌根处理对黄瓜枯萎病的防治效果
| 处理 | 总株数 | 14天病株数 | 病株率(％) | 防治效果(％) | 28天病株数 | 病株率(％) | 防治效果(％) |
| I7滤液 | 135 | 45 | 33.33 | 44.45 | 66 | 48.89 | 47.62 |
| 农药 | 135 | 51 | 37.78 | 37.03 | 78 | 57.78 | 38.09 |
| 接病菌土壤 | 135 | 81 | 60 | 126 | 93.33 | ||
| 未接病菌土壤 | 135 | 0 | 0 | 0 | 0 |
调查病株率结果如表4所示，在14天时，I7无菌滤液处理的病株率及农药处理的病株率与无菌水对照也存在较显著的差异，病株率也均低于50％，再次说明各处理在苗期对黄瓜枯萎病有一定的防效，但防治效果较浸种处理有所下降，在28天调查时，各处理的病株率上升，防治效果比14天时也有所上升。
实施例三大田防效测定
田间试验设置6个小区，3次重复，随机排列，面积75m2，6个小区分别为：
(1)I7无菌滤液浸种，(2)化学农药(菌无菌)浸种，(3)无菌水浸种，(4)I7无菌滤液浸种与灌根，(5)农药浸种与灌根，(6)无菌水浸种与灌根。
种子的处理方法与室内防效测定的方法相同，播种和田间管理均按常规进行。在枯萎病的发病初期开始，施药按照对照农药要求。2007年5月5日播种，6月20日开始发病，6月26日发病严重时进行第一次灌根处理，以后每隔7天灌根一次，共5次，7月30日调查药效。计算防治效果。
表5 I7无菌滤液对黄瓜枯萎病的田间防治效果
I7滤液，农药共灌根5次，50ml/次/黄瓜。
试果如表5显示：各处理对黄瓜枯萎病的防治效果差异较显著，I7无菌滤液的防治效果显著高于对照农药，尤其是经滤液处理的种子，再经过苗期的灌根处理，防治效果达到70.7％。经过I7无菌滤液处理之后，其地上部分的植株生长旺盛、健壮，叶片呈深绿色，这与室内防治试验结果相似，进一步证明I7无菌滤液有促进植株生长的作用
实施例四 安全性测定
(1)急性经口毒性试验
昆明小鼠50只，雌雄各半。将实验动物按性别和体重随机分为5组：5000mg/kg体重(滤液为冻干粉，下同)，2500mg/kg体重，1250mg/kg体重，500mg/kg体重和1个阴性对照组(无菌水)，每组10只，雌雄各半。实验前将动物隔夜禁食但不禁水，第2天早上称重，然后将受试样品不同剂量一次经口灌胃染毒，灌胃量20g体重给0.4mL，给药后，间隔3小时进食，给药后直接观察并记录毒物的中毒表现，症状出现和消失的时间，给药当日连续观察，其后，每日早晚各观察1次，并每3d称量一次体重，观察其为14d。如在给药96h后出现迟发性新效应，则应延长观察期至3周或4周。
表6 I7菌粉剂急性经口毒性试验小鼠染毒后不同时期的体重变化(雄)
| 处理 | 实验前(g) | 试验后3d(g) | 试验后6d(g) | 试验后9d(g) | 试验后14d(g) |
| 5000mg/kg体重 | 21.0 | 24.1 | 25.7 | 29.1 | 29.8 |
| 2500mg/kg体重 | 20.4 | 23.9 | 25.7 | 27.9 | 29.5 |
| 1250mg/kg体重 | 22.1 | 26.7 | 27.8 | 29.3 | 30.5 |
| 500mg/kg体重 | 23.0 | 26.4 | 28.5 | 29.1 | 31.6 |
| 无菌水对照 | 21.3 | 25.5 | 28.1 | 30.7 | 33.5 |
表7 I7菌粉剂急性经口毒性试验小鼠染毒后不同时期的体重变化(雌)
| 处理 | 实验前(g) | 试验后3d(g) | 试验后6d(g) | 试验后9d(g) | 试验后14d(g) |
| 5000mg/kg体重 | 21.7 | 24.3 | 26.1 | 29.9 | 31.8 |
| 2500mg/kg体重 | 21.0 | 23.0 | 24.6 | 28.7 | 30.0 |
| 1250mg/kg体重 | 22.2 | 24.9 | 27.4 | 30.4 | 32.6 |
| 500mg/kg体重 | 22.3 | 24.8 | 28.4 | 29.6 | 30.3 |
| 无菌水对照 | 22.9 | 25.5 | 28.3 | 31.3 | 32.3 |
小鼠给药后，未观察到明显中毒状况。从表6～7可以看出，4种剂量的受试动物组和阴性对照组不同时期体重变化趋势无明显差别。说明该受试样品I7急性经口剂量5000mg/kg雌雄昆明小鼠的体重没有影响，该受试样品对雌雄鼠的急性经口LD50＞5000mg/kg。按照《农药登记毒理学试验方法》中急性经口毒性分级标准，该受试样品为低毒级。
(2)急性经皮毒性试验
Wistar大鼠50只，雌雄各半，雄性体重218-245g，雌性体重203-224g。按最大一次限量法，将实验动物按性别和体重随机分为5组：4组受试样品(2000mg/kg体重，1000mg/kg体重，500mg/kg体重和250mg/kg体重)和1个阴性对照组，每组10只，雌雄各半。染毒前24h将实验动物用电推剪除毛，面积约为4cm×5cm2。事先将受试样品用无菌蒸馏水稀释成设置的质量浓度。处理时，受试样品组按不同剂量经皮一次均匀涂敷住实验动物的去毛区，然后用2层纱布和1层油纸覆盖，再用无刺激性胶布固定；阴性对照组则采用无菌水进行相同的处理。涂药4h后取下覆盖物，用温水冲洗，进行局部观察。连续2周观察并记录动物中毒情况。结果显示：I7菌粉剂的4种剂量的受试动物组和阳性对照组在14d的观察期内均没有任何明显的中毒症状，也无任何动物死亡。处死存活的实验鼠经大体解剖肉眼观察，未见明显病理改变。说明该受试样品对雌雄实验动物的急性经皮LD50＞2000mg/kg。按照《农药登记毒理学试验方法》中急性经皮毒性分级标准，说明I7菌的粉剂受试样品为低毒级。
(3)急性皮肤刺激试验
选用4只皮肤完好的健康豚鼠。染毒前24h用电推剪除毛，除毛面积在脊柱两侧各约6cm2。一侧用受试样品进行处理，另一侧用无菌水处理作为对照。试验时一次涂药量按每只0.5mL原药计。涂药后用2层纱布和l层油纸覆盖，再用无刺激性胶固定。涂敷持续时间为4h，然后用温水洗去残留药剂。之后，按照中华人民共和国《农药登记毒理学试验方法》的国家标准规定的方法每天早晚定期观察受试动物涂药部位的皮肤形成红癍和出现水肿的情况，观察期为14d。
结果评定：按照《农药登记毒理学试验方法》所述的方法进行观察和评定积分。在去除受试物后0-72h内，4只豚鼠染毒部位皮肤均未出现红斑、水肿及其他刺激症状，与对照皮肤没有差异。按照《农药登记毒理学试验方法》中方法求得4只豚鼠72h后皮肤刺激反应积分均为0，皮肤刺激平均刺激指数也均为0。同时其中地皮肤刺激强度分级标准，则判断出该受试样品I7菌的粉剂对豚鼠的皮肤刺激等级为无皮肤刺激性。
(4)眼刺激试验
选用成年健康白色家免4只，试验前24h检查白兔双眼，选用无异常者进行试验。将一侧下眼睑轻轻下拉，把受试样品原液按每只0.1mL一次性滴入滴入结膜囊内，为防止药液外溢，立即使眼睑轻轻闭合约1min。给药后24h内不洗眼，并以该动物的对侧眼为对照。按中华人民共和国《农药登记毒理学试验方法》的国家标准规定的方法在滴眼处理后1h、24h、48h和72h分别观察白兔眼结膜、虹膜和角膜的反应，并进行详细纪录，如72h仍无刺激反应时，则终止试验。
结果评定：按照《农药登记毒理学试验方法》中所述方法进行观察和积分评定在滴眼处理后6h、24h和48h分别观察大耳白兔眼结膜、虹膜和角膜的反应。在染毒后0-48h内，4只大耳白兔的眼结膜、虹膜和角膜均未见流泪、充血及水肿等刺激症状，反应积分均为0。具体统计结果见表8。按照《农药登记毒理学试验方法》中眼刺激性分级标准，得出该受试样品I7菌粉剂对大耳白兔的平均眼刺激指数为O，等级为无眼刺激性。
Claims (2)
1.一株解淀粉芽孢杆菌无菌滤液。其特征在于这种无菌滤液可在防治黄瓜枯萎病等作物真菌病害中使用，也可同时作为作物的生长促进剂使用，且安全无毒。
2.根据权利要求1中所述的无菌滤液，其特征在于这种无菌滤液由解淀粉芽孢杆菌I7(保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M206027)发酵液经滤膜过滤除菌而得，具体生产方法是：按照0.2％的接种量，将解淀粉芽孢杆菌I7菌株在NA液体培养基中震荡培养，转速120rpm/min，20-55℃温度范围、4.5-9.5 pH范围内培养30h左右，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，获取其无菌滤液后直接使用。也可将这种无菌滤液冷冻干燥制成粉剂，然后使用。或者配制成各种剂型使用，这是同行都可以理解的。
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