CN106942284B - 一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物防治植物病害和生物技术领域，具体涉及地衣芽孢杆菌Y24芽孢液与霜贝尔复配制成的生物杀菌剂，及其该杀菌剂在葡萄白腐病和霜霉病防治中的应用。防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，包括有效活性成分以及助剂；有效活性成分占复配生物杀菌剂的质量百分比为98％；助剂占复配生物杀菌剂质量百分比的2％；有效活性成分主要由地衣芽孢杆菌Y24和霜贝尔组成；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Y24菌株，保藏号为CGMCC No.11448。助剂为木质素磺酸钠。将两种主要组分通过复配、协同作用，达到优势互补、扩大防治范围、减少用药次数、降低用药成本、提高防治效果的目的，且药效稳定。

Description

一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂及其应用
技术领域
本发明属于生物防治植物病害和生物技术领域，具体涉及一株地衣芽孢杆菌Y24芽孢液与霜贝尔复配制成的生物杀菌剂，及其该杀菌剂在葡萄主要病害(白腐病和霜霉病)防治中的应用。
背景技术
绿色食品生产是当前国际农产品生产的主要方向，随着科学发展和人类对环境保护及人类自己健康认识的不断加深，绿色食品生产已愈来愈受到世界各国的重视。葡萄在全世界果树中占重要地位，无论栽培面积和产量均位于第二位。在中国，葡萄也具有悠久的栽培历史，根据史书记载已超过两千年。葡萄的生物学和栽培方式具有特殊性，因此，在其生长发育过程中容易受到病菌危害，其病害种类之多、造成的损失之大倍受关注。目前，葡萄白腐病和葡萄霜霉病是葡萄种植中的两大主要病害。
葡萄白腐病(Coniothyrium diplodiella)又称腐烂病，是葡萄生长期引起果实腐烂的主要病害，葡萄园地发生较普遍，果实损失率在10-15％，在严重的年份里可损失60％以上，甚至失收，高温高湿季节，该病危害相当严重。果梗和穗轴上发病处先产生淡褐色水浸状近圆形病斑，病部腐烂变褐色，很快蔓延至果粒，果粒变褐软，失去经济价值。
葡萄霜霉病是由葡萄生单轴霉(Plasmopara viticala)引起的一种专性寄生性真菌病害。葡萄霜霉病是一种世界性的葡萄病害，尤其在多雨潮湿地区发生普遍。葡萄霜霉病主要危害叶片，也可危害新梢、叶柄、卷须、花序、幼果和果梗等较幼嫩的部分。叶片正面形成多角形的黄褐色病斑，叶片背面在潮湿的条件下产生白色霜状物。葡萄霜霉病发病严重时，叶片焦枯早落，新梢生长不良，果实产量降低、品质变劣，植株抗寒性差。
目前葡萄白腐病和霜霉病的防治方法主要是加强田间管理、培育抗病品种和化学防治。防治葡萄白腐病的药剂还有50％退菌特可湿性粉剂800-1000倍液、50％福美双可湿粉剂600-800倍液等。自1882年法国人米拉德特发明第一种防治葡萄霜霉病的杀菌剂波尔多液开始，化学防治始终是生产中防治葡萄霜霉病最常见、最方便、最有效的手段之一，同时波尔多液也是防止葡萄白腐病的重要药剂。另外一些杀菌组合物(包括丙硫菌唑和氟吡菌胺)对葡萄霜霉病也具有显著的防治效果，特别是由丙硫菌唑和氟吡菌胺质量比为2:1的杀菌组合物制得的杀菌剂对葡萄霜霉病的防治效果最好。
但葡萄的病害一般都是混合发生的，所以需要同时喷施几种药剂。如当葡萄进入绒球期后，喷1次3-5波美度石硫合剂；开花前和落叶后喷1:0.5:180波尔多液；花期前后喷速克灵和农利灵，能有效防治葡萄病害。还有一些杀菌剂组合物悬浮剂，也表现出极强的杀菌活性。由苯醚甲环唑和丙环唑组成的组合物杀菌剂，以悬浮剂为产品剂型，该杀菌剂原料重量百分配比为苯醚甲环唑10-25％、丙环唑10-25％、助剂3-25％、填料10-50％。该组合物杀菌剂也主要用于葡萄病害的防治，对葡萄具有保护和治疗作用。
长期大量的使用化学合成类农药，对自然生态环境造成污染，使农副产品中的农药残留量增加，病虫草害的抗药性也日趋严重。据国外近几年研究报导，已经发现447种害虫和害螨，100余种植物病原菌对一到数种化学农药产生了抗药性，而且分析预测今后将以每5年约10％的数量递增。本研究采用生物防治葡萄主要病害对保障我国葡萄的安全生产和稳产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题起着重要的意义。
由于生物防治具有对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用。目前，成功应用于植物病害生物防治的微生物涉及到真菌、细菌、放线菌等很多生物种群，其中Bacillus属是近年来科研工作者研究的热点。芽孢杆菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布广泛，能产生抗逆性强的芽孢，其抑制植物病原菌的范围很广，包括根部、叶部、枝干、花部和收获后果实等多种病害，是一种理想的生防微生物。
目前在霜霉病的防治中也使用一些复合菌剂，如公开号:103621584A的发明《一种黄瓜霜霉病的防治药物》公开的黄瓜霜霉病的防治药物，包括如下重量单位组分的防治药物：90％三乙膦酸铝可湿性粉剂10-15份，连翘8-12份，野菊花3-6份，霜贝尔3-6份，大蒜油6-9份，嘧铜菌酯2-4份。该菌剂配比简单，使用方便。经过试验测试，混合物的400-500倍液，对古巴假霜霉菌具有明显的灭活作用，治疗黄瓜霜霉病的效果好。还有公开号:103598257A的发明《一种治疗瓜类叶子霜霉病的药物的制造方法》公开的治疗瓜类叶子霜霉病的复合药物，按质量百分比混合包括：64％杀毒矾可湿性粉剂12份，铁苋10份，白鲜皮4份，霜贝尔4份，大蒜油7份，克木霉菌可湿性粉剂3份。研究发现，该产品对黄瓜霜霉病有良好的治疗效果。
上述发明虽然减少了化学合成类农药的使用，但是仍然离不开化学农药，且上述发明是针对瓜类研制，并不适用于葡萄病害的防治。
芽孢杆菌中的地衣芽孢杆菌具有许多优良性能，如：有较广的抑菌谱、生长速度快、适应环境能力强、能在土壤和植物表面定殖并形成优势种群、诱导寄主产生抗病性和分泌产生多种抗菌物质。地衣芽孢杆菌是一种对人畜十分安全的细菌性生防菌。公开号:102021131A的中国发明《一种地衣芽孢杆菌菌株及其应用》公开了从福建省福州市永泰、福清、闽侯等6个县(市)的番茄、西瓜、豇豆等作物的根际土壤中分离并筛选得到具有很好生物防治作用的菌株，该菌株为地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)FJAT-4，且采用该菌株制备了一种能够对西瓜枯萎病进行有效防治的发酵液。该发酵液不仅对西瓜尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用，并在田间表现出很好的防治西瓜枯萎病的效果，具有较好的生产应用前景。
目前，专用于葡萄病害防治的生物杀菌剂并未见报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前生产上大量使用化学农药防治葡萄病害，严重污染了葡萄园的生态环境，导致农药残留超标并影响葡萄的品质等问题，提出了一种对葡萄重要病害—白腐病和霜霉病具有良好防治效果的地衣芽孢杆菌霜贝尔复配生物杀菌剂。地衣芽孢杆菌和霜贝尔复配后，形成互补的特点，既能发挥地衣芽孢杆菌有效控制白腐病的作用，又能发挥霜贝尔防治霜霉病的作用，且效果优于单独使用的防治效果。通过该复配生物杀菌剂的使用，在葡萄园生态环境中引入大量有益微生物，恶化病原菌的生存环境，结合栽培管理等农业措施，形成一个稳定的、平衡的、生物多样化的葡萄园生态系统，达到一药多治、持久地控制葡萄病害流行的目的。
本发明在研究中发现：地衣芽孢杆菌对葡萄白腐病有良好的防治效果，对葡萄霜霉病也有一定的防治作用。
霜贝尔是从十余味中草药中提取有效活性成分，复配而成的一种植物源活性苷肽杀菌剂。霜贝尔的特点是无药害、无残留和无污染。特别是添加了保护性助剂，能提高药液渗透能力，可阻止菌丝的生长和孢子产生，达到杀灭病原菌和提高作物产量、品质的目的。霜贝尔主要用于防治植物的霜霉病、疫病和疫霉病，对绵腐病也有较好的防治效果。
为解决上述问题，本发明提供一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，主要由地衣芽孢杆菌和霜贝尔复配而成；所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂包括有效活性成分以及助剂；所述有效活性成分占复配生物杀菌剂的质量百分比为98％；所述助剂占复配生物杀菌剂质量百分比的2％；所述的有效活性成分主要由地衣芽孢杆菌Y24和霜贝尔组成；所述有效活性成分中，地衣芽孢杆菌Y24含量为6.6亿-13.3亿活芽孢/mL，霜贝尔的质量百分比含量为1.3-2.6％；
较佳的，所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比2:1复配后获得，该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为13.3亿活芽孢/mL，霜贝尔含量为1.3％；
较佳的，所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比1:1复配后获得。该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为10亿活芽孢/mL，霜贝尔的含量为2％；
较佳的，所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比1:2复配后获得，该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为6.6亿活芽孢/mL，霜贝尔的含量为2.6％。
所述20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室配制，方法是在活芽孢含量为20亿/mL的发酵液中加入1％吐温80、0.5％山梨醇制成。
所述助剂为木质素磺酸钠。
一种复配生物杀菌剂的应用：可用于葡萄病害防治；
所述的葡萄病害为：葡萄白腐病和葡萄霜霉病。
所述复配生物杀菌剂在葡萄病害防治应用中的使用方法为：将复配生物杀菌剂稀释100倍，将稀释后的复配生物杀菌剂在葡萄生长期喷洒在果粒和叶面上，用于防治葡萄病害。
所述复配生物杀菌剂在葡萄病害防治中的具体使用方法为：每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg，稀释100倍后，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次。喷药应选择晴朗，风力小的天气，每株均匀喷雾，喷药量以叶片和果面的正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度。试验期间无降雨，无灾难性气候和其他病虫害影响。
有益效果
将生防微生物地衣芽孢杆菌和霜贝尔按一定比例混合使用，不仅能发挥地衣芽孢杆菌诱导葡萄植株抗病性、防治白腐病的作用，又能发挥霜贝尔有效控制霜霉病的作用。通过复配、协同作用，达到优势互补、扩大防治范围、减少用药次数、降低用药成本、提高防治效果的目的。
由于有效活性成分含量高，便于存储和运输，使用时取水稀释，非常方便。
经测试表明，本发明复配杀菌剂产品中的霜贝尔对地衣芽孢杆菌的生长、繁殖无干扰作用，使产品具有稳定的药效。
具体实施方式
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Y24菌株，于2015年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏号为CGMCC No.11448。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Y24菌株是由郭继平在河北省衡水市赵圈镇的葡萄种植园内采集葡萄叶片，用无菌纸袋带回衡水学院生命科学系微生物学实验室进行分离得到的。采用稀释平板分离法，将葡萄叶片剪碎后悬浮于含有1％吐温80的无菌水中，取100μL悬浮液涂布于YEPD固体培养基上，28℃培养3d，挑取单菌落进行鉴定。通过菌落特征、细胞形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列特征，鉴定其为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
芽孢杆菌是从土壤和植株等材料上分离得到，能产生耐热、抗逆性的芽孢，具有显著的生防潜力，利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖一类细菌。不同种的芽孢杆菌可以防治不同的病害，如枯草芽孢杆菌菌株可以防治水稻纹枯病、番茄叶霉病等；侧孢芽孢杆菌可以防治辣椒疮痂病、番茄早疫病菌等。也有为了提高防效，将芽孢杆菌和其他一些药剂进行复配的实例，如将嘧霉胺与枯草芽孢杆菌B-916协同防治梨黑斑病，该复配剂稀释20倍(6.67×106cfu/mLB-916；167mg/L嘧霉胺)，对梨黑斑病的田间防治效果显著优于嘧霉胺(500mg/L)和B-916(1.00×107cfu/mL)单剂。将多粘类芽孢杆菌和井冈霉素复配组合物用于防治油茶炭疽病，多粘类芽孢杆菌和井冈霉素复配组合物的复配比例(1:20)的防效为78.51％，高于对照药剂。
地衣芽孢杆菌Y24菌株特征在于，在NA培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、微黄色、表面粗糙不透明，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。细胞形态和排列呈杆状、单生。革兰氏阳性，长2.5～3.5μm；宽0.8～1.5μm，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。无荚膜，无鞭毛，能运动。最佳生长温度为30℃；最适生长pH为7.0。V-P反应阳性；接触酶阳性，卵磷脂阳性，还原硝酸盐；在7％NaCl和pH 5-7肉汤中生长良好；可利用葡萄糖、木糖、甘露醇、柠檬酸盐、淀粉和酪素，但不能利用阿拉伯糖。
实施例1
一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，由有效活性成分以及助剂组成，所述的有效活性成分主要由地衣芽孢杆菌Y24和霜贝尔组成。
所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比2:1复配后获得，该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为13.3亿活芽孢/mL，霜贝尔含量为1.3％；
所述20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂(以下简称20亿活芽孢/毫升水剂)由衡水学院生命科学系微生物学实验室配制，方法是在活芽孢含量为20亿/mL的发酵液中加入1％吐温80、0.5％山梨醇制成。
4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
所述助剂为木质素磺酸钠，购于天津市光复精细化工研究所。
将20亿活芽孢/毫升水剂和4％霜贝尔水剂按照质量百分比2:1备料，助剂木质素磺酸钠按质量百分比的2％备料，即：
20亿活芽孢/毫升水剂：65.4％；4％霜贝尔水剂：32.6％；助剂木质素磺酸钠：2％。
所述复配生物杀菌剂，由如下方法制备：
将20亿活芽孢/毫升水剂和4％霜贝尔水剂按上述比例置于混合器中，加入上述比例的助剂木质素磺酸钠，所有物料在混合器中混合均匀后，即得复配生物杀菌剂。
一种复配生物杀菌剂的应用，可用于葡萄病害防治；
所述的葡萄病害为：葡萄白腐病和葡萄霜霉病。
所述复配生物杀菌剂在葡萄病害防治应用中的使用方法为：将复配生物杀菌剂稀释100倍，将稀释后的复配生物杀菌剂在葡萄生长期喷洒在果粒和叶面上，用于防治葡萄病害。
所述复配生物杀菌剂在葡萄病害防治中的具体使用方法为：每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg，稀释100倍后，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次。喷药应选择晴朗，风力小的天气，每株均匀喷雾，喷药量以叶片和果面的正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度。试验期间无降雨，无灾难性气候和其他病虫害影响。
实施例2
一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，主要由地衣芽孢杆菌和霜贝尔复配而成；所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂包括有效活性成分以及助剂；所述有效活性成分占复配生物杀菌剂的质量百分比为98％；所述助剂占复配生物杀菌剂质量百分比的2％；所述的有效活性成分主要由地衣芽孢杆菌Y24和霜贝尔组成；
所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比1:1复配后获得。该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为10亿活芽孢/mL，霜贝尔的含量为2％；
所述20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室配制，方法是在活芽孢含量为20亿/mL的发酵液中加入1％吐温80、0.5％山梨醇制成。
所述4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
所述助剂为木质素磺酸钠，购于天津市光复精细化工研究所。
将20亿活芽孢/毫升水剂和4％霜贝尔水剂按照质量百分比1:1备料，助剂木质素磺酸钠按质量百分比的2％备料，即：
20亿活芽孢/毫升水剂：49％；4％霜贝尔水剂：49％；助剂木质素磺酸钠：2％。
所述复配生物杀菌剂，由如下方法制备：
将20亿活芽孢/毫升水剂和4％霜贝尔水剂按上述比例置于混合器中，加入上述比例的助剂木质素磺酸钠，所有物料在混合器中混合均匀后，即得复配生物杀菌剂。
一种复配生物杀菌剂的应用：可用于葡萄白腐病和葡萄霜霉病防治；
所述复配生物杀菌剂在葡萄病害防治中的具体使用方法为：每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg，稀释100倍后，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次。喷药应选择晴朗，风力小的天气，每株均匀喷雾，喷药量以叶片和果面的正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度。试验期间无降雨，无灾难性气候和其他病虫害影响。
实施例3
一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，主要由地衣芽孢杆菌和霜贝尔复配而成；所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂包括有效活性成分以及助剂；所述有效活性成分占复配生物杀菌剂的质量百分比为98％；所述助剂占复配生物杀菌剂质量百分比的2％；所述的有效活性成分主要由地衣芽孢杆菌Y24和霜贝尔组成；
所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比1:2复配后获得，该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为6.6亿活芽孢/mL，霜贝尔的含量为2.6％。
所述20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室配制，方法是在活芽孢含量为20亿/mL的发酵液中加入1％吐温80、0.5％山梨醇制成。
所述4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
所述助剂为木质素磺酸钠，购于天津市光复精细化工研究所。
将20亿活芽孢/毫升水剂和4％霜贝尔水剂按照质量百分比1:2备料，助剂木质素磺酸钠按质量百分比的2％备料，即：
20亿活芽孢/毫升水剂：32.6％；4％霜贝尔水剂：65.4％；助剂木质素磺酸钠：2％。
所述复配生物杀菌剂，由如下方法制备：
将20亿活芽孢/毫升水剂和4％霜贝尔水剂按上述比例置于混合器中，加入上述比例的助剂木质素磺酸钠，所有物料在混合器中混合均匀后，即得复配生物杀菌剂。
一种复配生物杀菌剂的应用：可用于葡萄白腐病和葡萄霜霉病防治；
所述复配生物杀菌剂在葡萄病害防治中的具体使用方法为：每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg，稀释100倍后，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次。喷药应选择晴朗，风力小的天气，每株均匀喷雾，喷药量以叶片和果面的正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度。试验期间无降雨，无灾难性气候和其他病虫害影响。
实验例1
实施例1-3制得的复配生物杀菌剂在防治葡萄主要病害，抑制葡萄白腐病菌生长的增效作用测定。
供试菌株：葡萄白腐病菌cfcc83954购于北京豫鼎新捷有限公司。
被测药剂：由实施例1-3制备的复配生物杀菌剂。
对照药剂：
20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室提供。
4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
室内增效作用测定：
供试葡萄白腐病菌cfcc83954菌株在PDA(每升中含马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、自然pH)培养基上活化直到长出黑色的分生孢子器，用接种环刮取后溶于无菌蒸馏水中，振荡后使分生孢子浓度达到105个/mL，吸取100μL均匀涂在PDA平板上晾干，将1个直径为6mm灭菌滤纸片放在平板中央备用。
将20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂稀释成8×106cfu/mL、4×106cfu/mL、8×105cfu/mL、4×105cfu/mL、8×104cfu/mL、4×104cfu/mL 6个不同梯度。
将4％霜贝尔稀释成1000ppm、500ppm、100ppm、50ppm、10ppm、5ppm 6个不同梯度。
将实施例1-3的复配生物杀菌剂稀释成4×106cfu/mL+500ppm、2×106cfu/mL+250ppm、4×105cfu/mL+50ppm、2×105cfu/mL+25ppm、4×104cfu/mL+5ppm、2×104cfu/mL+2.5ppm 6个不同梯度。
分别吸取50μL不同浓度的待测药液滴在灭菌滤纸片上，同时设立空白对照(将无菌水滴入灭菌滤纸片)，每处理3个重复。当空白对照平板长满葡萄白腐病菌时，测量抑菌圈直径，并计算抑制率。
抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100
采用毒力曲线法即取剂量对数为横坐标(x)，抑菌百分率值为纵坐标(y)，在计算机上绘制毒力曲线，求出两种药剂毒力回归方程(y＝a+bx，其中a表示截距，b表示回归系数)、相关系数(r2)，进而计算出EC50值。
复配剂的理论EC50＝单剂ⅠEC50×配比数+单剂ⅡEC50×配比数
增效系数SR＝混合物的理论EC50/混合物的实测EC50
参考Wadley公式，增效系数SR>1.5为增效作用，1.5>SR>1为相加作用，SR<1.0为拮抗作用。
室内试验结果见表1，结果表明：实施例3制得的复配生物杀菌剂的增效系数为0.51，说明较大浓度的霜贝尔对地衣芽孢杆菌抑菌作用的发挥起到一定的抑制作用。实施例1的增效系数为1.13，其值在1.5>SR>1这个范围，对葡萄白腐病菌的抑制为相加作用。实施例2的增效系数为1.54，说明该种菌剂对抑制葡萄白腐病菌的生长有增效作用。
表1复配生物杀菌剂抑制葡萄白腐病菌生长的增效测定
实验例2复配生物杀菌剂抑制葡萄霜霉病菌孢子囊萌发的增效作用测定。
供试菌：
葡萄霜霉病菌T5采集于衡水市赵圈镇葡萄种植园。
被测药剂：
由实施例1-3制备的复配生物杀菌剂。
对比药剂：
20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室提供。
4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
室内增效生物测定：
试验时先将二层灭菌的滤纸放入培养皿中，用无菌水保湿，然后将凹玻片放入培养皿中，用移液枪吸取葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液滴入玻片上的凹槽中。样品中加入被测药剂和对比药剂，24h后记录萌发情况，每处理3次重复，计算抑制率。
抑制率(％)＝(对照组孢子囊数量-处理组孢子囊数量)/对照组孢子囊数量×100
增效系数SR计算与实验例1相同。
室内试验结果见表2，结果表明：实施例1的增效系数为1.21，实施例3的增效系数为1.47，这两个实施例的增效系数在1.5>SR>1这个范围，所以对抑制葡萄霜霉病菌孢子囊的萌发起到相加作用。实施例2的增效系数为1.66，该值SR>1.5，说明实施例2对抑制葡萄霜霉病菌孢子囊的萌发表现出显著的增效作用。
表2复配生物杀菌剂抑制葡萄霜霉病菌孢子囊萌发的增效测定
实验例3：复配生物杀菌剂防治葡萄白腐病的田间试验
试验时间：于2016年5月30日-7月20日在河北省衡水市赵圈镇葡萄种植园内进行。
试验葡萄品种：巨峰
被测药剂：
由实施例1-3制备的复配生物杀菌剂。
对比药剂：
20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室提供。
4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
田间药效试验设计：试验共6个处理：A、稀释100倍的20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂；B、稀释100倍的4％霜贝尔水剂；C、稀释100倍的实施例1复配生物杀菌剂；D、稀释100倍的实施例2复配生物杀菌剂；E、稀释100倍的实施例3复配生物杀菌剂；F、无菌水对照。每处理喷施150株葡萄树，重复3次。分别于5月30日起，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次，每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg。喷药当天天气晴朗，风力小，每株均匀喷雾，喷药量以叶片和果面的正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度。试验期间无降雨，无灾难性气候和其他病虫害影响。于7月15日调查各个处理区的葡萄白腐病发病指数，计算防治效果。
病情分级标准如下：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占果实面积5％以下；
3级：病斑面积占果实面积6-15％；
5级：病斑面积占果实面积16-30％；
7级：病斑面积占果实面积31-50％；
9级：病斑面积占果实面积50％以上。
田间试验结果见表3，结果表明：4％霜贝尔水剂对葡萄白腐病的田间防治效果最差(55.71％)，其次是20亿地衣芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂(防效为65.87％)，实施例1、实施例2和实施例3复配生物杀菌剂的田间防治效果均好于其他处理，同时实施例2复配生物杀菌剂的防治效果最好(85.28％)，说明该菌剂经合理的范围复配后可以增强田间的防治效果。
表3复配生物杀菌剂对葡萄白腐病的田间防效试验
处理 喷雾4次后病情指数 防治效果(％)
20亿活芽孢/毫升水剂 23.62±1.83c 65.87±1.49b
4％霜贝尔水剂 36.52±1.49b 55.71±1.11c
实施例1复配生物杀菌剂 15.06±0.51d 81.73±2.36a
实施例2复配生物杀菌剂 12.14±0.48d 85.28±2.57a
实施例3复配生物杀菌剂 28.14±0.99c 71.35±1.38b
无菌水对照 82.47±3.96a -
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。
实验例4：复配生物杀菌剂防治葡萄霜霉病的田间试验
试验时间：于2016年5月30日-7月20日在河北省衡水市赵圈镇葡萄种植园内进行。
试验葡萄品种：巨峰
被测药剂：
由实施例1-3制备的复配生物杀菌剂。
对比药剂：
20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂由衡水学院生命科学系微生物学实验室提供。
4％霜贝尔水剂由潍坊奥丰作物病害防治有限公司提供。
田间药效试验设计：试验共6个处理：A、稀释100倍的20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂；B、稀释100倍的4％霜贝尔水剂；C、稀释100倍的实施例1复配生物杀菌剂；D、稀释100倍的实施例2复配生物杀菌剂；E、稀释100倍的实施例3复配生物杀菌剂；F、无菌水对照。每处理喷施150株葡萄树，重复3次，每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg。分别于5月30日起，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次。在下午16:00后进行，避开高温时间。喷药量以叶片和果粒正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度。于7月10日调查各个处理区的葡萄霜霉病发病指数，各处理随机调查30个当年抽生新蔓，自上而下调查10片叶，记录各级病叶数并分析计算防效。
叶片病情分级标准如下：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个叶面积的6-25％；
5级：病斑面积占整个叶面积的26-50％；
7级：病斑面积占整个叶面积的51-75％；
9级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。
田间试验结果见表4，结果表明：实施例2复配生物杀菌剂防治葡萄霜霉病效果最好，防效可达82.25％。其次为实施例3、实施例1复配生物杀菌剂(防效分别为79.34％和75.94％)，4％霜贝尔水剂和20亿地衣芽孢杆菌活芽孢/毫升水剂的田间防治效果最差。说明该菌剂经合适比例复配后可以产生协同作用，能显著增强田间试验的防治效果。
表4复配生物杀菌剂对葡萄霜霉病的田间防效试验
处理 喷雾4次后病情指数 防治效果(％)
20亿活芽孢/毫升水剂 33.89±1.97b 60.27±1.57d
4％霜贝尔水剂 20.52±1.74c 69.25±1.76c
实施例1复配生物杀菌剂 26.23±0.74c 75.94±1.89b
实施例2复配生物杀菌剂 15.14±0.61d 82.25±2.42a
实施例3复配生物杀菌剂 17.62±0.82d 79.34±2.31b
无菌水对照 85.31±3.51a -
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。

Claims (8)

1.一种防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，包括有效活性成分以及助剂；
所述有效活性成分占复配生物杀菌剂的质量百分比为98％；所述助剂占复配生物杀菌剂质量百分比的2％；
所述有效活性成分主要由地衣芽孢杆菌Y24和霜贝尔组成；所述有效活性成分中，地衣芽孢杆菌Y24含量为10亿-13.3亿活芽孢/mL，霜贝尔的质量百分比含量为1.3-2％；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Y24菌株，保藏号为CGMCC No.11448。
2.根据权利要求1所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，其特征在于，所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比2:1复配后获得，该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为13.3亿活芽孢/mL，霜贝尔含量为1.3％。
3.根据权利要求1所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，其特征在于，所述有效活性成分：由20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂与4％的霜贝尔水剂以质量百分比1:1复配后获得，该菌剂中地衣芽孢杆菌Y24的含量为10亿活芽孢/mL，霜贝尔的含量为2％。
4.根据权利要求2或3所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，其特征在于，所述20亿地衣芽孢杆菌Y24活芽孢/毫升水剂，是在活芽孢含量为20亿/mL的发酵液中加入1％吐温80、0.5％山梨醇制成。
5.根据权利要求1所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂，其特征在于，所述助剂为木质素磺酸钠。
6.权利要求1-5任一一项所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂的应用：用于葡萄白腐病和葡萄霜霉病病害防治。
7.根据权利要求6所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂的应用，其特征在于，使用方法为：将复配生物杀菌剂稀释100倍，将稀释后的复配生物杀菌剂在葡萄生长期喷洒在果粒和叶面上，用于防治葡萄病害。
8.根据权利要求6所述防治葡萄病害的复配生物杀菌剂的应用，其特征在于，使用方法为：每亩复配生物杀菌剂的用量为4kg，稀释100倍后，采用手动式喷雾器喷药，每隔10天喷药一次，共喷五次；喷药应选择晴朗，风力小的天气，每株均匀喷雾，喷药量以叶片和果面的正反面湿润、树体均匀着药、稍有药滴下淌为度；喷药期间无降雨，无灾难性气候和其他病虫害影响。
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