CN101697736A - 枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及填充辅料，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的重量百分比为10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢杆菌和丙环唑组成。在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的重量百分比为：10-90％。应用时，将成品药剂稀释后喷洒在果树上用于防治果树真菌病害。其优点是：将枯草芽孢杆菌与化学药剂丙环唑按一定比例混合使用，能充分发挥微生物和化学药剂的协同作用，达到优势互补、扩大防治范围，减少化学药剂用药量、降低用药成本，在提高防治效果的同时，改善了果园生态环境、减少了化学药剂在果品中的残留量。

Description

枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种复配可湿性杀菌粉剂及其应用，尤其是一种将枯草芽孢杆菌和丙环唑复配的可湿性杀菌粉剂及其在防治果树真菌病害中的应用。

背景技术

随着国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，对果品的数量、质量及其安全性提出了越来越高的要求。近20年来，我国的果树栽培事业有了长足的发展，栽培面积迅速增加，果品产量急速提高，经济及社会效益比较明显。尤其是近10多年，农村产业结构的调整，带来了“千家万户种果树”的喜人局面。然而，当前果品生产的形势并不令人乐观，在世界各发达国家已完成从数量市场向质量市场这一转变的时候，我国的果品质量十分令人担忧，很难参与国际果品市场的竞争。提高果品质量，开拓国际市场和国内的高档消费市场，是当前果品生产的关键。在影响果品质量的众多因素中，果树病害是相当重要的因素之一。在传统的果树生产上，防治病害完全依靠化学农药。由于近年来我国果树的重大病害频繁暴发，形成了在果树生长期连续不断使用化学农药的严峻局面。以江苏省为例，据不完全统计，在梨、苹果的全生育期内用药在15次以上，徐州地区果园从果树发芽开始至收获期间，每隔10天打一次药；这种化学防治果树病害的方法不仅造成了生态环境和水质严重污染，而且直接增加了有毒化学物质在果品中的残留量，对人类健康带来严重危害。如何减少果品中的残留量果品中的化学药物残留量，已经成为各级政府以及学者和果农关注的焦点。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌；是分布在土壤、植物表面和根际的重要微生物种类，能产生一系列代谢产物抑制其它微生物的生长，具有防治植物病害的作用。目前在全世界保存的野生型枯草芽孢杆菌菌株有几百种，研究证实枯草芽孢杆菌能够产生40多种具有不同结构和功能的抗菌物质。

江苏省农科院筛选获得的、对果树多种真菌病害有很好防效的枯草芽孢杆菌sf-628于2006年8月1日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)受理保藏，保藏编号为：CGMCC No.1772，拉丁学名为Bacillus subtilis sf-628(本文简称sf-628)。其生物学性状记载为：sf-628在YPGA(酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g；葡萄糖5.0g，琼脂17.0g；水1000ml)培养基平板上生长24h的菌落3-5mm，菌落圆形，四周光滑，米色，表面有皱褶。革兰氏反应阳性，细胞形状杆状，细胞直径大于1μm，严格好气，L-阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、淀粉水解、明胶液化等利用反应均为阳性。

枯草芽孢杆菌sf-628是一株对化学药剂丙环唑有天然抗性的菌株，用丙环唑进一步抗性诱导处理，能够在丙环唑含量10000ppm的YGPA培养基上正常生长。

枯草芽孢杆菌sf-628还具有许多优良性能，如：有较广的抑菌谱，对多种植物病原菌有很强的抑制作用；生长速度快，适应环境能力强，能在土壤和植物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质；对果树轮纹病、黑斑病和炭疽病有很好的防治效果。

目前，江苏省苏科农化有限责任公司利用枯草芽孢杆菌sf-628生产了具有不同含菌量的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。

丙环唑，英文通用名propiconazole；化学名称为1-〔2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊环-2-甲基〕-1-氢-1，2，4三唑。其他名称：敌力脱、必扑尔、tilt、Banner等。原药外观为淡黄色粘绸液体，沸点(13.3Pa)180℃，蒸汽压(20℃)0.133mPa，折光率1.5468，比重(20℃)1.27g/cm3。在水中溶解度为110mg/L，易溶于有机溶剂。320℃以下稳定，对光较稳定，水解不明显。在酸性、碱性介质中较稳定，不腐蚀金属。贮存稳定性三年。属于中等毒性杀菌剂。原药对大鼠急性经口LD50＞1517mg/kg，急性经皮肤LD50＞4000mg/kg。对家兔眼睛和皮肤有轻度刺激作用。丙环唑具有治疗和保护双重作用，内吸性强，可被根、茎、叶部吸收，并能很快地在植物株体内向上传导，能有效地防治多数高等真菌引起的病害。丙环唑残效期在1个月左右。作用机理是影响淄醇的生物合成，使病原菌的细胞膜功能受到破坏，最终导致细胞死亡，从而起到杀菌、防病和治病的功效。丙环唑对梨(苹果)黑斑病、轮纹病和炭疽病均有较好的防效。

目前，将枯草芽孢杆菌和丙环唑复配的可湿性杀菌粉剂并未见诸报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前生产上大量使用化学农药防治果树病害、严重污染果园生态环境、导致农药残留超标、影响果品品质的问题，提出一种对多种果树真菌病害均具有良好防治效果的枯草芽孢杆菌丙环唑微生物复配的可湿性杀菌粉剂及其在防治果树真菌病害中的应用。枯草芽孢杆菌sf-628和丙环唑复配后，形成优势互补的作用，既能发挥化学药剂高效、快速的抑菌作用，又能发挥sf-628在诱导果树抗病性、大量繁殖后微生物群落合理分布的调整功能等作用。通过使用该微生物复配剂，在果园生态环境引进大量有益微生物，恶化病原菌的生存环境，结合栽培管理等农业措施，形成一个稳定的、平衡的、生物多样化的果园生态系统，达到一药多治、药效增加、减少化学药剂使用量、持久地控制果树病害流行的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及填充辅料，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的重量百分比为10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢杆菌和丙环唑组成，在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的重量百分比为：10-90％。

在本发明中：有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的最佳重量百分比为：20-70％。

在本发明中：助剂为农药中可湿性粉剂的常规助剂，填充辅料为农药中可湿性粉剂的常规填充辅料；在成品药剂中助剂和填充辅料所占的重量百分比分别为1～20％和10～75％。

一种上述复配可湿性杀菌粉剂的应用，其特征在于：将成品药剂稀释后喷洒在果树上用于防治果树真菌病害。

在所述复配杀菌粉剂的应用中，所述的果树真菌病害是指：真菌引起的果树轮纹病、或黑斑病、或炭疽病。

在所述复配杀菌粉剂的应用中，将成品药剂稀释500～1500倍，稀释后有效药物成分的含量至少为300mg/L。

在所述复配杀菌粉剂的应用中：稀释后有效药物成分的最佳含量为300mg/L～480mg/L。

本发明的优点在于：通过引进对人畜安全、对多种果树病害病原菌具有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌sf-628，将其与化学药剂丙环唑按一定比例混合使用，不仅能发挥化学药剂丙环唑抑菌速度快、对果树轮纹病、黑斑病、炭疽病防治效果稳定的优势，同时还能保持生防微生物枯草芽孢杆菌sf-628能在植物根叶围定殖、分泌抗生素、诱导植物产生抗病性等特点，通过复配、协同作用，达到互补优势、扩大防治范围，减少化学药剂用药量、降低用药成本，在提高防治效果的同时，改善了果园生态环境、减少了化学药剂在果品中的残留量。

具体实施方式：

实施例1、

枯草芽孢杆菌sf-628对梨轮纹病菌、黑斑病菌和炭疽病菌生长的抑制作用。

供试真菌病原菌菌株：梨轮纹病菌、黑斑病菌、炭疽病菌，由江苏省农科院植保所提供。将供试病原菌移植PSA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、20g琼胶和1000ml蒸馏水，pH 5.6～6.6)上，置于28℃培养箱中培养5d，备用。

将江苏省农业科学院筛选获得的生防菌枯草芽孢杆菌sf-628在NA斜面(3g牛肉浸膏、1g酵母浸膏、5g蛋白胨、10g蔗糖、20g琼胶和1000ml蒸馏水，pH 6.8～7.0)上进行活化，然后移入50ml NA培养液中，在28℃下振荡(150r/m)培养48h，备用。在PSA平板中央放置病原菌菌丝块，直径为7mm；培养皿四周呈对角线放置4个滤纸片(离培养皿中心距离为22.5mm)，加入不同稀释倍数的生防菌sf-628菌液7μl；设无生防菌sf-628菌液处理为对照。每处理重复3次。待对照病原菌菌落长满平板时，测量处理菌落生长直径。计算抑制率：抑制率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)]×100％。

表1 不同稀释倍数的生防菌sf-628对梨病原菌菌丝生长的抑制作用

实施例2

不同配比的有效药物成分对梨轮纹病菌的毒力测定

(1)供试病菌：

以梨轮纹病菌为供试菌(江苏省农业科学院植保研究所提供)。

(2)供试药剂：

A、25％丙环唑EC由江苏丰登农药有限公司生产提供。

B、600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂由江苏省苏科农化有限责任公司生产提供。

室内增效生物测定：

将25％丙环唑EC配成0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml带药的PSA培养基平板；将600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂配成6×10⁶cfu枯草芽孢杆菌/ml、6×10⁵cfu枯草芽孢杆菌/ml、6×10⁴cfu枯草芽孢杆菌/ml、6×10³cfu枯草芽孢杆菌/ml带菌的PSA培养基平板；将A、B按照有效药物成分重量比1∶3；1∶2；1∶1；2∶1；3∶1共5个配比对梨轮纹病菌进行毒力测定，分别稀释2500倍、5000倍、10000倍、20000倍、40000倍，制备成带不同梯度药液的PSA培养基平板。再将梨轮纹病菌(直径7mm)接入带毒平板，丙环唑单剂和枯草芽孢杆菌单剂做对照，同时设立清水对照平板，待清水对照平板长满时，测量菌落直径。

计算抑制率：抑制率(％)＝[(对照菌落直径-药剂处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)]×100％

将抑制率观察值转化为抑制率的等值偏差，以各处理的培养基中杀菌剂的浓度对数为X，以相应处理对病原菌菌丝生长抑制率的等值偏差为Y，应用统计回归方法，拟合出浓度对数-抑制百分率机率值毒力曲线，计算EC₅₀值和SR。参考Wadley公式(增效指数SR＝混合物的理论EC₅₀/混合物的实测EC₅₀，SR＞1.5为增效作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR＜0.5为拮抗作用)。

实验结果见表2。

表2  不同配比的枯草芽孢杆菌丙环唑复配杀菌剂抑制梨轮纹病菌菌丝生长的增效测定

药剂	回归方程	EC50(μg/ml)	增效指数
				A：25％丙环唑EC	y＝0.4295x+7.1400	0.0069	/
B：600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1359x+5.7441	0.0042	/
				A∶B＝1∶3	y＝0.1513x+5.8343	0.0040	1.16
A∶B＝1∶2	y＝0.1407x+5.8582	0.0022	2.15
				A∶B＝1∶1	y＝0.1398x+5.8801	0.0018	2.83
A∶B＝2∶1	y＝0.1369x+5.8487	0.0020	2.80
				A∶B＝3∶1	y＝0.1401x+5.8959	0.0017	3.56

实施例3

8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的配制

有效药物：25％丙环唑EC和600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的来源与实施例2相同。

助剂选择：NNO(亚甲基二萘磺酸钠)。

填充辅料：轻质碳酸钙

将各组分按照重量百分比备料：

25％丙环唑：32％；600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂：16.7％；NNO(亚甲基二萘磺酸钠)：8％；轻质碳酸钙：43.3％。

制备过程：将丙环唑、枯草芽孢杆菌按上述比例置于混合器中，加入NNO(亚甲基二萘磺酸钠)，用轻质碳酸钙填充至100％，所有物料在混合器中混合均匀后，经气流粉碎机粉碎，即成8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。

实施例4、

8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制梨轮纹病菌、黑斑病菌和炭疽病菌生长的增效作用测定

被测药剂：由实施例3提供的8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。

对比药剂：25％丙环唑EC(江苏丰登农药有限公司提供)；600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(江苏省苏科农化有限责任公司生产提供)。

室内增效生物测定：

将25％丙环唑EC配成0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml带药的PSA培养基平板；将600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂配成6×10⁶cfu枯草芽孢杆菌/ml、6×10⁵cfu枯草芽孢杆菌/ml、6×10⁴cfu枯草芽孢杆菌/ml、6×10³cfu枯草芽孢杆菌/ml带菌的PSA培养基平板；将8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂稀释1000倍、2500倍、5000倍、10000倍、20000倍，制备成带不同梯度药液的PSA培养基平板。再将梨轮纹病菌、黑斑病菌、炭疽病菌(直径7mm)接入带毒平板，丙环唑单剂和枯草芽孢杆菌单剂做对照，同时设立清水对照平板，待清水对照平板长满时，测量菌落直径。

抑制率和增效指数SR计算与实施例2相同。

实验结果分别记载于表3、表4和表5中。

表3  8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制梨轮纹病菌菌丝生长的增效测定

药剂	回归方程	EC50(μg/ml)	增效指数
				25％丙环唑EC	y＝0.4295x+7.1400	0.0069	/
600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1359x+5.7441	0.0042	/
				8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1407x+5.8582	0.0022	2.15

表4  8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制梨黑斑病菌菌丝生长的增效测定

药剂	回归方程	EC50(μg/ml)	增效指数
				25％丙环唑EC	y＝0.2046x+5.3397	0.1901	/
600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1211x+5.5991	0.0071	/
				8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1046x+5.5637	0.0046	2.27

表5   8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制梨炭疽病菌菌丝生长的增效测定

药剂	回归方程	EC50(μg/ml)	增效指数
				25％丙环唑EC	y＝0.6854x+6.2919	0.1518	/
600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1487x+5.7974	0.0047	/
				8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	y＝0.1300x+5.8125	0.0019	3.65

实施例5、

8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治果树轮纹病、黑斑病、炭疽病的田间小区效果

试验时间：于2009年3月15日左右(梨树开花期)在丰县孙楼镇大洼村一承包户的梨园内进行。

试验品种：黄金梨。

试验药剂：由实施例3提供的8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。

对比药剂：25％丙环唑可湿性粉剂(江苏丰登农药有限公司生产提供)；600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(江苏省苏科农化有限责任公司生产提供)。

田间药效试验：采用喷雾法防治梨轮纹病、黑斑病和炭疽病。梨树落花后(4月15日左右)每隔两周(15d)喷一次药。梨树整个生长期共需要打药8-9次。按每亩兑水量400Kg均匀喷雾，每小区一亩667m²；每个处理设2次重复，设保护行。

6月上旬调查各个小区的梨黑斑病发病指数，每小区均调查四株，每株分东、南、西、北、中五点取样，每点取当年生枝条的20片叶调查。目测叶片的发病状况，根据病害症状描述，记载病情级别。计算防治效果。

梨黑斑病病情分级标准如下：

0级：无病斑

1级：病斑面积占整个叶面积的5％及以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的5.1％-15％；

5级：病斑面积占整个叶面积的15.1％-33.3％；

7级：病斑面积占整个叶面积的33.4％-50％；

9级：病斑面积占整个叶面积的50.1％及以上。

7月5日-8月23日每隔一周(7d)分别统计调查梨轮纹病、炭疽病引起的烂果，共调查8次。

梨轮纹病病症是梨果表面产生水渍状褐色近圆形斑点，后渐扩大，暗红褐色，呈明显的同心轮纹状，病斑上产生黑色小粒点。梨炭疽病病症是发病初期果面出现淡褐色水渍状的小圆斑，以后病斑逐渐扩大，色泽加深，并且软腐下陷，病斑颜色深浅交错，具明显的同心轮纹。在病斑表面形成无数小斑点，温暖潮湿时呈现一层粉红色的粘质物。

田间试验结果(表6)表明：亩用量800克(稀释500倍)的8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对梨轮纹病、黑斑病和炭疽病的防治效果分别为82.21％、70.44％和82.50％；亩用量500克(稀释800倍)的8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对梨轮纹病、黑斑病和炭疽病的防治效果分别为69.58％、56.81％和68.84％。复配杀菌粉剂800克/亩的防治效果优于25％丙环唑乳油(亩用量400毫升，稀释1000倍)和600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(亩用量250g，稀释1600倍)的防治效果(见表6)。

表6  8％丙环唑·100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治果树轮纹病、黑斑病、炭疽病的田间小区效果

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及填充辅料，其特征在于：有效活性成分占成品药剂的重量百分比为10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢杆菌和丙环唑组成，在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的重量百分比为：10-90％。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂，其特征在于：在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的最佳重量百分比为：20-70％。

3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌丙环唑复配可湿性杀菌粉剂，其特征在于：助剂为农药中可湿性粉剂的常规助剂，填充辅料为农药中可湿性粉剂的常规填充辅料；在成品药剂中助剂和填充辅料所占的重量百分比分别为1～20％和10～75％。

4.一种如权利要求1所述复配可湿性杀菌粉剂的应用，其特征在于：将成品药剂稀释后喷洒在果树上用于防治果树真菌病害。

5.根据权利要求4所述的复配杀菌粉剂的应用，其特征在于：所述的果树真菌病害是指：真菌引起的果树轮纹病、或黑斑病、或炭疽病。

6.根据权利要求4或5所述的复配杀菌粉剂的应用，其特征在于：将成品药剂稀释500～1500倍，稀释后的有效药物成分含量至少为300mg/L。

7.根据权利要求6所述的复配杀菌粉剂的应用，其特征在于：稀释后有效药物成分的最佳含量为300mg/L～480mg/L。