DE102008034098A1

DE102008034098A1 - Zubereitung und lontophoretische Vorrichtung für die transdermale Anwendung von Wirkstoffen

Info

Publication number: DE102008034098A1
Application number: DE102008034098A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. Koch; Rolf Pracht; Christoph Schmitz
Original assignee: LTS Lohmann Therapie Systeme AG
Current assignee: LTS Lohmann Therapie Systeme AG
Priority date: 2008-07-21
Filing date: 2008-07-21
Publication date: 2010-02-04
Also published as: CN102131497A; KR20110051185A; EP2299975A1; JP2011528672A; US20110295184A1; WO2010009808A1; BRPI0916345A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft iontophoretische Vorrichtung und eine wirkstoffhaltige Zubereitung zur transdermalen Abgabe von Wirkstoffen, insbesondere von Human-Insulin. Beispielsweise wird somit Insulin, ein blutzuckersenkendes, den Glykogenabbau hemmendes Hormon der Bauchspeicheldrüse, als wichtigstes Medikament für die Therapie der Krankheit Diabetis mellitus, der transdermalen Resorptionsroute zugänglich gemacht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zubereitung und Iontophoretische Vorrichtung zur transdermalen Abgabe von Wirkstoffen, insbesondere von Human-Insulin.
Insulin, ein blutzuckersenkendes, den Glykogenabbau hemmendes Hormon der Bauchspeicheldrüse, ist das wichtigste Medikament für die Therapie der Krankheit Diabetis mellitus, einer Zuckerverwertungsstörung infolge relativen oder absoluten Mangels an Insulin mit begleitender Störung des Fett- und Eiweißstoffwechsels sowie Schäden an Leber, Blutgefäß- und Nervensystem.
Aufgrund seiner chemischen Natur ist Insulin ein Peptid und kann deshalb nur über parenterale Wege appliziert werden, in denen keine proteolytischen Prozesse stattfinden, die unweigerlich zu einer Zersetzung des Insulins führen würden. Eine Verabreichung über den Gastrointestinaltrakt ist ungeeignet. Als bevorzugter Applikationsweg für Insulin hat sich seit dessen Einführung die subkutane Injektion durchgesetzt, auch weil sie relativ kostengünstig und vom Patienten gut selber durchführbar ist. Neben der Infektionsgefahr, gibt es weitere Probleme für Patienten, die unter einer sogenannten Spritzenphobie leiden. Deshalb wurde in den letzten Jahrzehnten nach anderen parenteralen Abgabemöglichkeiten für Insulin gesucht. Zuletzt wurde im Jahr 2003 ein Inhalationssystem von Insulin für den pulmonalen Resorptionsweg vorgestellt, jedoch wurde dieses System nach seiner Einführung sehr schnell wieder vom Markt genommen. Ein anderer Weg, der in den letzten Jahren immer wieder Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten war, ist die transdermale Resorptionsroute. Da das Insulinmolekül aufgrund seiner physikochemischen Eigenschaften die Hautpermeations-barriere nicht überwinden kann, mit 5700 Dalton hat es z. B. ein viel zu großes Molekülgewicht, hat man versucht, Insulin mittels liposomaler Zubereitungen in Form sogenannter Transfersomen^® durch die Haut in den Blutkreislauf zu bringen. [1]
Transfersomen^® sind bestimmte Lipidvesikel, d. h. geschlossene Hohlkugeln im Nanometerbereich, bestehend aus einer oder mehreren Lipiddoppelschichten, wobei hochgereinigtes Lecithin als Phospholipid den Grundbaustein bzw. das Grundgerüst der kugelförmigen Membran bildet. Transfersomen^® weisen gegenüber ihren aufbauver-wandten Liposomen eine hohe Membranflexibilität und damit eine starke Liposomen-deformierbarkeit aus, die es ihnen scheinbar ermöglicht, sogar in Poren einzudringen, die viel kleiner sind als sie selbst. Da sowohl die Innenräume der kugelförmigen Transfersomen^® als auch die Innenräume der Membranen selbst mit Arzneistoffen beladen werden können, stellen Transfersomen^® als eine Art „Shuttle” eine interessante galenische Darreichungsform für die dermale oder transdermale Transportroute dar.
Ob Liposomen bzw. Transfersomen^® tatsächlich zu einer verstärkten dermalen Wirkstoffpenetration gegenüber herkömmlicher galenischer Zubereitungen führen, ist aber in der Fachliteratur sehr umstritten und wird auch teils mit konträren Beispielen belegt. So zeigten die Autoren in [2], dass gerade große hydrophile Moleküle, wie das Protein Insulin, Wachstumshormone oder Cyclosporin nicht mittels Transfersomen^® in die Haut penetrieren können. Eigene in vitro-Permeationsstudien mit Insulin, gekapselt in einer transfersomähnlichen Zubereitung, konnten keinen Beweis für eine „Shuttle”-Wirkung erbringen; weder im Akzeptorteil unter der Haut (Franz-Diffusionszelle) noch in der Haut selbst konnten messbare Spuren von Insulin (Massenspektroskopie) gefunden werden. Die Aussage der Autoren in [1] darf auch deshalb bezweifelt werden, da eine humane Klinikstudie mit liposomal zubereitetem Insulin für die transdermale Applikation, durchgeführt von der Anmelderin, ein negatives Ergebnis zu Tage brachte. [3]
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und Peptide oder Proteine, insbesondere große hydrophile Moleküle, wie beispielsweise Wachstumshormone oder Cyclosporin und insbesondere das Protein Insulin, effektiv, aber auch kostengünstig in geeigneter Weise für die transdermale Verabreichung zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Kit umfassend eine Iontophorese-Vorrichtung und eine wirkstoffhaltige Zubereitung, wobei die wirkstoffhaltige Zubereitung geschlossene Hohlkörper enthält, welche als Liposomen oder Micellen vorliegen und einen Wirkstoff aus der Gruppe der Peptide oder Proteine enthalten.
Um so überraschender konnte in der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass beispielsweise liposomal verkapseltes Insulin in einer Zubereitung der transdermalen Resorptionsroute zugänglich gemacht werden kann, indem man das liposomal verkapseltes Insulin über einen „elektrischen Antrieb”, beispielsweise durch Iontophorese, in die Haut penetrieren bzw. durch die Haut permeieren lässt, obwohl die Iontophorese als effektivste Methode der transdermalen Permeationssteigerung geladener Arzneistoffe gerade für Insulin nicht anwendbar ist. [4]
Der isoelektrische Punkt (isoelektrischer Punkt = pH-Wert, an dem Ladungsausgleich vorliegt, d. h. die Konzentration des Anions ist gleich der des Kations eines Ampholyten) von Insulin liegt bei einem pH-Wert von 5,4; d. h. bei einem pH-Wert < 5,4 trägt das Insulin-Molekül eine positive Ladung (= Kation), während es bei einem pH-Wert > 5,4 negativ (= Anion) geladen ist. Da in der Haut ein pH-Gradient existiert, auf der Hautoberfläche liegt ein pH-Wert von 5,2 vor, der sich immer mehr dem physiologischen pH-Wert von 7,4 annähert, je tiefer man sich durch die Haut in Richtung Körperinneres bzw. Blutgefäße bewegt, würde das Insulinmolekül während einer transdermalen Permeationsroute unweigerlich den Ladungszustand wechseln. Die daraus folgende Konsequenz ist ein Transportstopp der transdermalen Passage; wobei das Insulin sogar wieder in Richtung hautseitig applizierten Wirkstoffteil zurückwandern würde.
Angenommen, der pH-Wert im Insulin wäre auf 4,0 eingestellt, würde Insulin als Kation vorliegen und könnte zunächst in die Haut penetrieren, vorausgesetzt, die Aktiv-Elektrode über dem Insulin ist als positive Elektrode (= Anode) geschaltet.
Durch den pH-Gradienten in der Haut wird das Insulin-Molekül aber zunächst neutral, der isoelektrische Punkt liegt ja bei einem pH von 5,4, um dann sogar zunehmend negativ geladen zu werden. Dadurch kann die elektromotorische Antriebskraft der Iontophorese im Sinne einer Permeation durch die Haut nicht mehr wirken; im Gegenteil, das jetzt negativ geladene Insulin müsste nach den Gesetzen der Elektromigration wieder in Richtung der positiven Elektrode und damit zum Wirkstoffreservoir zurück wandern.
Im umgekehrten Fall, d. h. die Aktiv-Elektrode über dem Insulin wäre als negative Elektrode (= Kathode) geschaltet und der pH-Wert der Insulin-Zubereitung ist gleich oder geringfügig > 7 (ab einem pH-Wert von > 8,5 treten Hautreizungen auf), so dass Insulin negativ geladen wäre, sind die Wanderungs- bzw. Transportverhältnisse ähnlich; das Insulin-Molekül würde schon in der äußersten Hautschicht, dem Stratum corneum oder Hornhaut, als neutrales Molekül vorliegen und nicht mehr weiterpenetrieren können. Für einen Stofftransport mittels Iontophorese ist es unerlässlich, dass die zu transportierenden Wirkstoffe geladen sind. Im Falle von Peptiden gilt, dass sich nur solche als transdermale Kandidaten für die Iontophorese eignen, deren isoelektrischer Punkt bei einem pH < 4,0 oder > 8,0 liegt. [4]
Im Fall der vorliegenden Erfindung wird dieses Problem dadurch überwunden, dass zum einen das liposomal verkapseltes Insulin während der transdermalen Penetrationsroute keine Änderung seiner Ladungsverhältnisse erfährt, es ist ja verkapselt und damit elektrisch abgeschirmt und zum anderen für den eigentlichen Transport-Mechanismus vermutlich nicht die Elektromigration der Iontophorese (Wanderung geladener Teilchen zu ihren entgegengesetzt geladenen Elektroden) ausgenutzt wird, sondern die sogenannte Elektroosmose, ein Prozess, die als Begleiterscheinung bzw. Nebenprodukt beim Anlegen eines elektrischen Feldes auf der Haut entsteht. Durch den unterschiedlichen Wassergehalt in den einzelnen Hautschichten bildet sich beim Anlegen eines elektrischen Feldes ein Potentialgradient aus, der die Permeabilität der Haut erhöht und die Ausbildung eines Flüssigkeitsstromes durch die Haut hindurch bewirkt. Dieser wird wiederum dafür verantwortlich gemacht, dass während der Iontophorese auch ungeladene, elektrische neutrale Moleküle, wie beispielsweise liposomales Insulin verstärkt in die Haut penetrieren können [5].
Allein mittels Iontophorese ist die transdermale Route von Insulin oder Insulinanaloga auch deshalb sehr erschwert und ohne therapeutische Relevanz [6], da proteolytische Zersetzungsreaktionen durch in der Haut vorkommende Proteasen eine große Rolle spielen. In 1a und b wird beispielsweise der Abbau von Insulin in einer mittels Ultra-Turrax-Behandlung zerkleinerten Humanhautprobe unter der Einwirkung von hauteigenen Proteasen gezeigt. Nach 8 Stunden ist de facto kein Insulin mehr nachweisbar. Es ist deshalb unerlässlich, Insulin während seiner transdermalen Resorptionsroute insbesonder auch vor dem Angriff peptidspaltender Proteasen zu schützen. Als Liposomen werden kugelförmige oder ovoide Gebilde aus einer oder mehreren konzentrischen Lipid-Doppelschichten mit wässrigem Innenraum verstanden, sogenannte Lipidvesikel.
Die Form der Liposomen ist für den Gegenstand der Erfindung letztendlich unerheblich und kann von der Kugelform deutlich abweichen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Liposomen und Micellen als Hohlkörper verstanden, die in der Lage sind, mittels Jontophorese in die Haut zu penetrieren bzw. durch die Haut zu permeieren. Der Durchmesser der Hohlkörper liegt üblicherweise im Bereich von 25 nm bis 1 μm. Aufgrund ihrer Stabilität werden bevorzugt solche mit einem Durchmesser von 100 bis 300 nm eingesetzt.
Die im Vortext angesprochenen Transfersomen^® sind im Sinne dieser Erfindung ebenfalls als spezielle wirkstoffhaltige Zubereitung für die Transdermale Verabreichung geeignet und werden unter dem Begriff Liposomen in der Anmeldung mitgeführt. Beispielsweise ist die Herstellung von Transfersomen^® in der DE 44 47 287 C1 angegeben, deren Offenbarungsinhalt Bestandteil dieser Beschreibung ist. Üblicherweise werden Liposomen durch Suspendieren geeigneter Lipide in wäßriger Lösung erzeugt. Dazu werden beispielsweise Phosphatidylcholine (Lecithine), Phosphatidylethanolamine oder Phosphatidylserine (Kephaline) eingesetzt. Durch Behandlung dieser Mischung mit Ultraschall entsteht eine Dispersion von ungefähr gleich großen geschlossenen Liposomen. Solche Liposomen lassen sich beispielsweise auch dadurch erzeugen, daß man eine Ethanol/Lipid-Lösung rasch mit Wasser mischt. Wird das Lipid durch eine dünne Nadel in die wässrige Lösung eingespritzt, entstehen runde Liposomen von ca. 50 nm Durchmesser.
Eine weitere Methode (Filmmethode) besteht durch Erzeugung eines auf der Innenwand eines Rundkolbens mittels Rotationsverdampfer homogenen, transparenten Lipidfilms. Nach Auflösen des Films in geeigneter Pufferlösung werden spontan multilamellare Liposomen unterschiedlicher Größe erzeugt. Wenn die resultierende multilamellare Liposomen-Dispersion mehrfach unter Druck durch beispielsweise eine Polycarbonatmembran mit definierter Porengröße extrudiert wird, erhält man uni- oder oligolamellare Liposomen, die durch eine homogene Größenverteilung gekennzeichnet sind. Grundsätzlich sind diese Methoden dem Fachmann bekannt.
Des Weiteren konnte überraschend festgestellt werden, dass Insulin oder Insulinalanolga außerdem der transdermalen Resorptionsroute über Iontophorese zugänglich gemacht werden kann, indem man es durch Micellbildung mit ionischen oder auch nichtionischen Tensiden kapselt. Unter Micellen versteht man die Anordnung von einzelnen Molekülen zu einem größeren Verband von meist kolloidaler Größenordnung (Assoziationskolloiden) mit geordneter Struktur infolge zwischenmolekularer Kräfte.
Als micellbildende Moleküle kommen besonders Tensidmoleküle wie beispielsweise Fettsäuren, Gallensäuren, Alkylsulfate, Fettalkoholsulfate, Fettalkohol-ethersulfate, Sulfosuccinate, α-Olefinsulfonate, Isethionate, Alkan- und Alkylbenzen-sulfonate, Saponine, quartäre Ammoniumsalze, besonders bevorzugt Natrium-Dodecylsulfat oder Natrium-Cholat.
Als Beispiele für nichtionogene Tenside kommen Polyethylenglycolether, Phenolethoxylate und Alkylolamide in Betracht, besonders bevorzugt Octylphenolpoly(ethylenglycolether)₁₀. Micellbildende Moleküle zeichnen sich dadurch aus, dass sie einen hydrophoben Kohlenwasserstoff und eine hydrophile Gruppe im Molekül enthalten. Im Fall der Herausbildung von Kugel- oder Stäbchenmicellen können im Inneren des gebildeten Assoziates andere Moleküle infolge selektiver Adsorption eingelagert werden, die dann wie im Beispiel von Seifen, als Öltröpfchen (lipophile Phase) für Wasser (hydrophile Phase) benetzbar und damit in Wasser mischbar gemacht werden können.
Für eine wirksame Micellbildung müssen die ausgewählten Tenside mindestens in solchen Mengen eingesetzt werden, die ihrer sogenannten kritischen Micellbildung entsprechen. Im Fall von Insulin oder Insulinalanolga werden einmal die Ladungen im Molekül überdeckt bzw. maskiert, so dass der für iontophoretische Transportvorgänge durch Humanhaut ungünstige isoelektrische Punkt ausgeschaltet wird und zum anderen das Insulinmolekül durch die äußere Schutzhülle der es umgebenden Tensidmoleküle vor dem proteolytischen Abbau durch hauteigene Proteasen geschützt ist.
Die wirkstoffhaltige Zubereitung liegt beispielsweise als Lösung, Salbe, Paste, Schaum oder Gel vor. Sie kann neben den wirkstoffhaltigen Hohlkörpern noch weitere Hilfsstoffe wie Lipide, Wasser, Alkohole, Gelbildner Emulgatoren, Stabilisatroren und Enhancer enthalten. Die Zubereitung kann auch Anteile wirkstoffhaltiger Hohlkörper mit verschiedenen Wirkstoffen enthalten. Damit kann beispielsweise kurzwirksames Insulin bzw. Insulinanaloga und Insulin bzw. Insulinanaloga mit Langzeitwirkung in einer Anwendung verabreicht werden.
Erst durch die Kombination von Iontophorese sowie liposomaler und/oder micellbildender Galenik gelingt es Peptid(e) oder Protein(e), die die Hormon- oder Hormon-ähnliche Wirkung entfalten, insbeondere Insulin oder Insulinanaloga, transdermal für eine hinreichend therapeutische Anwendung verfügbar zu machen. Bevorzugt sind erfindungsgemäß mindestens 10 internationale Einheiten oder mindestens 350 μg an Insulin bioverfügbar. Die Gehaltsbestimmung erfolgt entweder in vitro über den Restgehalt (HPLC) in der Haut nach Permeationsende oder direkt in vivo über Plasmabestimmung bzw. Bestimmung des Blutzuckerspiegels.
Die Zubereitung weist idealerweise während seiner transdermalen Passage in einem Zeitraum von 5 Stunden noch mindestens 50% von seinem Ausgangsgehalt an Wirkstoff auf. Die Gehaltsbestimmung erfolgt hier in vitro wieder über den Restgehalt (HPLC) in der Haut nach vorgeschalteter Extraktion, wobei in vitro als Modell für in vivo steht.
Neben der transdermalen Verabreichung von Insulin oder Insulinanaloga eignet sich die Erfindung gleichfalls zur Verabreichung physiologisch hochaktiver Peptide, die Hormon- oder Hormon-ähnliche Wirkung entfalten (Peptid-Hormone), einschließlich deren Derivate oder Konjugate mit einem mittleren Molekulargewicht Mw von 300 bis 1.000.000 (Dalton). Im Allgemeinen handelt es sich bei den Peptid-Hormonen um Oligo-, häufiger noch um Polypeptide (mit bis zu 100 Aminosäuren), zuweilen auch um höhermolekulare Proteine (Proteohormone). Die Peptid- und Protein-Wirkstoffe können als freie Säuren oder Basen eingesetzt werden.
Der Wirkstoff kann ein mittleres Molekulargewicht von kleiner 3.000 Da haben. Beispiele für solche Wirkstoffe sind insbesondere Abarelix, Angiotensin II, Anidulafungin, Antide, Argipressin, Azalin und Azalin B, Bombesin-Antagonist, Bradykinin, Buserelin, Cetrorelix, Ciclosporin A, Desmopressin, Detirelix, Enkephaline (Leu-, Met-)Ganirelix, Gonadorelin, Goserelin, Growthhormone-Secretagogue, Micafungin, Nafarelin, Leuprolide, Leuprorelin, Octreotid, Orntide, Oxytocin, Ramorelix, Sekretin, Somatotropin, Terlipressin, Tetracosactid, Teverelix, Triptorelin, Thyroliberin, Thyrotropin, Vasopressin.
Der Wirkstoff kann ein mittleres Molekulargewicht von 3.000 bis 10.000 Da sein. Beispiele für solche Wirkstoffe sind insbesondere Calcitonin, Corticotropin, Endorphine, Epithelial growth factor, Glucagon, Insulin, Novolin, Parathyroid hormon, Relaxin, Pro-Somatostatin, Salmon Secretin.
Der Wirkstoff kann ein mittleres Molekulargewicht von mehr als 10.000 sein. Beispiele für solche Wirkstoffe sind insbesondere Interferone (alpha, beta, gamma), Interleukine (IL1, IL2), Somatotropin, Erytropoietin, Tumornekrosefaktor (TNF alpha, beta), Relaxin, Endorphin, Dornase alpha, Folikel stimulierendes Hormon (FSH), Human chorion gonadotropin (HCG), Human Growth Hormone Release factor (hGRF), Luteinisierendes Hormon (LH) oder Epidermal Growth Factor.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Tabelle 1, 1–4 und Beispielen 0–4 weiter erläutert.
Tabelle 1 enthält die Zusammenfassung aller in vitro-Permeationsergebnisse. Die in vitro-Permeationsmessungen der erfindungsgemäßen Systeme wurden am in vitro-Hautmodell Human-Vollhaut (1) mit Hilfe modifizierter Franz-Diffusionszellen, ausgestattet als Ausführung für die Iontophorese, durchgeführt. Als Akzeptormedium diente in allen Fällen 0,025 molare HEPES-Pufferlösung (HEPES: 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure), eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4 und thermostatisiert auf 32°C.
1a stellt die in vitro – Versuchsanordnung für die transdermale Applikation von Human-Insulin mittels kombinierter Anwendung von Iontophorese und liposomaler oder micellarer Galenik dar. 1b stellt den bei der Anwendung erzeugten Effekt der Elektroosmose dar.
Darin sind:

(1) Ag/AgCl-Elektrode als Anode und Kathode (Aktiv-Elektrode und Gegenelektrode).
(2) Verum-Kompartiment Anode bzw. Kathode, als Liposom oder als Micelle vorliegend.
(3) Elektrolyt-Kompartiment Kathode bzw. Anode, wirkstofffrei.
(4) Elektrolyt-Schicht, als Leitfähigkeitsverbesserer für den Verum-Teil in der Anode bzw. Kathode.
(5) Selbstklebender Haftring mit Auftrags-Vlies für die Wirkstoff-Aufnahme.
(6) Oberer Teil der Humanhaut (Epidermis mit nichtvorgeschädigtem Stratum corneum)
(7) Liposomen oder Micellen, elektrisch neutral oder elektrisch negativ geladen, Human-Insulin enthaltend.
(8) Durch Elektroosmose, ein Nebeneffekt der Iontophorese, geschaffener Flüssigkeitsstrom, mit dessen Hilfe erst die Insulin enthaltenden Liposomen hindurchwandern bzw. permeiern können.
(9) Dermis mit Blutkapillargefäßen zum systemischen Abtransport des transdermal applizierten Wirkstoffes.

Als Stromquelle wurde üblicherweise ein Gleichstrom-Generator benutzt (Hameg HM 7042-5, Fa. Hameg aus Mainhausen, Deutschland), der auf eine konstante Stromstärkeabgabe von 500 μA/cm² Resorptionsfläche Haut eingestellt wurde. Als Elektrodenmaterial wurden vollflächige Ag/AgCl-Elektroden der Fa. NAImco, Chattanooga (USA) eingesetzt. Das Elektrolytreservoir der Gegenelektrode (Kathode oder auch Anode) bestand aus einer 2%igen Lösung von Hydroxypropylcellulose mit 0,9 Gew.-% Zusatz von NaCl, die mit einem Flächengewicht von 3 g/30 cm² auf ein Vlies, bestehend aus ungewebtem Polyestervlies (Paramol N 260-300P, Fa. Lohmann & Rauscher, Neuwied, Deutschland), aufgetragen wurde. In das Anoden- bzw.
Kathodenreservoir, die Ausstattung als Anode oder Kathode richtete sich nach der Ladung des entsprechenden Hohlkörpers, wurden ca. 200 mg der entsprechenden Insulinzubereitung auf das identische Vlies von der Gegenelektrode aufgebracht. Der Rand bestand zwecks Fixierung auf der Haut aus einem selbstklebenden Schaumring aus Polyolefinen (3M, Typ 1779). Die Permeationsdauer bzw. Iontophorese-Behandlung betrug bei allen Versuchen jeweils 5 Stunden; im Fall der Transfersomen wurden die Elektroden jeweils nach 2,5 h umgepolt. Der Kontakt zwischen den Zellen wird durch einen Silberdraht als Brücke hergestellt.
Nach Permeationsende wurde die Haut einer Restgehaltsbestimmung auf Insulin unterzogen, in dem sie zunächst mit Hilfe einer Schere in mehrere kleine Teile geschnitten, dann für 5 Stunden unter Schütteln in 70%igem salzsauren Ethanol extrahiert wurde, um anschließend mittels einer spezifischen HPLC-Methode für Insulin untersucht zu werden. Um zu zeigen, dass Insulin auch wirklich die Hauptpermeationsbarriere der menschlichen Haut, das Stratum corneum, überwunden hat, wurde die Haut für die Restgehaltsbestimmung dahingehend vorbereitet, dass das Stratum corneum mittels des sogenannten „tage strippings” [7] vor der Extraktion von Insulin aus der Hautprobe entfernt wurde. Um außerdem die Selektivität des eingesetzten analytischen Verfahrens und den Wahrheitsgrad des detektierten Insulins zu unterstreichen, wurden die in vitro-Permeationversuche jeweils mit Verum- und Placeboprobe (gleiche galenische Zubereitung ohne Wirkstoff) durchgeführt.
2 zeigt den proteolytischen Abbauprozess von isoliertem Insulin, d. h. das Insulin ist weder liposomal noch micellar verkapselt und im Vergleich dazu den deutlich geringeren Abbau von Insulin, das durch Liposom- bzw. Micellbildung vor Proteasen geschützt ist.
3 und 4 zeigen beispielhaft HPLC-Chromatogramme von Verum- und Placebo-Proben aus den Permeationsstudien für die Insulin-Zubereitungen, hier für Erfindungsbeispiel 1. In der Placebo-Probe ist im Retentionszeitbereich von Insulin kein Peak erkennbar; somit handelt es sich um den als Insulin erkannten Peak tatsächlich um Insulin, was durch die Chromatogramme in 4 (HPLC-Chromatogramm der entsprechenden Insulin-Standardprobe) und UV-Spektrenvergleich Standard- und Verum-probe (hier nicht als Figur gezeigt) zusätzlich belegt wird. Das Gleiche konnte für die übrigen Erfindungsbeispiele gezeigt werden, deshalb nur einmal beispielhaft aufgeführt.
3 zeigt Insulin-Liposomen-Chromatogramme (Emission) von Restgehalte Humanvollhaut, gelöst in 70%igen, 0,01 m salz-saurem Ethanol, wobei Verum (1) und Placebo (2) dargestellt ist.

4 zeigt Insulin-Standard- und Insulin-Liposomen-Chromatogramme (Emission) Restgehalte Humanvollhaut, gelöst in 70%igen, 0,01 m salzsaurem Ethanol, wobei Insulin-Standardverdünnung SV3, c = 11,01 μg/ml (1) und Verum (2) dargestellt ist. Tab.1: Ergebnisübersicht Insulin-Iontophorese-Versuche mit verschiedenen galenischen Zubereitungen, die Eigenladung des Insulins jeweils überdeckend bzw. maskierend

Erfindungsbeispiel	Vehikel (Mizellbildner)	Beladung [μg/cm²]	Gehalt Haut [μg/cm	% permeiert	Größe [cm²] für Abgabemenge von 350 μg (entspricht Basal-Bolus-Therapie)
0 (Vergleichsbeispiel)	nur Puffer¹ (Tris/HCl)	1680	kein Insulin detektierbar
1	Gallensalze¹	1598	6,4	0,40	55
2	Na-Dodecylsulfat¹	1680	13,3	0,80	26
3	Triton X-100²	26,5	3,53	13	85
4	Liposom I²	500	1,90	0,38	184

¹ – Schaltung des Verum-Kompartimentes als Kathode, da das Vehikel nach außen eine negative Ladung trägt
² – Schaltung des Verum-Kompartimentes zunächst als Kathode, dann nach 2,5 h Umpolen als Anode, da das Vehikel nach außen elektroneutral – ist

Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, zumindest für die Erfindungsbeispiele 1–3 eine transdermale Therapie für Diabetes mellitus Typ 1 mit akzeptablen TTS-Größen < 100 cm² durchführen zu können. Insbesondere zur Behandlung einer chronischen Stoffwechselstörung (Diabetes mellitus), die auf einen Mangel an Insulin oder herabgesetzter Insulin-Wirkung beruht, läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Gegenstand hervorragend behandeln.
Zur transdermalen Verabreichung von Insulin oder Insulinanaloga wird durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet:

a) Herstellung einer wirkstoffhaltigen Zubereitung enthaltend Insulin oder Insulinanaloga in geschlossenen Hohlkörper, wobei die Hohlkörper als Liposomen oder Micellen vorliegen.
b) Aufbringen der Zubereitung zusammen mit der Iontophorese-Vorrichtung auf die Haut
c) Durchführung der Iontophorese

2 zeigt die Proteolyse von Insulin in Abhängigkeit von der Kontaktzeit mit in vitro-Humanhautmaterial. Der Einfluß von hauteigenen Proteasen auf den Abbau von Insulin, nachdem eine Insulin-Pufferlösung mit definiertem Gehalt zusammen mit in vitro-Humanhaut-Stanzen (24 cm²), die mittels eines Ultra-Turrax-Dispergiergerätes zerkleinert wurden, über einen Zeitraum von 8 h durch Rühren in Kontakt waren, ist deutlich zu erkennen. Der Abbau in der micellaren Insulin-Probe (Triton-X 100^® als micelibildendes nichtionisches Tensid) verläuft deutlich verlangsamt; hier liegt der Insulin-Gehalt selbst nach 8 Stunden Kontaktzeit noch deutlich über 50%. Darin bedeuten:

A Referenzlösung
B, C Insulin unverkapselt
D Insulin micellar verkapselt

Als technische Ausführungsform in der Praxis kann im Prinzip, wie weiter oben für die in vitro-Permeations- bzw. Resorptionsstudien beschrieben, das gleiche System eingesetzt werden. Als Elektrodenmaterial werden beispielsweise vollflächige Ag/AgCl-Elektroden der Fa. NAImco, Chattanooga (USA) eingesetzt, die wahlweise in verschieden Größen (1,5–4 cm²) angeboten werden, selbstklebend und mit einem Polyestervlies zur Aufnahme der Wirkstoffzubereitungen ausgestattet sind. Die wirkstoffhaltige Zubereitung ist entweder im anodischen oder kathodischen Teil der Iontophorese-Vorrichtung untergebracht.
Das Elektrolytreservoir der Gegenelektrode (Kathode oder auch Anode) besteht beispielsweise wiederum aus einer 2%igen Lösung von Hydroxypropylcellulose mit 0,9 Gew.-% Zusatz von Natriumchlorid, die mit einem Flächengewicht entsprechend von 3 g/30 cm² in bzw. auf das Auftragsvlies der NaImco^®-Elektroden aufgetragen. Als Gegenelektroden beispielsweise können auch die entsprechenden Elektroden [„Dispersive (Return) electrode] des Iontophorese-Applikationskits („ionto + plus HI- performance”) von NAImco verwendet werden. Diese sind bereits mit einem pufferhaltigen und leitfähigen sowie selbstklebenden Polymer ausgestattet. Die Permeationsdauer bzw. Iontophorese-Behandlung sollte vorzugsweise einen Zeitraum von 5 Stunden nicht überschreiten. Vorzugsweise werden nach der Hälfte der Dauer der Iontophorese die Elektroden umgepolt, wenn nach außen elektrisch neutrale Hohlkörper eingesetzt werden. Im Fall der Verwendung von Liposomen und Micellen mit nichtionischen Tensiden werden die Elektroden bei einer Anwendung von 5 Stunden demgemäß jeweils nach 2,5 Stunden umgepolt.
Als Stromversorgungsquelle mit Regelung bzw. Steuerung der Stromstärke werden ein entsprechendes Gerät ebenfalls der Fa. NAImco eingesetzt. Typenbezeichnung „id³ drug delivery devicei”, das aufgrund seiner Größe mittels Klettverschlüssen beispielsweise am Oberarm oder oberhalb des Handgelenkes befestigt wird. Die Elektroden werden mit dem Stromgenerator über herkömmliche Kabel mit Bananensteckeranschluß verbunden.
Erfindungsbeispiel 1: Herstellung einer micellaren Zubereitung mittels Natrium-Oxycholat
Zunächst wird ein Tris/HCl-Puffer/Glycerin/Wasser-Gemisch (pH 6,8) mit folgender Zusammensetzung hergestellt (Tris: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol bzw. Amino-tris(hydroxymethyl)-methan).

25,0 ml 0,5 m Tris/1 m HCl
11,5 ml Glycerin
63,5 ml Wasser

In dieses Gemisch werden dann 366 mg Natrium-Oxycholat, entspricht 8,5 mmol, eingetragen und gerührt, bis eine klare Lösung entstanden ist (Lösung A). Anschließend werden ca. 100 mg Human-Insulin in einen 10 ml-Meßkolben eingewogen und mit der Lösung A aufgefüllt. Der Ansatz wird bis zum vollständigen Auflösen des Insulins bzw. für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann direkt für die Permeationsexperimente verwendet.
Erfindungsbeispiel 2: Herstellung einer micellaren Zubereitung mittels Natrium-Dodecylsulfat
Die Herstellung erfolgt analog Erfindungsbeispiel 1 mit dem Unterschied, dass anstelle von Natrium-Oxycholat 2 g Natrium-Dodecylsulfat eingetragen werden. Der Ansatz wird wieder bis zum vollständigen Auflösen des Insulins bzw. für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann direkt für die Permeationsexperimente verwendet.
Erfindungsbeispiel 3: Herstellung einer micellaren Zubereitung mittels Triton X-100^®
Die Herstellung erfolgt analog Erfindungsbeispiel 1 mit dem Unterschied, dass anstelle von Natrium-Oxycholat 323,5 mg Triton X-100^® (entspricht 5 mmol oder 0,3%) eingetragen werden, wobei erst das Triton X-100^® vorgelegt werden muß, danach erfolgt das Auffüllen mit dem Puffer-Glycerin-Gemisch.
Des Weiteren werden anstelle von 100 mg Human-Insulin nur 15,4 mg in einem 100 ml Meßkolben eingewogen und mit dem Triton X-100^®-haltigen Puffer-Glycerin-Gemisch (Triton X-100^® = Octylphenolpoly(ethylenglycolether)₁₀) aufgefüllt. Der Ansatz wird wieder bis zum vollständigen Auflösen des Insulins bzw. für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann direkt für die Permeationsexperimente verwendet.
Erfindungsbeispiel 4: Herstellung einer liposomalen Zubereitung mittels L-α-Phosphatidylcholin nach der Filmmethode [8]
Zunächst werden 187,2 mg L-α-Phosphatidylcholin (Lecithin) in 10 ml Methanol gelöst. 2,5 ml dieser Lipidstammlösung werden anschließend mittels einer Eppendorf-Pipette in einen 50 ml-Rundkolben überführt, die Spitze wird dann noch 2x mit je 2,5 ml Methanol nachgespült. Durch Abziehen des Methanols am Rotationsverdampfer (40°C, Drehstufe 4–5, es darf kein Methanolgeruch mehr wahrnehmbar sein) entsteht ein transparenter Lipidfilm, der im Hochvakuum (p = 0,05 mbar) für 2 Stunden nachgetrocknet wird, um jegliche Lösungsmittelrückstände zu entfernen. In den Rundkolben werden dann 2 ml einer 0,1%igen insulinhaltigen Pufferlösung pipettiert, die sich wie folgt zusammensetzt:
10 mmol HEPES und 150 mmol NaCl, eingestellt mit in NaOH auf pH 7,4
5 mg Human-Insulin werden in 5 ml dieser Pufferlösung unter einstündigem Rühren gelöst. Der Rundkolben mit der Insulinhaltigen Pufferlösung wird über Nacht mit 240 Umdrehungen pro Minute auf einer Schüttelmaschine geschüttelt.
Vergleichsbeispiel 0: Herstellung einer insulinhaltigen Pufferlösung ohne Micell- und/oder Liposomenbildung
Die Herstellung erfolgt analog Erfindungsbeispiel 1 mit dem Unterschied, dass kein Natrium-Oxycholat eingetragen wird. Der Ansatz wird wieder bis zum vollständigen Auflösen des Insulins bzw. für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Von allen Ansätzen (Vergleichsbeispiel 0 und Erfindungsbeispiele 1–4) wurden entsprechende Zubereitungen ohne Human-Insulin (Placebo-Ansätze) hergestellt, die zusammen mit den jeweiligen Verum-Ansätzen in den iontophoretischen in vitro-Permeationsexperimenten getestet wurden (als Insulin-Negativ-Kontrolle bzw. Nachweis der Selektivität der verwendeten analytischen HPLC-Methode für die Restgehaltsbestimmung von Insulin in der Haut).
Quellennachweis

[1] G. Cevc/Drug Delivery across the skin. Exp. Opin. Invest. Drugs 6, S. 1887–1937 (1997)
[2] H. Schreier, J. Bouwstra/Liposomes and niosomes as topical drug carriers: dermal and transdermal drug delivery. J. Contr. Rel. 30, S. 1–155 (1994)
[3] LTS-Klinikstudie Eutra CT Nr.: 2004-004043-21
[4] Y. N. Kalia et al./Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 619–658
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[7] C. Herkenne et al./In vivo Methods fort he Assessment of Topical Drug Bioavailability: Pharm. Res., Vol. 25, No. 1, S. 87–103 (2008)
[8] A. Bangham/Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids: J Mol Biol 13(1): 238–252 (1965)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 4447287 C1 [0016]

Claims

Kit umfassend eine Iontophorese-Vorrichtung und eine wirkstoffhaltige Zubereitung, wobei die wirkstoffhaltige Zubereitung geschlossene Hohlkörper enthält, welche als Liposomen oder Micellen vorliegen und einen Wirkstoff aus der Gruppe der Peptide oder Proteine enthalten.
Kit nach Anspruch 1, wobei die wirkstoffhaltige Zubereitung als Lösung, Salbe, Paste, Schaum oder Gel vorliegt.
Kit nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirkstoff in der Zubereitung ein Peptid-Hormone oder ein Proteo-Hormon, insbesondere Insulin oder ein Insulinanaloga ist.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens 10 internationale Einheiten oder mindestens 350 μg an Insulin bioverfügbar sind.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Gehalt an Wirkstoff(en) in der Zubereitung während seiner transdermalen Passage in einem Zeitraum von 5 Stunden noch mindestens 50% von seinem Ausgangsgehalt aufweist.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die wirkstoffhaltige Zubereitung im anodischen oder kathodischen Teil der Iontophorese-Vorrichtung untergebracht ist.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei nach der Hälfte der Dauer der Iontophorese die Elektroden umgepolt werden.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aktiv-Elektrode und Gegenelektrode jeweils aus Folien bestehen, die mit einer Mischung aus Silber und Silberchlorid beschichtet sind.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sowohl die Aktiv-Elektrode und die Gegenelektrode als selbstklebende Systeme ausgestaltet sind.
Kit nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Micellen aus ionischen Tensiden aufgebaut sind.
Kit nach Anspruch 10, wobei das ionischen Tenside ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Fettsäuren, Gallensäuren, Alkylsulfate, Fettalkoholsulfate, Fettalkoholethersulfate, Sulfosuccinate, α-Olefinsulfonate, Isethionate, Alkan- und Alkylbenzensulfonate und Saponine.
Kit nach Anspruch 11, wobei das ionisches Tensid Natrium-Dodecylsulfat oder Natrium-Cholat ist.
Kit nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Micellen aus nichtionischen Tensiden aufgebaut sind.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche 13, wobei das verwendete nichtionischen Tensid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polyethylenglycolether, Phenolethoxylate und Alkylolamide.
Kit nach einem der vorangehenden Ansprüche 14, wobei das nichtionische Tensid Octylphenolpoly(ethylenglycolether)₁₀ ist.
Kit nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Liposomen aus Lipiden aufgebaut sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylserin.
Verfahren zur transdermalen Verabreichung von Insulin oder Insulinanaloga durch folgende Schritte: a. Herstellung einer wirkstoffhaltigen Zubereitung enthaltend Insulin oder Insulinanaloga in geschlossenen Hohlkörper, wobei die Hohlkörper als Liposomen oder Micellen vorliegen. b. Aufbringen der Zubereitung zusammen mit der Iontophorese-Vorrichtung auf die Haut c. Durchführung der Iontophorese
Verwendung von Kit Anspruch 1 bis 16 zur Behandlung einer chronischen Stoffwechselstörung (Diabetes mellitus), die auf einen Mangel an Insulin oder herabgesetzter Insulin-Wirkung beruht.