WO2007063982A1 - 細菌の免疫凝集測定法 - Google Patents

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WO2007063982A1
WO2007063982A1 PCT/JP2006/324074 JP2006324074W WO2007063982A1 WO 2007063982 A1 WO2007063982 A1 WO 2007063982A1 JP 2006324074 W JP2006324074 W JP 2006324074W WO 2007063982 A1 WO2007063982 A1 WO 2007063982A1
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serum
aggregation
mixed
coli
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PCT/JP2006/324074
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Inventor
Shosaku Motoda
Ryo Shida
Masaru Hirano
Original Assignee
Denka Seiken Co., Ltd.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining bacteria by immunoagglutination.
  • Food poisoning is a sanitary hazard caused by ingesting microbes, chemical substances, natural toxins, etc. contained in or attached to food, additives, equipment, containers and packaging, etc. Harm).
  • Escherichia coli is a Gram-negative bacilli belonging to the family Enterobacteriaceae included in the normal intestinal flora of humans, cell antigens (Group O: 01 to 0173) and flagellar antigens (H type: H1 to H56)
  • the serological type is determined by the combination.
  • E. coli those that cause intestinal infections such as diarrhea, acute gastroenteritis or colitis are called pathogenic E. coli.
  • Pathogenic Escherichia coli is roughly classified into four types: enteropathogenic E. coli, intestinal invasive Escherichia coli, enterotoxigenic Escherichia coli, and enterohemorrhagic E. coli.
  • Japan Public Health Association Indispensable for microbial testing Bacteria and fungal testing ⁇ According to the 3rd edition, proof of pathogenicity is required to determine pathogenic E. coli, but each pathogenic E. coli has a specific serotype. In many cases, a method for identifying the classification of pathogenic E. coli by using a diagnostic antiserum and determining the serotype in a serotype-specific test is used.
  • Group O and type H antisera are used for serotypes of pathogenic E. coli.
  • Group O antiserum can be applied to healthy rabbits or healthy pigs using the formalin killed Escherichia coli serotype reference strain as an immunogen.
  • An antiserum prepared by absorbing and removing serum-related reactions obtained by immunization is used.
  • As the type H antiserum an antiserum prepared by absorbing and removing a related reaction from serum obtained by immunizing a healthy rabbit with E. coli flagella as an immunogen is used.
  • the pathogenic E. coli group O serotype-specific slide agglutination method is performed as follows.
  • the cells isolated from the patient material and identified as E. coli are suspended and suspended in physiological saline, heated at 121 ° C for 15 minutes or 100 ° C for 60 minutes, centrifuged, and the supernatant discarded.
  • the precipitated bacteria are suspended in the physiological saline solution and used as the specimen.
  • the specimen and group O antiserum were mixed on a slide glass or a special plate, and at the same time the cells and physiological saline were mixed on the plate. Judge negative or positive.
  • E. coli actually obtained as a specimen may aggregate against a plurality of antisera, not necessarily those that react with a single antiserum. In that case, agglomeration that appeared relatively late or weak agglutination was judged negative, or agglutination value comparison by quantitative agglutination reaction method was judged, but this required labor and skill.
  • Non-patent document 1 Japan Public Health Association: Microbiological test indispensable Bacteria ⁇ Fungus test 3rd edition
  • Patent document 1 JP 2002-119297 A
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-284588
  • An object of the present invention is to provide a method for examining bacteria by an immunoagglutination method that does not require a control test operation, is simple, quick, accurate, and easy to determine. Means for solving the problem
  • This method is to visually determine the presence or absence of agglutination in comparison with the combined sample to determine negative or positive.However, a control test is always required, and it takes a lot of manpower and time to test a large number of samples. Then I have a problem.
  • the present inventors have conducted a conventional slide by grasping an agglutination (immunoaggregation) reaction caused by an antigen-antibody reaction between bacterial cells and an antibody as an optical change amount.
  • agglutination immunoaggregation
  • the control test that was absolutely necessary in the agglutination method, it was found that a large number of specimens can be examined more simply and quickly, and the method of the present invention was completed. That is, in the method of the present invention, when a bacterial cell (antigen) and an antibody are reacted, light having an arbitrary wavelength is irradiated, and a change in absorbance caused by aggregation of an antigen-antibody complex caused by an antigen-antibody reaction is measured.
  • this is an immunoagglutination measurement method for measuring the reactivity between bacterial cells (antigens) and antibodies.
  • the cells (antigen) are suspended in a physiological saline or buffer solution at a constant concentration, and then the antibody is placed in a cell made of, for example, plastic or glass.
  • a specific antigen-antibody reaction occurs, an antigen-antibody complex is formed and the cells aggregate, so light of an appropriate wavelength selected from the outside of the cell is irradiated with a wavelength of 200 to 900 wavelengths.
  • This is an immunoagglutination measurement method for measuring the reactivity between a cell (antigen) and an antibody in a cell by measuring the change in absorbance.
  • the method of the present invention is an arbitrary method selected from a wavelength of 200 to 900 nm from the outside of the cell after suspending bacterial cells (bacterial cell antigens) in physiological saline or buffer solution at a constant concentration. Absorbance is measured by irradiating light of a wavelength, and then the cells and antiserum are mixed in a plastic or glass cell and then reacted, and if a specific antigen-antibody reaction occurs, the antigen Since the antibody complex is formed and the cells aggregate, the light with an appropriate wavelength selected from the outside of the cell is irradiated with light of an appropriate wavelength of 200 to 900, and the change in absorbance is measured.
  • This is an immunoagglutination measurement method for measuring reactivity with an antibody.
  • An immunoagglutination measurement method comprising mixing bacterial cells and antibodies thereto in an aqueous solvent and optically measuring the aggregation of the cells due to the antigen-antibody reaction by irradiation with light.
  • [0025] Optically measure the aggregation of bacterial cells and antibody at the start of the reaction, further measure optically the aggregation after the start of the reaction, and measure the value after starting the reaction and the measured value at the start of the reaction.
  • FIG. 1 is a diagram showing the reaction of pathogenic E. coli 01 and each mixed serum (mixed 1 to 9) when pathogenic E. coli 01 is diluted and used for 1 period.
  • FIG. 2 shows the reaction of pathogenic E. coli 01 and plain antiserum when pathogenic E. coli 01 is diluted and used.
  • FIG. 3 shows the reaction of pathogenic E. coli Ol and mixed serum when pathogenic E. coli Ol is used without dilution.
  • FIG. 4 shows the reaction of pathogenic E. coli Ol and plain serum when pathogenic E. coli Ol is used without dilution.
  • the antiserum (antibody) used in the method of the present invention includes an antibody (hereinafter referred to as "specific antibody") that reacts with a bacterial cell (antigen) to be examined.
  • the specific antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Antibodies can be produced by known methods. For example, polyclonal antibodies can be prepared by immunizing rabbits, pigs, goats, and the like. A monoclonal antibody can be prepared by a known method such as the method of Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C, Nature, 256, 495-497, 1975). At this time, the bacterial cells to be examined may be used as an immunogen as they are. Purify antigens specific to bacterial cells and use them as immunogens.
  • the bacteria (antigens) that can be measured by the method of the present invention are not limited in any way, and any bacteria that can produce antibodies corresponding thereto can be measured by the method of the present invention. Examples include, but are not limited to, pathogens such as pathogenic E. coli that cause enteric infections and vibrio parahaemolyticus causing acute gastroenteritis.
  • the specimen is a fixed concentration of the bacterial cells (bacterial cell antigens) separated and cultured from the patient's diarrheal stool, the patient's vomit, and food and drink in a physiological saline or buffer solution. Used in a suspended state.
  • the bacterial cell antigen can be used in a live bacterial state.
  • the bacterial cell is heated, such as formalin alcohol. You may pre-process with a chemical
  • the concentration of the antigen solution containing the bacterial cells is adjusted to an optically measurable range and a specific antibody is added, for example, 5 to 100 / zL is taken in the cell, and buffer solution 50 to 500 is added.
  • Mix with L irradiate with light of any wavelength selected from 200-900 wavelength from outside of cell, and measure absorbance and absorbance change.
  • the arbitrary wavelength may be any wavelength as long as it can capture the aggregation reaction of the antigen-antibody complex caused by the antigen-antibody reaction of the cell (antigen). You can also measure at a single wavelength, or measure at two wavelengths, the primary and secondary wavelengths, and measure the difference between the primary and secondary wavelengths.
  • the conventional slide agglutination method has a tendency to self-aggregate non-specifically over time, so it was necessary to provide a control test in which a buffer solution or the like was added instead of serum.
  • the method of the present invention confirms the degree of self-aggregation prior to the antigen-antibody reaction, it is not necessary to provide a control test.
  • the degree of aggregation based on the antigen-antibody reaction between the bacterial cell antigen and the antibody is optically measured and compared, there is no need to provide a control test.
  • E. coli actually obtained as a specimen must be
  • agglutination occurs for a plurality of antisera, not just those that react to a single antiserum.
  • agglutination appearing relatively late or weak agglutination is judged as negative, or agglutination value comparison by the quantitative agglutination reaction method is judged, but this requires labor and skill.
  • the method of the present invention optically measures the aggregation of an antigen-antibody reaction by bacterial cells and a plurality of antibodies, compares and calculates a plurality of measured values, and determines the degree of aggregation based on the calculated values.
  • Optical aggregation of antigen-antibody reaction caused by bacterial cells and multiple antibodies means that the bacterial cells in a specimen react with multiple antisera and the aggregation is optically measured. is there. In the conventional slide agglutination method, the reaction with a plurality of antisera was observed and the agglutination was observed.
  • Comparing and calculating a plurality of measured values obtained, and determining the degree of aggregation based on the calculated values includes calculating a maximum value of the plurality of measured values obtained, and calculating the difference between the obtained measured values. This includes the calculation to determine the degree of aggregation based on the calculation. For example, if the maximum value is determined to be positive, the measurement value is divided into significant groups.If the measurement value is divided into significant groups, the group with the large measurement value is determined to be positive. If it is divided into groups with significant difference, the measurement value is large! /, If the number of groups is large, if the number of groups is too high, the judgment is suspended, the measurement value is not divided into groups with significant difference, In some cases, there are methods such as making all negative. These determination methods can be appropriately selected and applied in consideration of the characteristics of the sample and immune serum.
  • Immunoagglutination measurement can be performed by mixing a specimen (suspension of bacterial cells), a buffer solution, and antiserum in a cell and optically measuring aggregation due to antigen-antibody reaction.
  • a sample 5 to 100 L, a buffer solution 50 to 500 / ⁇ L, and immune serum may be mixed 5 to 100 / z L.
  • Optical For example, when antiserum and specimen are mixed in a plastic or glass cell, the cells with the antigenic substance to be detected aggregate due to the antigen-antibody reaction with the specific antibody.
  • the serotype of the bacterium can be determined by measuring the change in absorbance by irradiating light of an appropriate wavelength selected from wavelengths of 200 to 900 nm from the outside, and measuring the degree of aggregation.
  • the agglutination reaction may be performed in a physiological saline solution or an appropriate buffer solution having an arbitrary pH, such as a phosphate buffer solution, a Good buffer solution, a Tris buffer solution, or a borate buffer solution.
  • an appropriate surfactant such as TritonX-100, Tween20, or Tween80 may be added to suppress nonspecific binding between the specific antibody and the bacterial cell.
  • the change in absorbance can be measured, for example, by measuring the change in absorbance for 600 seconds from the start of the antigen-antibody reaction.
  • the measurement time is not limited to this, and it can be measured by determining the absorbance and the change in absorbance at an arbitrary time after the start of the reaction.
  • a physiological saline or buffer solution can be mixed with the sample in the cell, the absorbance can be measured, and the presence or absence of self-aggregation can be confirmed, which can be used as an index for preventing erroneous determination of positive.
  • Measurement values obtained in time units can be analyzed by a favorite analysis method according to the purpose and measurement values such as rate analysis method and end analysis method, and antigen-antibody reaction can be determined.
  • a certain threshold value is set for the absorbance value, and an absorbance measurement value after a certain time is determined above or below the threshold value.
  • an absorbance measurement value after a certain time is determined above or below the threshold value.
  • an automatic analyzer for biochemical examinations widely used for biochemical examinations in medical examination facilities can be preferably used.
  • an automatic analyzer for biochemical examinations widely used for biochemical examinations in medical examination facilities can be preferably used.
  • Toshiba's TBA-120FR and TBA-200FR analyzers Mitsubishi Chemical's LPIA-S 500 latex agglutination fully automatic measuring instrument, Roche Diagnostics Systems' COBA S FARA instrument and COBAS MIRA instrument, And Hitachi 7070 analyzer, etc. Can be done.
  • Tests were performed using pathogenic E. coli group O immune serum.
  • the immune sera were prepared to have the same structure as the group O sera (set No. 1) of the pathogenic Escherichia coli immune sera “Seiken” manufactured by Denka Seiken (Table 1).
  • Mixed sera 1 to 9 contain antibodies that react with serotype antigens listed on the right, and simple serum contains antibodies that react with each serotype antigen.
  • simple serum contains antibodies that react with each serotype antigen.
  • an agglutination reaction occurs when the sample sample is reacted with the mixed serum, it can be presumed that the sample sample contains an antigen that reacts with any of the simple serum components of the mixed serum.
  • an agglutination reaction is caused by reacting a specimen sample with plain serum, it can be estimated that the specimen sample contains an antigen that reacts with the plain serum.
  • Pathogenic E. coli group O immune serum was prepared by the following procedure.
  • Simple serum is obtained by heat-treating serum obtained from immunization of a healthy rabbit with the serotype of formalin killed by the simple serum as an immunogen, and then removing the related agglutinin by absorbing it for 30 minutes at 56 ° C. After that, the titer was adjusted by diluting with a phosphate buffer.
  • the conventional method for determining the serological type of E. coli by the pathogenic E. coli immune serum "Seken” is the slide agglutination method, and the details of the operation method are described in the package insert, but the outline is as follows. It is.
  • the test is performed in the same manner (for example, when it is determined that the mixed serum 1 is positive, using the simple serums 01, 026, 086a, 0111, 0119, 0127a, and 0128).
  • Example 1 an autoanalyzer for biochemical examination is used to optically measure the agglutination reaction between bacterial cells and serum, and the measured value at the start of the reaction is calculated from the measured value after the start of the reaction. The difference was calculated, and it was tested whether the degree of aggregation could be determined based on the calculated value.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in absorbance due to the reaction between the specimen (Ol) and various mixed immune sera according to the method of the present invention.
  • the absorbance is also measured between -60 seconds and 0 seconds until physiological saline is added to the specimen and the anti-serum is collected.
  • the absorbance increases, self-aggregation of the sample may be considered, so that it can be used as an index for not erroneously determining positive.
  • the absorbance does not increase, and it is considered that self-aggregation has not occurred.
  • the concentration of the bacteria is substantially diluted because the total liquid volume is increased by mixing the mixed serum, and the absorbance once decreases. Thereafter, the pathogenic E. coli Ol shows a significant increase in absorbance among the sera of Mixes 1-9, and shows little change in absorbance with other sera. Serum antigen-antibody reaction was captured as an optical change.
  • the physiological saline reaction is similar to the negative reaction between positive serum, negative serum, and physiological saline with no change in absorbance. Since the difference in the measured values was clear, it became clear that no physiological saline was required as a control test.
  • the test was performed using pathogenic E. coli o group immune serum.
  • an automatic analyzer for biochemical examination is used to optically measure a plurality of aggregations caused by antigen-antibody reaction between bacterial cells and a plurality of antibodies, and a plurality of measured values obtained are obtained. Calculate by comparison and based on the calculated value! A test was conducted to determine whether the degree of aggregation could be determined.
  • the immune serum was prepared to have the same composition as the group O serum (set No. 1) of the pathogenic Escherichia coli immune serum “Seiken” manufactured by Denka Seken.
  • Pathogenic E. coli group O immune serum was prepared by the following procedure.
  • Serum obtained by immunization of healthy pigs with the serotype of formalin that constitutes the mixed serum as an immunogen is heat-treated at 56 ° C for 30 minutes, and the agglutinin is absorbed and removed by aseptic filtration. After that, the titer was adjusted by diluting with a phosphate buffer.
  • Simple serum is obtained by heat-treating serum obtained from immunization of a healthy rabbit with a serotype of formalin killed by the simple serum as an immunogen, followed by heat treatment at 56 ° C for 30 minutes, and then absorbing and removing the related agglutinin After that, the titer was adjusted by diluting with a phosphate buffer.
  • Measurement Measurement (automatic analysis) was performed as follows using an automated analyzer for biochemical testing, Hitachi 7070 (manufactured by Hitachi). 200 L of mixed immune serum was added to 50 L of the sample, and immediately after the start of the reaction (after addition of the mixed immune serum) (0 seconds), the force was set to measure the absorbance at about 650 seconds in time series at a wavelength of 750 seconds. The results are shown in Figure 3.
  • FIG. 3 shows a comparison of the change in absorbance due to the reaction between the sample (Ol) and various mixed immune sera according to the method of the present invention.
  • the absorbance of Mix 1 is higher than that of other mixed immune sera, and can be determined as positive.
  • the absorbance of Ol is higher than that of other plain serum, and it can be determined as positive.
  • Example 1 The same immune serum as in Example 1 was used.
  • E. coli 50 strains whose serotype was previously identified were used. The breakdown of the strain is as follows.
  • the same sample as the method of the present invention is used as the sample, and the determination method is Denka Seiken Co., Ltd., pathogenic colon bacilli immune serum ⁇ Seken '' mixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Judging by using as street.
  • the mixing amount is the same as in the slide aggregation method described above.
  • Tables 2 to 10 show the results of the comparative tests.
  • the conventional method is a slide aggregation method.
  • Example 1 The same immune serum as in Example 1 was used.
  • a specimen of a mutant strain of E. coli O103 was prepared in the same manner as in Example 1.
  • This mutant strain is a strain that is judged to be O103 in plain serum and is a strain that shows agglutination with multiple mixed sera in mixed serum.
  • the same sample as the method of the present invention is used as the sample, and the determination method is Denka Seiken Co., Ltd., pathogenic colon bacilli immune serum ⁇ Seken '' mixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 7 used in the street.
  • Table 11 shows the measurement results of the method of the present invention
  • Table 12 shows the results of a comparative test (slide aggregation method).
  • the values shown in the table are AABS values.
  • the unit was mAbs.
  • the measured values of Mix 4 and Mix 9 are particularly high.
  • the measured value in Mix 9 was determined to be strongly positive, with a higher measured value compared to other sera.
  • E. coli group O since it takes time and cost to react all 50 kinds of simple sera, it is first classified into mixed sera composed of multiple simple sera. Identify serotypes with plain serum. As shown in Table 2 and Table 3, in the conventional slide agglutination method, the judgment is made based on the aggregated image. The serotype cannot be identified without reacting with all the sera. However, since the aggregation is optically measured in the method of the present invention, it is difficult to determine by the conventional slide agglutination method depending on the numerical value, and the specimen can also be easily determined.
  • the method of the present invention was compared with the conventional slide agglutination method for omitting the centrifugation-refloating operation after the heat treatment during sample preparation.
  • Example 1 The same immune serum as in Example 1 was used.
  • Pathogenic Escherichia coli o 1 (reacted only with the mixed 1 serum), which was identified as Ol by commercially available pathogenic E. coli immune serum "Seken", was cultured overnight at 37 ° C in agar medium under aerobic conditions. . Next The obtained viable bacteria were suspended in physiological saline, and then the suspension was heated at 121 ° C for 30 minutes and used as a sample as it was.
  • the same sample as the method of the present invention is used as the sample, and the determination method is Denka Seiken Co., Ltd., pathogenic colon bacilli immune serum ⁇ Seken '' mixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 7 used in the street.
  • Table 13 shows the measurement results of the present invention, and Table 14 shows the results of the comparative test (slide aggregation method).
  • the values shown in Table 13 are AABS values.
  • the unit was mAbs.
  • the method of the present invention can optically measure aggregation, it is simpler, more accurate and easier than the comparative example. Since it is easy to judge, it is an excellent method.

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Abstract

　簡便で迅速な血清型別の検査方法の提供。 　細菌の菌体と抗体を水溶媒中で混ぜて抗原抗体反応による菌体の凝集を光を照射して光学的に測定することを含む免疫凝集測定法。

Description

明 細 書
細菌の免疫凝集測定法
技術分野
[0001] 本発明は、免疫凝集法による細菌の検査方法に関する。
背景技術
[0002] 食中毒は、食品、添加物、器具、又は容器包装等に含まれた、又は付着した微生 物、化学物質、自然毒等を摂取することによって起きる衛生上の危害 (飲食に起因す る危害）とされる。
[0003] 細菌が病因物質である食中毒の場合は、患者便、吐物、原因食品から病原体を分 離し、分離菌について生化学的性状、血清型別を調べるとともに毒素産生性などの 試験を実施し菌を特定して ヽる。
[0004] 最近の検査技術の進歩により、病因物質の判明率が向上し病原大腸菌、腸炎ビブ リオ、サルモネラ菌、ブドウ球菌等の細菌による件数が圧倒的に多いことがわ力つて きており、食中毒対策のいっそうの強化を図る必要があるとされている。
[0005] 例えば、大腸菌は、人の腸管内正常細菌叢に含まれる腸内細菌科に属するグラム 陰性桿菌で菌体抗原 (O群： 01〜0173)及び鞭毛抗原 (H型： H1〜H56)の組み合 わせによって血清学的型 (血清型）が決められる。
[0006] 大腸菌のうち下痢、急性胃腸炎又は大腸炎等の腸管感染症の原因菌となるものは 病原大腸菌と呼ばれている。病原大腸菌は、その病原性機構の違いによって腸管病 原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌の 4つ に大きく分類されている。（財）日本公衆衛生協会:微生物検査必携 細菌 ·真菌検 查 第 3版によれば、病原大腸菌の確定には病原性の証明が必要であるが、それぞ れの病原大腸菌は特定の血清型を示す場合が多いことから、診断用抗血清を使用 して血清型別試験で血清型を判定することにより病原大腸菌の分類を同定する方法 が用いられている。
[0007] 病原大腸菌の血清型別には O群及び H型の抗血清が用いられる。 O群抗血清は、 大腸菌血清型参照株のホルマリン死菌を免疫原として健康ゥサギ、又は健康ブタに 免疫して得た血清力 類縁反応を吸収除去して調製された抗血清が使用される。ま た、 H型抗血清は、大腸菌鞭毛を免疫原として健康ゥサギに免疫して得た血清から 類縁反応を吸収除去して調製された抗血清が使用される。
[0008] これらの病原大腸菌免疫血清は、スライド凝集法 (O群： 50種類)、試験管凝集法（ H型 : 22種類)用検査試薬として販売 (デン力生研株式会社)されている。また、ラテツ タス粒子を用いた凝集法による大腸菌の検出方法についても報告されている（特許 文献 1および 2を参照)。
[0009] 例えば、病原大腸菌 O群血清型別スライド凝集法は以下のように行う。
[0010] 患者材料から分離され大腸菌と同定された菌体を生理食塩液に懸濁浮遊し 121°C 、 15分間又は 100°C、 60分間加熱した後、遠心分離し、上清を捨て、沈殿した菌を生 理食塩液に懸濁浮遊し検体とする。検体と O群抗血清をスライドグラスや専用の平板 上で混ぜ合わせ、同時に菌体と生理食塩液を平板上で混ぜ合わせたものを対照とし て、対比して凝集の有無を目視により観察して陰性、陽性を判定する。
[0011] このように、スライド凝集法は、検体と多くの種類の O群抗血清とを一つ一つ試験操 作を行わなければならず、また、同時に菌体と生理食塩液を混ぜ合わせたものを対 照として同様に操作を行わなければならず、操作が煩雑で多数検体を同時に検査 するには多くの人手と時間を要するという問題を有している。
[0012] また、実際に検体として得られる大腸菌は必ずしも単一の抗血清に反応するものだ けではなぐ複数の抗血清に対して凝集する場合もある。その場合は比較的遅れて 出現する凝集や微弱な凝集を陰性と判定したり、定量凝集反応法による凝集価比較 で判定するが、それには手間と習熟を要した。
非特許文献 1 : (財）日本公衆衛生協会:微生物検査必携 細菌 ·真菌検査 第 3版 特許文献 1：特開 2002-119297号公報
特許文献 2：特開 2003-284588号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明の課題は、対照試験操作を必要とせず、簡便で迅速、正確且つ判定しやす い免疫凝集法による細菌の検査方法を提供することである。 課題を解決するための手段
[0014] 従来法においては、患者便、吐物、原因食品から病原体を分離し、分離菌につい て生化学的性状、血清型別を調べるとともに毒素産生性などの試験を実施し菌を特 定していた。生化学的性状や毒素産生性等の試験は時間もコストも力かっていた。ま た、血清型別は、分離した菌体と血清型別用の抗血清 (抗体液)をスライドグラスなど の平板上で混ぜ合わせ、同時に対照試験として菌体と生理食塩液を平板上で混ぜ 合わせたものとを対比して凝集の有無を目視により観察して陰性、陽性を判定する 方法であるが、対照試験が必ず必要であり、多数検体を検査するには多くの人手と 時間を要すると 、う問題を有して 、る。
[0015] 抗ベロ毒素抗体感作ラテックス粒子と大腸菌の凝集反応をラテックス凝集全自動測 定器で測定するアイディア自体はあったが（特開 2003-284588公報）、この方法では 細菌の血清型を判別することは不可能である。また、細菌の血清型を判別するため の方法として、各血清型別の抗体を準備し、それら抗体を感作したラテックス粒子を 用い、大腸菌との凝集反応をラテックス凝集全自動測定器で測定する方法も考えら れる。しかし、血清型は細菌の種類にもよる力 例えば大腸菌では O群に 173血清型 、 H群に 56血清型存在し、全ての型に対して感作ラテックスを準備するのは多くの手 間を必要とする。
[0016] 従来の血清型別用の抗血清を用いる方法においては、患者材料から分離された菌 体を凝集素として用いていた。しかし、病原細菌は種々の形をしており、大きさもまち まちで、菌体を生理食塩液に浮遊させたとき菌体同士の自己凝集も起こり易い性質 があるため、対照試験の菌体と生理食塩液を平板上で混ぜ合わせた場合にぉ ヽて さえ凝集が観察される。そのため、陰性、陽性の判定には格段の注意が要求されて いた。
[0017] このような背景のもとで、より簡便、迅速な測定方法が求められていた。
[0018] 本発明者らは、鋭意研究の結果、菌体と抗体が抗原抗体反応することにより生ずる 凝集 (免疫凝集)反応を光学的な変化量として捉えることにより、従来力 実施されて いるスライド凝集法では絶対に必要であった対照試験を省き、より簡便 ·迅速に多数 検体を検査することができることを見出し、本発明法を完成させた。 [0019] すなわち本発明の方法は、菌体 (抗原)と抗体を反応させた際に任意の波長の光を 照射し、抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体の凝集によって起こる吸光度 変化を測定することにより、菌体 (抗原)と抗体との反応性を測定する免疫凝集測定 方法である。
[0020] より具体的には本発明の方法は、菌体 (抗原)を生理食塩液又は、緩衝液中に一 定濃度に懸濁させた後、抗体を例えばプラスチックやガラス製のセル内で混合し反 応させると、特異的な抗原抗体反応が起こった場合は抗原抗体複合体が生じ菌体は 凝集するのでセル外部より 200〜900應の波長力 選ばれる適当な波長の光を照射 し、その吸光度変化を測定することにより、セル中の菌体 (抗原）と抗体との反応性を 測定する免疫凝集測定方法である。
[0021] また、本発明の方法は、菌体 (菌体抗原)を生理食塩液又は、緩衝液中に一定濃 度に懸濁させた後にセル外部より 200〜900nmの波長から選ばれる任意の波長の光 を照射して吸光度を測定し、その後に菌体と抗血清を例えばプラスチックやガラス製 のセル内で混合した後、反応させると、特異的な抗原抗体反応が起こった場合は抗 原抗体複合体が生じ菌体は凝集するのでセル外部より 200〜900應の波長力 選ば れる適当な波長の光を照射し、その吸光度変化を測定することにより、セル中の菌体 (抗原)と抗体との反応性を測定する免疫凝集測定方法である。
[0022] すなわち、スライド凝集法では必要であった対照試験が省け、簡便'迅速に多数の 検体を検査することができる免疫凝集測定方法を提供する。
[0023] 本発明の態様は、以下の通りである。
[0024] [1] 細菌の菌体とそれに対する抗体を水溶媒中で混ぜて抗原抗体反応による菌体 の凝集を光を照射して光学的に測定することを含む免疫凝集測定法。
[0025] [2] 細菌菌体と抗体の反応開始時の凝集を光学的に測定し、さらに反応開始後の 凝集を光学的に測定し、反応開始後の測定値と反応開始時の測定値の差を計算し 、該計算値に基づいて凝集の程度を判定する、対照試験を必要としない、 [1]の免疫 凝集測定法。
[0026] [3] 細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応による複数の凝集を光学的に測定 し、得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定す る [1]の免疫凝集測定法。
[0027] [4] 照射する光の波長が 200〜900nmである [1]〜[3]のいずれかの方法。
[0028] [5] 生化学検査用自動分析装置を用いる [1]〜[4]のいずれかの方法。
[0029] [6] 細菌が病原大腸菌である [1]〜[5]のいずれかの方法。
発明の効果
[0030] 従来法においては、凝集の程度を目視により判断しており、測定に習熟を要してお り、必ずしも正確に測定できな力つた。本発明により、対照試験の操作が必要なぐ従 来法よりも簡便、迅速、正確且つ判定しやすい検査を可能とする免疫凝集測定方法 が確立された。
[0031] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-348033号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0032] [図 1]病原大腸菌 01を希釈して用 1ヽた場合の病原大腸菌 01と各混合血清 (混合 1 〜9)の反応を示す図である。
[図 2]病原大腸菌 01を希釈して用 、た場合の病原大腸菌 01と単味抗血清の反応を 示す図である。
[図 3]病原大腸菌 Olを希釈せずに用いた場合の病原大腸菌 Olと混合血清の反応 を示す図である。
[図 4]病原大腸菌 Olを希釈せずに用いた場合の病原大腸菌 Olと単味血清の反応 を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0033] 本発明の方法において用いられる抗血清 (抗体）は、検査しょうとする菌体 (抗原）と 抗原抗体反応する抗体 (以下、「特異抗体」と呼ぶ)を含むものである。ここで、特異 抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体は公 知の方法で作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体はゥサギ、ブタ、ャギ 等を免疫することにより作製し得る。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスティンの 方法（Kohler, G. and Milstein, C, Nature, 256, 495-497, 1975)等の公知の方法に より作製し得る。この際、検査しょうとする菌体をそのまま免疫原として用いてもよいし 、菌体に特異的な抗原を精製し免疫原として用いてもょ ヽ。
[0034] 本発明の方法により測定することができる細菌 (抗原）は何ら限定されるものではな ぐそれに対応する抗体を作製することができるあらゆる細菌が本発明の方法により 測定可能である。例えば、腸管感染症の原因菌となる病原大腸菌、急性胃腸炎を起 こす腸炎ビブリオのような病原体等を挙げることができるがこれらに限定されるもので はない。
[0035] また、検体 (菌体の懸濁液）は、患者の下痢便、患者の吐物、飲食物から分離培養 した菌体 (菌体抗原)を生理食塩液又は緩衝液中に一定濃度に懸濁させた状態で 用いられる。
[0036] この際、菌体抗原は生菌の状態で使用することができる。また、菌体抗原と特異抗 体との抗原抗体反応をより効率よく反応させる目的、またはバイオハザードの安全性 の面から菌体を不活化する目的で、菌体を加熱、ホルマリン 'アルコール等の薬剤、 及び酵素などにより予め処理してもよい。
[0037] この菌体を含む抗原液を光学的に測定可能な範囲に濃度を調節して特異抗体を 加えた後、これをセル内に例えば 5〜100 /z L取り、緩衝液 50〜500 Lと混合し、セ ル外部より 200〜900應の波長から選ばれる任意の波長の光を照射して吸光度及び 吸光度変化を測定する。この方法により、抗原抗体反応が開始する前の抗原抗体反 応に基づ力ない自己凝集の影響を予め把握することが出来る。任意の波長とは、菌 体 (抗原)の抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体の凝集反応を捉えることが できる最適な波長であれば、いずれの波長でも構わない。また、単一の波長で測定 してもよいし、主波長と副波長の 2波長で測定して、主波長と副波長の差を測定して ちょい。
[0038] 従来のスライド凝集法においては、経時的に非特異的に自己凝集する傾向がある ため、血清の代わりに緩衝液等を添加した対照試験を設ける必要があった。しかしな がら、本発明の方法は、自己凝集の程度を抗原抗体反応に先立って確認するので 対照試験を設ける必要がない。また、菌体抗原と抗体の抗原抗体反応に基づく凝集 の程度を光学的に測定し比較するため、対照試験を設ける必要がない。
[0039] また、従来のスライド凝集法にぉ 、ては、実際に検体として得られる大腸菌は必ず しも単一の抗血清に反応するものだけではなぐ複数の抗血清に対して凝集する場 合もある。その場合は比較的遅れて出現する凝集や微弱な凝集を陰性と判定したり 、定量凝集反応法による凝集価比較で判定するが、それには手間と習熟を要した。 しかしながら、本発明の方法は、細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応の凝集 を光学的に測定し、得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づいて凝集 の程度を判定するため、対照試験を設ける必要がない。ここで言う、細菌菌体と複数 の抗体による抗原抗体反応の凝集を光学的に測定するとは、検体中の細菌菌体を 複数の抗血清に反応させてその凝集を光学的に測定することである。従来のスライド 凝集法においても複数の抗血清と反応させてその凝集を観察していたが、それは対 照試験との比較観察を必要とし、また、目視によってのみ行っていただけであり、抗 血清間の反応の違いを厳密に観察することは無力つた。従来の方法は手技操作と目 視による観察で行われるため、同時に行える試験数も限られていた。従って、抗血清 間の反応の違いを観察することは実質的に不可能であった。本発明の方法では、自 動分析装置を用いて検体中の細菌菌体を複数の抗血清に反応させてその凝集を光 学的に測定し、その測定結果を比較することで対照試験を設けなくてもどの抗血清 に対して陽性反応を示したかを判定することができる。得られた複数の測定値を比較 計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定するとは、得られた複数の測定値の 最大値を求める計算や、得られた複数の測定値の差を求め有意差のあるグループ に分けるための計算を含み、その計算に基づいて凝集の程度を判定することを言う。 判定の方法として例えば、最大値となったものは陽性と判定する方法、測定値が有 意差のあるグループに分けられた場合はその測定値の大きいグループを陽性と判定 する方法、測定値が有意差のあるグループに分けられた場合にぉ ヽてその測定値 の大き!/、グループの員数が多 、場合は判定を保留する方法、測定値が有意差のあ るグループに分けられな 、場合は全て陰性とする方法などがある。これらの判定方法 は試料と免疫血清の特性を考慮し、適宜選択して適用することが可能である。
免疫凝集測定は、検体 (菌体の懸濁液)、緩衝液、抗血清をセル内で混ぜ、抗原抗 体反応による凝集を光学的に測定することにより行うことができる。例えば、検体 5〜1 00 L、緩衝液 50〜500 /ζ Lおよび免疫血清を 5〜100 /z L混合すればよい。光学的 な測定は、例えば、プラスチックやガラス製のセル内で抗血清と検体を混合すると、 検出しょうとする菌体抗原物質を持つ菌体は、特異抗体と抗原抗体反応により凝集 するので、このときセル外部より 200〜900nmの波長から選ばれる適当な波長の光を 照射して吸光度変化を測定し、凝集の程度を測定することにより菌の血清型別を行う ことができる。凝集反応は、生理食塩液、任意の pHの適当な緩衝液、例えば、リン酸 緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の溶液中で行わせればよい。 この際、特異抗体と菌体との非特異的結合を抑制するために、 TritonX-100, Tween2 0、 Tween80等の適当な界面活性剤を添カ卩してもょ 、。
[0041] 吸光度変化は、例えば、抗原抗体反応開始から 600秒間の吸光度の変化を測定す ることにより測定することができる。もっとも、測定時間はこれに限定されるものではな ぐ反応開始後から任意の時間における吸光度及び吸光度の変化を求めることによ り測定することができる。また、検体に対して生理食塩水や緩衝液をセル内で混ぜ、 吸光度を測定し、自己凝集の有無を確認することで、誤って陽性と判定しないための 指標として用いることができる。
[0042] 時間単位で得られた測定値は例えばレート分析法やエンド分析法など、その目的 や測定値によって好みの分析方法で分析して、抗原抗体反応を判定することが出来 る。
[0043] 陽性、陰性の判定方法としては、吸光度の値に対して一定の閾値を設け、一定時 間後の吸光度測定値がその閾値より上か下かで判定する方法や、 1つの検体に対し て複数の免疫血清に対する反応を見る場合はこれら試験工程を同期して行い、各試 験より得られる吸光度の測定値の差を求め、予め設定した値以上に乖離したことをも つて判定する方法などが挙げられる。後者の方法においては、測定値乖離をもって 試験終了とすることができるため試験時間を短縮、短時間で判定することができる。
[0044] これらの測定工程を連続して行う機器としては、医療関係の検査施設で生化学検 查に広く使用されている生化学検査用自動分析装置が好ましく用いることができる。 例えば、東芝社の TBA- 120FR及び TBA-200FR分析装置等、三菱化学社の LPIA-S 500ラテックス凝集全自動測定器、ロシュ ·ダイァグノスティック ·システムズ社の COBA S FARA装置及び COBAS MIRA装置、及び日立製作所の日立 7070分析装置等を用 いて行うことができる。
実施例
[0045] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記 実施例に限定されるものではな 、。
[0046] [実施例 1]
病原大腸菌 O群免疫血清を用い試験を行った。
[0047] 免疫血清の調製
免疫血清は、デンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」の O群血清（1号セッ ト)と同じ構成となるよう準備した (表 1)。
[表 1]
Figure imgf000010_0001
[0048] 混合血清 9種、および単味血清 50種を作成した。
[0049] 混合血清 1から 9は、その右に列記される血清型の抗原に反応する抗体を含み、単 味血清はそれぞれの血清型の抗原に反応する抗体を含む。検体試料と混合血清を 反応させ凝集反応を生じた場合、当該検体試料中に当該混合血清の構成単味血清 いずれかと反応する抗原が含まれていると推定することができる。また、検体試料と 単味血清を反応させ凝集反応を生じた場合、当該検体試料中に当該単味血清と反 応する抗原が含まれて 、ると推定することができる。
[0050] 病原大腸菌 O群免疫血清を以下の手順で調製した。
[0051] 混合血清および単味血清!/、ずれも大腸菌血清型参照株のホルマリン死菌を免疫 原とした。 [0052] 混合血清は当該混合血清を構成する血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康 ブタに免疫して得た血清を 56°C30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し 無菌ろ過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。
[0053] 単味血清は当該単味血清の血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康ゥサギに 免疫して得た血清を 56°C30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し無菌ろ 過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。
[0054] 従来の病原大腸菌免疫血清「生研」による大腸菌の血清学的型別の判定方法はス ライド凝集法であり、その操作方法の詳細は添付文書に記載があるが、概略は以下 の通りである。
[0055] (1)検体となる大腸菌を寒天培地で好気的条件下、 37°Cで一夜（18〜24時間)培養 する。
[0056] (2)マッチ棒の頭 3〜5倍程度の菌体を搔き取り、 3mLの生理食塩水に浮遊した後、
121°C、 15分間、又は 100°C、 60分間加熱処理をする。
[0057] (3) 900 X g、 20分間遠心分離し、上清を捨て、沈渣に 0.5mLの生理食塩水を加え均 一に浮遊して抗原液とする。
[0058] (4)ガラス鉛筆でスライドグラスを数区画に分け、区画毎に各混合血清 1〜9と対照と して生理食塩水を滴下する。
[0059] (5)抗原液の 1白金耳を各混合血清 30 L又は生理食塩水 30 Lとよく混和する。
[0060] (6)スライドを前後に傾斜させながら凝集の有無を観察する。
[0061] (7)混合血清で陽性と判定された場合、その混合血清を構成する単味血清を用いて
(例えば混合血清 1に陽性と判定された場合、 01、 026、 086a、 0111、 0119、 0127 a、 0128の各単味血清を用いて）同様に試験する。
[0062] 実施例 1においては生化学検査用自動分析装置を用いて、菌体と血清との凝集反 応を光学的に測定し、反応開始後の測定値から、反応開始時の測定値の差を計算 し、該計算値に基づ 、て凝集の程度を判定できるか試験した。
[0063] 検体の調製
市販の病原性大腸菌免疫血清「生研」で血清型が Olと同定された病原大腸菌 Ol (混合 1の血清のみと反応)をスライド凝集法と同様に検体を調製した。 [0064] 測定
生化学検査用自動分析装置日立 7070 (日立社製)を用いて次のように測定（自動 分析法)を行った。検体 50 μ Lに対し生理食塩水 80 μ Lを加えその後に混合免疫血 清 120 Lを加え、反応開始 (混合免疫血清添加後）前 (-60秒)から約 650秒後にお ける吸光度を時系列に波長 750nmで測定する設定とした。結果を図 1に示す。図 1は 、本発明法での検体 (Ol)と各種混合免疫血清との反応による吸光度変化を示し、 比較した図である。
[0065] 図 1に示すように、検体に生理食塩水加えて力 抗血清をカ卩えるまでの- 60秒〜 0 秒の間においても吸光度を測定する。ここで吸光度が上昇する場合はサンプルの自 己凝集が考えられるので、誤って陽性と判定しないための指標として用いることがで きる。本試験結果においては吸光度は上昇しておらず、自己凝集は起こしていない と考えられる。
[0066] また、混合免疫血清添加後の 0秒以降にぉ ヽては、混合血清をカ卩えることで全体の 液量が増えることから菌濃度が実質希釈され、一旦、吸光度が低下する。その後、病 原大腸菌 Olは混合 1〜9の血清の中で混合 1に対して著 、吸光度の上昇を示し、 また他の血清に対しては殆ど吸光度の変化を示さないことから、菌体と血清の抗原 抗体反応を光学的な変化量として捉えることができた。
[0067] また、陰性の血清と対照である生理食塩水を比較した場合、生理食塩水の反応は 陰性反応と同様に吸光度に変化がなぐ陽性の血清と陰性の血清及び生理食塩水 との間の測定値の差が明確であることから、対照試験として生理食塩水を特に必要と しないことも明ら力となった。
[0068] 次に混合 1に対して陽性であったことから混合 1を構成する単味血清 01、 026、 08 6a、 0111、 0119、 0127a、 0128の各単味血清を用いて同様に試験した。結果を図 2 に示す。図 2も図 1と同様に検体に生理食塩水加えてから抗血清を加えるまでの- 60 秒〜 0秒の間においては吸光度は上昇しておらず、自己凝集は起こしていないと考 えられる。
[0069] また、血清添加後の 0秒以降にぉ 、ては、混合血清をカ卩えることで全体の液量が増 えることから菌濃度が実質希釈され、一旦、吸光度が低下した後、病原大腸菌 Olは 各単味血清の中で Olに対して著 、吸光度の上昇を示し、また他の血清に対して は殆ど吸光度の変化を示さな 、ことから、菌体と血清の抗原抗体反応を光学的な変 化量として捉えることにより大腸菌の血清学的型別の判定ができることが明ら力となつ た。
[0070] また、陰性の血清と対照である生理食塩水を比較した場合、生理食塩水の反応は 陰性反応と同様に吸光度に変化がなぐ陽性の血清と陰性の血清及び生理食塩水 との間の測定値の差が明確であることから、対照試験として生理食塩水を特に必要と しないことも明ら力となった。
[0071] [実施例 2]
病原大腸菌 o群免疫血清を用い試験を行った。
[0072] 本実施例においては生化学検査用自動分析装置を用いて、細菌菌体と複数の抗 体による抗原抗体反応による複数の凝集を光学的に測定し、得られた複数の測定値 を比較計算し、該計算値に基づ！、て凝集の程度を判定できるか試験を行った。
[0073] 免疫血清の調製
免疫血清は、デンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」の O群血清（1号セッ ト）と同じ構成となるよう準備した。
[0074] 病原大腸菌 O群免疫血清を以下の手順で調製した。
[0075] 混合血清および単味血清!/、ずれも大腸菌血清型参照株のホルマリン死菌を免疫 原とした。
[0076] 混合血清は当該混合血清を構成する血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康 ブタに免疫して得た血清を 56°C30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し 無菌ろ過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。
[0077] 単味血清は当該単味血清の血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康ゥサギに 免疫して得た血清を 56°C30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し無菌ろ 過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。
[0078] 検体の調製
実施例 1と同様の方法にて行った。
[0079] 測定 生化学検査用自動分析装置日立 7070 (日立社製)を用いて次のように測定（自動 分析法)を行った。検体 50 Lに対し混合免疫血清 200 Lを加え、反応開始 (混合 免疫血清添加後）直後（0秒)力も約 650秒後における吸光度を時系列に波長 750應 で測定する設定とした。結果を図 3に示す。図 3は、本発明法での検体 (Ol)と各種 混合免疫血清との反応による吸光度変化を示し、比較した図である。
[0080] 混合 1の吸光度が他の混合免疫血清に比べて上昇しており、陽性と判定することが できる。
[0081] 次に混合 1に対して陽性であったことから混合 1を構成する単味血清 01、 026、 08 6a、 0111、 0119、 0127a、 0128の各単味血清を用いて同様に試験した。結果を図 4 に示す。
[0082] Olの吸光度が他の単味血清に比べて上昇しており、陽性と判定することができる。
[0083] [実施例 3]
次に本発明方法と従来技術であるスライド凝集法との特異性を比較した。
[0084] 免疫血清の調製
実施例 1と同じ免疫血清を使用した。
[0085] 検体の調製
予め血清型が同定されている大腸菌 50株を使用した。菌株の内訳は以下の通りで ある。
[0086] 混合 1陽性 7株 Ol 026 086a Olll 0119 0127a 0128
混合 2陽性 6株 044 055 0125 0126 0146 0166
混合 3陽性 6株 018 OH4 0142 0151 0157 0158
混合 4陽性 6株 06 027 078 0148 0159 0168
混合 5陽性 5株 O20 025 063 0153 067
混合 6陽性 4株 08 015 OH5 0169
混合 7陽性 5株 028ac OH2ac 0124 0136 0144
混合 8陽性 4株 029 0143 0152 0164
混合 9陽性 7株 074 091 O103 0121 0145 0161 0165
以上の菌株を実施例 1と同じ方法で検体を調製した。 [0087] 測定
生化学検査用自動分析装置日立 7070 (日立社製)を用いて次のように測定（自動 分析法)を行った。検体 50 μ Lに対し生理食塩水 80 μ Lを加えた後に混合免疫血清 1 20 Lを加え、反応開始 (混合免疫血清添加後）直後（0秒)から約 650秒後における 吸光度を時系列に波長 750nmで測定する設定とした。次に反応開始直後（0秒）にお ける測定値を ABS0とし、 600秒後における測定値を ABS600として、 ABS600_ABS0= Δ ABSの値が lOOmAbs以上の場合を陽性とし、 lOOmAbs以下を陰性とした。
[0088] 比較試験 (スライド凝集法）
検体は本発明方法と同じ検体を使用し、判定方法はデンカ生研社製の病原大腸 菌免疫血清「生研」混合 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9を添付文書の通りに使用して判 定した。混合量は上述のスライド凝集法と同じである。
[0089] 比較試験の結果を表 2〜表 10に示す。表中、従来法はスライド凝集法である。
[表 2]
混合 1
Figure imgf000015_0002
[表 3]
混合 2
Figure imgf000015_0003
[表 4]
混合 3
Figure imgf000015_0001
[表 5] 混合 4
Figure imgf000016_0001
[表 6] 混合 5
Figure imgf000016_0002
[表 7] 混合 6
Figure imgf000016_0003
[表 8] 混合 7
Figure imgf000016_0004
[表 9] 混合 8
Figure imgf000016_0005
[表 10] 混合 9
Figure imgf000017_0001
[0090] 表 2〜表 10に示されるように、本発明方法による成績は、比較した従来のスライド凝 集法成績と完全に一致することが分力る。
[0091] [実施例 4]
次に本発明方法と従来技術であるスライド凝集法との判定能力を比較した。
[0092] 免疫血清の調製
実施例 1と同じ免疫血清を使用した。
[0093] 検体の調製
大腸菌 O103の変異株を実施例 1と同じ方法で検体を調製した。この変異株は単味 血清においては O103と判定される力 混合血清においては複数の混合血清と凝集 反応を示す株である。
[0094] 測定
生化学検査用自動分析装置日立 7070 (日立社製)を用いて次のように測定（自動 分析法)を行った。検体 50 μ Lに対し生理食塩水 80 μ Lを加えた後に混合免疫血清 1 20 Lを加え、反応開始 (混合免疫血清添加後）直後（0秒)から約 650秒後における 吸光度を時系列に波長 750nmで測定する設定とした。次に反応開始直後（0秒）にお ける測定値を ABS0とし、 600秒後における測定値を ABS600として、 ABS600_ABS0= Δ ABSの値を求めた。
[0095] 比較試験 (スライド凝集法）
検体は本発明方法と同じ検体を使用し、判定方法はデンカ生研社製の病原大腸 菌免疫血清「生研」混合 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9を添付文書の通りに使用して判 し 7こ。
[0096] 本発明の方法による測定結果を表 11、比較試験 (スライド凝集法）による結果を表 12に示す。表に示す値は AABSの値である。単位は mAbsとした。
[表 11] 混合 1 混合 2 混合 3 混合 4 混合 5 混合 6 混合 7 混合 8 混合 9
1 0 7 1 3 8 5 1 3 1 8 3 2 5 8 4 8 1 7 6 9 8 表 11に示すように、本発明の方法において、混合 4と混合 9の測定値が高ぐその 中でも特に、混合 9における測定値が他の血清と比較して測定値が高ぐ強陽性と判 定された。
[表 12]
Figure imgf000018_0001
[0098] 表 12に示すように、従来法であるスライド凝集法でも、混合 4と混合 9が陽性と判断 された。し力しながら、混合 4と混合 9のどちらがより強陽性なの力判定ができな力つた
[0099] 大腸菌 O群の型別は 50種類の単味血清を全て反応させるのは手間とコストが掛か ることから、最初に複数の単味血清で構成されている混合血清で分類してから、単味 血清で血清型を同定する。表 2および表 3に示されるように、従来のスライド凝集法で は判定をその凝集像で判定することから、複数の混合血清と凝集を示した場合、複 数の混合血清を構成する単味血清全てと反応させなければ血清型を同定できない。 しかし、本発明の方法においては凝集を光学的に測定することから、その数値の大き さによって従来のスライド凝集法では判定が難 、検体も容易に判定することができ る。
[0100] [実施例 5]
次に検体調製の際に加熱処理後の遠心-再浮遊操作の省略化について、本発明 方法と従来技術であるスライド凝集法を比較した。
[0101] 免疫血清の調製
実施例 1と同じ免疫血清を使用した。
[0102] 検体の調製
市販の病原性大腸菌免疫血清「生研」で血清型が Olと同定された、病原大腸菌 o 1 (混合 1の血清のみと反応)を寒天培地で好気的条件下、 37°Cで一夜培養した。次 に得られた生菌を生理食塩水で浮遊した後、浮遊菌液を 121°C、 30分間加熱処理を し、そのまま検体として用いた。
[0103] 測定
生化学検査用自動分析装置日立 7070 (日立社製)を用いて次のように測定（自動 分析法)を行った。検体 50 μ Lに対し生理食塩水 80 μ Lを加えた後に混合免疫血清 1 20 Lを加え、反応開始 (混合免疫血清添加後）直後（0秒)から約 650秒後における 吸光度を時系列に波長 750nmで測定する設定とした。次に反応開始直後（0秒）にお ける測定値を ABS0とし、 600秒後における測定値を ABS600として、 ABS600_ABS0= Δ ABSの値を求めた。
[0104] 比較試験 (スライド凝集法）
検体は本発明方法と同じ検体を使用し、判定方法はデンカ生研社製の病原大腸 菌免疫血清「生研」混合 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9を添付文書の通りに使用して判 し 7こ。
[0105] 本発明による測定結果を表 13、比較試験 (スライド凝集法）による結果を表 14に示 す。表 13に示す値は、 AABSの値である。単位は mAbsとした。
[表 13]
Figure imgf000019_0001
[0106] この結果、混合 1の測定値が最も高いことから、混合 1に対して陽性と判定された。
[表 14]
Figure imgf000019_0002
[0107] スライド凝集試験にお!ヽては全て陰性と判定された。
[0108] 表 13および表 14に示されるように、従来のスライド凝集法では検体処理の際に遠 心一再浮遊操作が必要であるが、本発明方法では省略しても判定することができた
[0109] 本発明法は、凝集を光学的に測定し得るので、比較例に比べより簡便、正確且つ 判定しやすいことから、優れた方法である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 細菌の菌体と抗体を水溶媒中で混ぜて抗原抗体反応による菌体の凝集を光を照 射して光学的に測定することを含む免疫凝集測定法。
[2] 細菌菌体と抗体の反応開始時の凝集を光学的に測定し、さらに反応開始後の凝集 を光学的に測定し、反応開始後の測定値と反応開始時の測定値の差を計算し、該 計算値に基づいて凝集の程度を判定する、対照試験を必要としない、請求項 1記載 の免疫凝集測定法。
[3] 細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応による複数の凝集を光学的に測定し、 得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づ！、て凝集の程度を判定する 請求項 1記載の免疫凝集測定法。
[4] 照射する光の波長が 200〜900nmである請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法
[5] 生化学検査用自動分析装置を用いる請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
[6] 細菌が病原大腸菌である請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
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