JP2003284588A - 腸管出血性大腸菌の簡易測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腸管出血性大腸菌の検出法の提供。 【解決手段】 抗ベロ毒素抗体感作粒子と大腸菌菌体を
反応させ、反応混合物の凝集の程度を測定することを含
む腸管出血性大腸菌の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腸管出血性大腸菌
の検出法に関する。具体的には、抗ベロ毒素抗体を感作
させた担体粒子と大腸菌とを反応させ、大腸菌菌体のベ
ロ毒素を検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】腸管出血性大腸菌は、ベロ毒素を産生す
ることを特徴とし、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群
(HUS)による急性腎不全、血栓性血小板減少性紫斑病(TT
P)等を引き起こし、しばしば感染者に死をもたらす。従
って、腸管出血性大腸菌の感染の有無を早期に診断し、
適切な治療を施し重篤な症状への移行を防止するため
に、腸管出血性大腸菌の感染の有無を短時間かつ正確に
検出する必要がある。

【０００３】大腸菌はその表面LPS抗原のＯ抗原の血清
型により約170種類に分類され、そのうちの約９０種類
がベロ毒素を産生する。ベロ毒素を産生する腸管出血性
大腸菌の血清型は、O157:H7、O157:NM、O26:H11、O91:H
21、O111:NM、O113:H21、O145:NM等がある。従来大腸菌
Ｏ抗原の血清型を測定し、上記血清型の大腸菌が検出さ
れた場合、腸管出血性大腸菌に感染していると診断を下
す方法があった（特開平10-339731号公報等）。しか
し、腸管出血性大腸菌の血清型を有する大腸菌のすべて
の菌体がベロ毒素を産生しているのではなく、ある血清
型を有する腸管出血性大腸菌のうちにベロ毒素を産生す
る菌体としない菌体がある。例えば、大腸菌O157は約95
％がベロ毒素を産生し、他の血清型の大腸菌ではベロ毒
素を産生する割合はもっと低い。従って、血清型からだ
けではベロ毒素産生大腸菌すなわち腸管出血性大腸菌か
否かは判断できない。

【０００４】これに対して、ベロ毒素に対する抗体等を
用いてベロ毒素の産生を検出することにより腸管出血性
大腸菌の感染を間接的に診断する方法もあった。この方
法においては、大腸菌を培養し、培養上清または菌体抽
出液中の遊離したベロ毒素を検出する。しかし、ベロ毒
素の分泌量は少なく培養上清中に検出できる程度のベロ
毒素が産生分泌されるには、１日から数日の培養を要
し、また抽出にも時間と手間がかかっていた。ベロ毒素
を産生し得る大腸菌は、全大腸菌の一部に過ぎないの
で、ベロ毒素を検出する方法では、最初に糞便等の検体
から大腸菌を分離培養して血清型を検出し、ついでベロ
毒素を産生し得る大腸菌についてのみさらに培養し、ベ
ロ毒素を検出していた。このような２段階の方法によれ
ば、全ての大腸菌についてベロ毒素の検出を行う必要が
ないという利点があるものの、２回の培養を要するの
で、検出までにさらに時間を要していた。この方法は、
菌体より一旦ベロ毒素を遊離させ単離するため、ベロ毒
素を産生している菌体を直接検出しているのではなかっ
た。特に、ベロ毒素は、２種類のタンパク質が６個集合
して、はじめて有毒性を示すので、遊離したベロ毒素を
検出する免疫化学的な方法は、個々のタンパク質に対し
て反応するため、時として、誤った測定結果を与える。
また、検体の取り違え等により検出の正確度が低下し得
るという問題があった。菌体より遊離したベロ毒素の検
出法としては、逆受身ラテックス凝集法、EIA法、イム
ノクロマト法等があった。

【０００５】また、ベロ毒素遺伝子をPCR等の遺伝子増
幅等により増幅し、ベロ毒素遺伝子を検出する方法もあ
った（特開平07-008280、特開平11-009281、特開平11-3
32599、特開2001-095576号公報）。しかし、この方法に
おいては擬陽性を防ぐために検体の前処理を必要とする
ため、操作が煩雑であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ベロ毒素産
生大腸菌すなわち腸管出血性大腸菌の検出に関する。具
体的には、ベロ毒素を産生している腸管出血性大腸菌を
直接ラテックス凝集法により検出する方法に関する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の従
来法の問題点を解決し、短時間で正確に腸管出血性大腸
菌を検出する方法について鋭意検討を行った結果、抗ベ
ロ毒素抗体を用いたスライド凝集法により、ベロ毒素を
菌体から遊離させることなく、検体に菌体そのものを用
いて、直接、腸管出血性大腸菌表面にあるベロ毒素を検
出することにより、腸管出血性大腸菌を迅速かつ正確に
検出し得る本発明を完成させるに至った。上述のよう
に、従来は、ベロ毒素を特異的に検出しようとする場
合、腸管出血性大腸菌型ベロ毒素を遊離させ菌体と分離
し、抗ベロ毒素抗体を感作させたラテックス粒子を用い
た逆受身ラテックス凝集法等により検出していた。

【０００８】本発明者らは、ベロ毒素を遊離させずに大
腸菌菌体そのものを検体として大腸菌表面に存在するベ
ロ毒素を検出する方法について検討を行った。腸管出血
性大腸菌により産生されたベロ毒素は、大腸菌の細胞壁
と細胞膜の間のペリプラズミックスペースに貯えられ
る。ペリプラズミックスペースに貯えられたベロ毒素
は、表面に露出しにくいため、菌体上のベロ毒素を抗体
を用いて直接検出することは困難であった。本発明者等
は、大腸菌の細胞壁を部分的に壊すことにより、ベロ毒
素を露出させ、抗ベロ毒素抗体で測定できるようになる
ことを見出し、本発明を完成させるに至った。

【０００９】すなわち、本発明は以下の通りである。 （１） 抗ベロ毒素抗体感作粒子と大腸菌菌体を反応さ
せ、反応混合物の凝集の程度を測定することを含む腸管
出血性大腸菌の検出方法、 （２） 大腸菌菌体をポリミキシンBで処理することを
含む（１）の腸管出血性大腸菌の検出方法、 （３） 粒子がラテックス粒子である（１）または
（２）の腸管出血性大腸菌の検出方法、 （４） ラテックス粒子の直径が0.1〜１μmである
（３）の腸管出血性大腸菌の検出方法、 （５） スライド凝集法である（３）または（４）の腸
管出血性大腸菌の検出方法、 （６） 抗ベロ毒素抗体感作粒子を含む、大腸菌菌体上
のベロ毒素を検出するための腸管出血性大腸菌検出キッ
ト、および （７） 感作粒子が感作ラテックス粒子である（６）の
腸管出血性大腸菌検出キット。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 １．抗ベロ毒素抗体感作粒子の調製 本発明は、抗ベロ毒素抗体を担体粒子に感作、すなわち
結合または吸着させ、該感作粒子と腸管出血性大腸菌菌
体を混合して反応させ、凝集体を作らせ、該凝集体の形
成の有無により大腸菌の壁内に存在するベロ毒素を直接
検出する。

【００１１】抗ベロ毒素抗体を感作する担体粒子として
は、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定で
ある限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラ
テックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、
固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス
粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子として
は、例えば、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビ
ニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体の粒
子、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン-ブタジエ
ン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合
体等のブタジエン系共重合体ラテックス粒子、ポリビニ
ルトルエンラテックス粒子等が挙げられる。なかでも、
各種タンパク質、又は、ポリペプチド類等の吸着性に優
れており、かつ生物学的活性を長期間安定に保持できる
点で、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。上
記ラテックス粒子の粒径は、好ましくは0.01〜１μmで
あり、さらに好ましくは0.1〜１μmである。粒径が0.01
μm未満であると、微凝集が多発し、見かけの粒径が不
均一となり、同時再現性等に悪影響が及ぶことがあり、
また、抗体の数に対して充分な凝集が得られないことが
ある。粒径が１μｍを超えると、自己凝集が進み、分散
性が低下する。ラテックス粒子を使用する場合には、特
別な処理をしなくても容易に抗体を担体に感作できると
ともに、対象菌体と担体の反応により生じる凝集像が明
瞭となり、対象菌体の担体に対する反応性を容易かつ精
度よく判別できる点でさらに有利である。

【００１２】抗ベロ毒素抗体は、腸管出血性大腸菌より
ベロ毒素を精製して、精製ベロ毒素を免疫原として公知
の方法により得ることができる。ベロ毒素の精製は、例
えばItoら、Microbial Pathogenesis 1988; 5: 189-19
5、Nodaら、Microbial Pathogenesis 1987; 2: 339-349
等の方法で行うことができる。また、遺伝子工学的手法
により作製した組換えベロ毒素を用いることもできる。
ベロ毒素はベロ毒素１型（VT1）およびベロ毒素２型（V
T2）の２種類が存在し、VT1のみまたはVT2のみを産生す
る腸管出血性大腸菌が存在するので、VT1を認識する抗
体およびVT2を認識する抗体のどちらも調製する必要が
ある。VT1およびVT2を別々に免疫原として抗体を作製
し、混合して用いることもできるし、両方を混合して免
疫原として一度に両方を作製してもよい。また、抗VT1
抗体と抗VT2抗体を別々に調製し、別々にラテックス粒
子を感作して用いてもよい。この場合、各々の感作ラテ
ックス粒子によりVT1とVT2を別々に検出し得る。VT1感
作ラテックス粒子およびVT2感作ラテックス粒子を混合
して用いてVT1およびVT2を同時に検出することもでき
る。また、VT1およびVT2はサブユニットAおよびBからな
っているので、サブユニットを免疫原として用いてもよ
い。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
でもよい。ポリクローナル抗体は、精製したベロ毒素を
免疫原として、ヤギ、ウサギ等の動物を免疫し、抗血清
を得て抗血清から硫安塩析法、DEAEセルロース等の陰イ
オン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、
分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法
を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることに
より精製することができる。モノクローナル抗体は、ケ
ーラーとミルステインの方法（Kohler, G. and Milstei
n, C.,Nature, 256, 495-497, 1975）等の公知の方法に
より作製し得る。この際、精製したベロ毒素を免疫原と
して用いてもよいし、ベロ毒素を産生する腸管出血性大
腸菌体をそのまま免疫原として用いても抗ベロ毒素モノ
クローナル抗体を得ることができる。上記免疫原で免疫
したマウスの脾細胞またはリンパ節細胞とマウスのミエ
ローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマ
を作製し、該ハイブリドーマの培養上清又は該ハイブリ
ドーマを腹腔内に投与したマウスの腹水から調製するこ
とができる。被免疫動物は、マウスに限定されずラッ
ト、モルモット等も利用可能である。ミエローマ細胞
は、一般に被免疫動物と同種の動物より得られたものを
用いるが、異種間でも可能な場合がある。また、免疫さ
れていない動物の脾細胞またはリンパ節をin vitroで免
疫して、感作細胞を得ることもできる。ハイブリドーマ
のスクリーニングは、種々の免疫化学的方法で実施する
ことができ、例えばELISA法、ウエスタンブロット法等
が利用できる。抗体の精製が必要とされる場合は、上述
の方法で精製することができる。また、市販のベロ毒素
抗体を用いてもよい。市販の抗ベロ毒素抗体として例え
ば、バイロスタット社製のものが入手可能である。

【００１３】担体に抗体を感作する方法は、特に限定さ
れない。例えば、抗体を担体に物理的に吸着させてもよ
いし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例
えば、抗体と担体とを混和した後、30〜37℃で1〜2時間
加温振盪することにより、抗体を担体に感作させること
ができる。更に、30〜37℃で1〜2時間加温振盪後、50
℃、30分加温することが望ましい。担体に感作する抗体
の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定すること
ができる。例えば、１重量％に調製したラテックス粒子
懸濁液に0.1〜数mg/mLの抗体溶液を等量混合することに
よりラテックス粒子を感作し得る。抗体を担体に感作し
た後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、
ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アル
ブミン等でブロッキングするのが好ましい。抗体を感作
した担体は、対象菌株と反応させる時まで媒体分散液と
して保持しておくのが好ましい。この際、媒体として
は、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用す
ることができる。モノクローナル抗体に感作した担体の
含有量は、通常、媒体分散液に対して0.1〜1.0重量％と
することができるが、0.2〜0.5重量％とするのが好まし
い。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼ
ラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。

【００１４】２．ラテックス凝集法 本発明の腸管出血性大腸菌検出法の検体としては、大腸
菌に汚染されている試料を用いることができ、例えば、
糞便、尿、血液、組織ホモジェネートなどを用いる。ま
た、食品材料を用いてもよい。これらの検体の一部を採
取し寒天培地上で培養する。この際、分離培地としては
DHL寒天やマッコンキー寒天などを用いることができ
る。

【００１５】６〜20時間培養後、寒天培地上に出現した
コロニーを白金耳等で１〜３白金耳程度分を採取する。
採取した大腸菌を大腸菌の細胞壁を溶解し得る試薬で処
理し、細胞壁を破壊する。大腸菌の細胞壁を溶解し得る
試薬として例えば、酵素、アルカリ溶液、ポリミキシン
B溶液が挙げられる。ポリミキシンBを用いる場合は、1,
000〜10,000 unit/mL、好ましくは3,000〜7,000 unit/m
L、特に好ましくは4,000〜6,000 unit/mLの濃度で用い
る。前記採取した大腸菌をポリミキシンB溶液中に懸濁
させればよい。この際、反応を行わせるスライドガラス
等の上にポリミキシンを数十μL、好ましくは10〜50μL
滴下しておき、そこに採取した大腸菌を懸濁させればよ
い。

【００１６】大腸菌と抗ベロ毒素感作粒子との凝集反応
は、スライドガラス上で行う。この場合、担体粒子の凝
集程度は目視により測定することができる。また、プラ
スチックセル若しくはガラスセル内で行うこともでき
る。この場合、セル外部より可視光から近赤外域の光を
照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出して担
体粒子の凝集の程度を測定する。凝集の測定は、例えば
三菱化学株式会社のLPIA-S500ラテックス凝集全自動測
定器、ロシュ・ダイアグノスティック・システムズ社の
COBAS FARA装置及びCOBAS MIRA装置、及び日立製作所の
日立7070分析装置等を用いて行うことができる。

【００１７】凝集反応は、生理食塩液、pH5.0〜10の適
当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ト
リス緩衝液等の溶液中で行わせればよい。この際、感作
粒子と大腸菌との非特異的結合を抑制するために、Trit
onX-100、Tween20、Tween80等の適当な界面活性剤を添
加してもよい。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により、本発明を具体的に説明
する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 〔実施例１〕 感作粒子の調製 ラテックス粒子は、直径0.34μmのポリスチレンラテッ
クス粒子を用いた（PROLABO社、estaporK035）。ラテッ
クス粒子への感作抗体は抗ベロ毒素ウサギ血清を精製ベ
ロ毒素を結合させたアフィニティ カラムを用いて以下
のようにして精製して得た精製抗体を用いた。

【００１９】A) 抗ベロ毒素血清作製方法 精製ベロ毒素1型または2型を下記スケジュールでウサギ
に接種し、採血した血液を1晩静置後、遠心上清を抗血
清とした。 1週〜4週：精製ベロ毒素1型又は2型をアジュバントと混
合しウサギ四肢皮下に毎週接種する。 5型〜8週：精製ベロ毒素1型又は2型をウサギ耳静脈に毎
週接種する。

【００２０】B) 精製抗体作製方法 0.5M塩化ナトリウム含有0.075Mリン酸緩衝液(pH7.2)に
より５倍に希釈した抗ベロ毒素血清を精製ベロ毒素を結
合して作製したアフィニティゲルに流し込み、抗ベロ毒
素抗体を抗原抗体反応でゲルに結合させた後、２Mチオ
シアン酸ナトリウム水溶液により抗ベロ毒素抗体を溶出
させた。次いで、この溶出液をPBSで平衡化したセファ
デックスG-25に加え、PBSで溶出し、精製抗体とする。

【００２１】精製した抗体を以下の方法でラテックス粒
子へ感作した。PBSで１重量％に調整したラテックス浮
遊液に精製抗体溶液(1mg/mL)を等量混合し、37℃で1時
間保温し更に50℃で30分間加温する。その後、0.5重量
％ウシ血清アルブミン含有PBSを添加し１６時間静置
し、遠心によりラテックス粒子を集め0.5重量％アルブ
ミン含有PBSに再浮遊して感作ラテックス液とする。

【００２２】〔実施例２〕 抗ベロ毒素抗体感作ラテッ
クス粒子を用いた腸管出血性大腸菌の検出 大腸菌O26株、O1株、O18株、O157株、OUT株（ベロ毒素
産生性株またはベロ毒素非産生株）をブレインハートイ
ンフュージョン寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）上で培養し
た。スライドグラスをガラス鉛筆で数区画に分割し、5,
000unit/mLのポリミキシンB（ファイザー社製）を含む
生理食塩液を各区画に25μL滴下した後、寒天培地上の
上記大腸菌を白金耳で１白金耳分採取し、スライドグラ
ス上のポリミキシンB溶液中に懸濁した。次いで、実施
例１で作製した抗ベロ毒素抗体感作ラテックス粒子懸濁
液を25μL添加し、スライドミキサーで５分間攪拌し凝
集の形成状態を目視で観察し判定した。表１に結果を示
す。

【００２３】

【表１】

【００２４】表１に示すように、ベロ毒素を産生する大
腸菌は陽性となり、ベロ毒素を産生しない大腸菌は陰性
となった。なお、ベロ毒素産生大腸菌をポリミキシンB
処理した後に遠心を行い、その上清中にベロ毒素が含ま
れていることを、逆受身ラテックス凝集法（RPLA）（デ
ンカ生研製のキットを使用）で確認後、本発明の抗ベロ
毒素感作ラテックス粒子と混合したところ凝集は認めら
れなかった。しかし、同量の同株の大腸菌の菌体と実施
例１の抗ベロ毒素抗体感作ラテックス粒子と反応させた
ところ、凝集が認められた。さらに、該大腸菌をポリミ
キシンBの代わりに生理食塩液で処理した後に、大腸菌
の菌体と実施例１の抗ベロ毒素抗体感作ラテックスと反
応させたところ凝集は認められなかった。この結果は、
ポリミキシンB処理により、ベロ毒素が遊離するととも
に、菌体表面に結合したベロ毒素が露出し菌体そのもの
を本発明の凝集法で検出できるようになることを示して
いる。

【００２５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、実施例２に示す
ように腸管出血性大腸菌の菌体そのものを試料として表
面のベロ毒素を検出することができ、余分な培養操作を
必要としないため簡便かつ迅速に腸管出血性大腸菌を検
出することができる。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗ベロ毒素抗体感作粒子と大腸菌菌体を
   反応させ、反応混合物の凝集の程度を測定することを含
   む腸管出血性大腸菌の検出方法。
2. 【請求項２】 大腸菌菌体をポリミキシンBで処理する
   ことを含む請求項１記載の腸管出血性大腸菌の検出方
   法。
3. 【請求項３】 粒子がラテックス粒子である請求項１ま
   たは２記載の腸管出血性大腸菌の検出方法。
4. 【請求項４】 ラテックス粒子の直径が0.1〜１μmであ
   る請求項３記載の腸管出血性大腸菌の検出方法。
5. 【請求項５】 スライド凝集法である請求項３または４
   記載の腸管出血性大腸菌の検出方法。
6. 【請求項６】 抗ベロ毒素抗体感作粒子を含む、大腸菌
   菌体上のベロ毒素を検出するための腸管出血性大腸菌検
   出キット。
7. 【請求項７】 感作粒子が感作ラテックス粒子である請
   求項６記載の腸管出血性大腸菌検出キット。