JP2000338105A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原（または抗体）濃度の如何にかかわら
ず、検体中の抗原（または抗体）量を高精度に定量する
ことができる免疫測定方法を得る。 【解決手段】 抗原（または抗体）を含有する検体に、
該抗原（または抗体）に対応した抗体（または抗原）を
含有した試薬を添加して、試薬添加前後の光学的特性の
変化量を測定するにあたり、検体に添加すべき上記試薬
をｎ回（ｎは２以上の整数）に分割して添加する、免疫
測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原や抗体を測定
する免疫測定方法に関し、より詳細には、抗原−抗体反
応により生成された抗原抗体複合物の量を光学的に測定
することにより抗原または抗体の量を測定する免疫測定
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、検体中の抗原や抗体を測定する方
法として、光学的免疫測定方法が広く用いられている。

【０００３】すなわち、光学的免疫測定方法では、測定
すべき抗原（または抗体）を含む検体と、該抗原に対応
した抗体（または抗原）を含有する溶液とを混合し、不
溶性の抗原抗体複合物を生成させる。そして、検体の当
初の光学的特性と、上記抗原抗体複合物が生成されて凝
集が生じた後の光学的特性を測定し、該光学的特性の変
化により、抗原（または抗体）の量が測定される。

【０００４】上記光学的特性としては、吸光度や散乱光
強度などが利用されている。ところが、従来の免疫測定
方法では、測定すべき抗原が低濃度に含まれている場
合、抗原量を正確に定量することが困難であるという問
題があった。すなわち、実際の測定に際しては、検体中
の抗原量は測定前には知られておらず、様々な濃度で抗
原が含まれていることが多い。他方、各検体に加えられ
る抗体溶液の濃度及び抗体量は同一である。また、抗体
溶液の濃度及び量は、検体中の抗原量が多い場合でも正
確に抗原量を測定するように選択されている。従って、
抗原の量が少ない検体では、抗体過剰となり、抗原抗体
複合物が形成され難くなり、抗原を正確に定量すること
ができなかった。

【０００５】特開昭６４−３８６５４号公報には、上記
のような問題を解決する方法として、検体中の測定すべ
き抗原と、該抗原に対応する第１の抗体とを反応させて
抗原抗体複合物を形成させ、しかる後、該抗原抗体複合
物と抗原に対応する第２の抗体を反応させて、形成され
る抗原抗体複合物に光を照射して光学的変化量を測定す
る免疫定量法が開示されている。

【０００６】この先行技術に記載の方法では、第１の抗
体の量は、抗原抗体複合物の生成によって凝集が実質的
に起こらない程度の量とされ、抗原と第１の抗体との反
応後に遊離の抗原決定基が残る程度の量とされている。
このように第１の抗体量を選択することにより、すなわ
ち凝集が起こらない程度に第１の抗体を作用させて予備
的に抗原抗体複合物を形成することにより、検体中の抗
原量が少ない場合の抗体過剰に伴う問題が解決されると
記載されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記先
行技術に記載のように、第１の抗体を添加して凝集が起
こらない程度に予備的に抗原抗体複合物を生成させる方
法を用いたとしても、なお検体中の抗原量が非常に少な
い場合には、抗原量を正確に測定することは困難であっ
た。

【０００８】加えて、上記先行技術では、抗原に対応す
る第１抗体を抗原に反応させて予備的に抗原抗体複合物
を生成させることにより抗体過剰の問題が解決されると
されているが、上記先行技術では、抗原が過剰の場合に
ついては何ら記載されていない。

【０００９】本発明の目的は、従来の免疫測定方法の現
状に鑑み、より広い濃度範囲の抗原（または抗体）含有
検体、特に、低濃度の検体についても抗原（または抗
体）を高精度に定量することを可能とする免疫測定方法
を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明に係る免疫測定方
法は、抗原（または抗体）を含有する検体に、該抗原
（または抗体）に対する抗体（または抗原）を含有した
試薬を添加し、試薬添加前後の光学的特性の変化量を測
定することにより検体中の抗原（または抗体）量を測定
する免疫測定方法であって、上記抗体（または抗原）を
含有した試薬を、ｎ回（ｎは２以上の整数）に分割して
添加することを特徴とする。

【００１１】また、本発明に係る免疫測定方法では、好
ましくは、上記試薬中の抗体（または抗原）は、粒子に
担持される。また、好ましくは、ｎ回に分割して添加さ
れる試薬において、ｉ回目（ｉは２〜ｎの整数）に添加
される試薬中の抗体（または抗原）量が、（ｉ−１）回
目に添加される試薬中の抗体（または抗原）量よりも多
くされる。

【００１２】以下、本発明の詳細を説明する。本発明に
おいては、抗原（または抗体）を含有する抗体に、該抗
原（または抗体）に対する抗体（または抗原）を含有し
た試薬を添加して、光学的特性の変化量を測定すること
により検体中の抗原（または抗体）量が測定される。す
なわち、従来より汎用されている光学的免疫測定方法と
同様に、検体中の抗原（または抗体）と、該抗原（また
は抗体）に対応した抗体（または抗原）との抗原抗体複
合物を免疫反応により生成させ、該抗原抗体複合物の凝
集により生じた光学的特性の変化を測定することによ
り、検体中の抗原（または抗体）量が定量される。

【００１３】もっとも、従来の免疫測定方法では、前述
したように、広い範囲にわたり、特に低濃度域におい
て、抗原（または抗体）を正確に定量することができな
かった。

【００１４】これに対して、本発明は、上記のように検
体に添加すべき試薬、すなわち上記抗体（または抗原）
含有試薬を、ｎ回に分割して添加することにより、広い
濃度範囲にわたり、特に低濃度域において抗原（または
抗体）を正確に定量することを可能とするものである。

【００１５】なお、前述した先行技術では、凝集が生じ
ないように予備的に抗原抗体複合物を生成させて、抗体
過剰に起因する低濃度域における測定精度の向上が図ら
れていたのに対し、本発明では、これとは異なり、試薬
をｎ回に分けて添加することにより、常に抗原と抗体と
の量比を最適化し、それによって免疫複合体の生成及び
凝集の形成をより確実なものとすることにより測定精度
の向上が図られる。

【００１６】抗体を含む試薬を３回に分けて添加する場
合を例にとり、本発明に係る免疫測定方法をより具体的
に説明する。まず、濃度が未知である抗原含有検体に、
少量の抗体を含む第１回目の試薬を反応させ、次に、中
程度の量の抗体を含む第２回目の試薬を反応させ、さら
に多量の抗体を含む第３回目の試薬を反応させるとす
る。この場合、検体中の抗原濃度に応じて、以下のよう
にして凝集が生じる。

【００１７】検体中に抗原が存在しないとき 第１回目の試薬〜第３回目の試薬を順次添加したとして
も、抗原抗体反応は起こらず、凝集は形成されない。

【００１８】検体中に抗原が少量存在する場合 少量の抗体を含む第１回目の試薬を添加した場合に免疫
反応により凝集が形成される。第２回目及び第３回目の
試薬を添加しても、反応すべき抗原は残っておらず、そ
れ以上の凝集は形成されない。

【００１９】検体中に抗原が中程度量存在する場合 少量の抗体を含む第１回目の試薬を添加したときには、
抗原過剰で凝集は抑制されるが、第２回目の試薬を添加
することにより、抗原過剰が解消され、検体中の抗原量
に応じた凝集が形成される。第３回目の試薬を添加して
も、反応すべき抗原が残っておらず、それ以上の凝集は
形成されない。

【００２０】検体中に抗原が多量存在する場合 少量の抗体を含む第１回目の試薬及び中程度量の抗体を
含む第２回目の試薬を添加した場合には、抗原過剰によ
り凝集は抑制される。しかしながら、第３回目の試薬を
添加すると、抗原過剰が解消され、抗原量に応じた凝集
が形成される。

【００２１】従って、上記〜のいずれの場合におい
ても、第１回目の試薬〜第３回目の試薬を順次添加する
ことにより、抗原量に対応した凝集が確実に形成され
る。よって、第１回目の試薬添加前の検体の光学的特性
を測定し、第３回目の試薬添加後の検体の光学的特性を
測定し、光学的特性の変化量を検出すれば、検体中の抗
原量が該光学的特性変化量に対応するので、検体中の抗
原量を、検体中の抗原濃度の如何にかかわらず、正確に
検出することができる。

【００２２】すなわち、上述した説明から明らかなよう
に、本発明に係る免疫測定方法では、抗体（または抗
原）を含む試薬を、ｎ回に分割して添加するので、検体
中の抗原（または抗体）の量の如何にかかわらず、確実
に抗原（または抗体）量に応じた凝集が確実に形成され
る。従って、抗原（または抗体）濃度を、正確に測定す
ることができる。

【００２３】なお、本発明に係る免疫測定方法は、上記
のように測定すべき抗原（または抗体）に対応した抗体
（または抗原）を含む試薬をｎ回に分割して添加するこ
とに特徴を有し、その他の点については、従来の免疫測
定方法に従って適宜行い得る。例えば、試薬として用い
る抗体（または抗原）については、測定すべき抗原（ま
たは抗体）に対して免疫反応により抗原抗体複合物を生
成する適宜の抗体（または抗原）を用いることができ
る。

【００２４】抗体の場合には、モノクローナル抗体を用
いてもよく、ポリクローナル抗体を用いてもよい。ま
た、抗体（または抗原）の供給源となる動物種について
も特に限定されない。さらに、抗体（または抗原）は、
複数種を混合して用いてもよい。

【００２５】また、試薬中の抗体（または抗原）の量に
ついては、従来の免疫測定方法の場合と同様に適宜定め
られるが、前述したように、好ましくは、ｉ回目に添加
される試薬中の抗体（または抗原）量を、（ｉ−１）回
目に添加される試薬の抗体（または抗原）量よりも多く
することが望ましい。すなわち、第１回目に添加される
試薬から、最後に添加される試薬まで、順に抗体（また
は抗原）量が多くなるように設定することにより、栓体
中の抗原（または抗体）量が微量の場合であっても、よ
り正確に抗原（または抗体）量を検出することができ
る。

【００２６】もっとも、ｎ回に分割されて添加される試
薬中の抗体（または抗原）量は、全て等しくしてもよ
い。その場合であっても、各回に投入される試薬中の抗
体（または抗原）量に応じて、検体中の抗原（または抗
体）との免疫反応による抗原抗体複合物の生成に起因す
る凝集が形成され、検体中の抗原（または抗体）量を正
確に検出することができる。

【００２７】また、本発明に係る免疫測定方法における
検体と試薬との反応条件については、抗原抗体反応が生
じる限り、特に限定されない。通常、４〜５０℃の温度
で、１０分〜２４時間程度反応させればよい。

【００２８】また、好ましくは、上記試薬中に含有され
る抗体（または抗原）は、粒子に担持された形態とされ
る。すなわち、ラテックス粒子などの粒子に抗体（また
は抗原）を担持させることにより、抗体抗原複合体を形
成した後の吸光度変化量を高めることができ、測定感度
を高めることができる。このような粒子としては、ラテ
ックス粒子の他、金コロイド、ポリスチレンビーズな
ど、従来より抗原抗体複合体形成に際して用いられてい
る抗体（または抗原）を担持させる適宜の粒子状物を用
いることができる。また、第１回目の試薬〜第ｎ回目の
試薬において、異なる粒径の粒子を用いてもよい。例え
ば、第１回目に添加される試薬において抗体（または抗
原）が担持される粒子の粒径と、第２回目の試薬中にお
いて抗体（または抗原）が担持されている粒子の粒径を
異ならせてもよい。

【００２９】本発明に係る免疫測定方法は、様々な抗原
（または抗体）を含む検体中の抗原（または抗体）の定
量に用いることができ、特に限定されないが、例えば、
血液成分、尿、唾液などの体液中の抗原（または抗体）
の測定に好適に用いることができる。

【００３０】また、定量すべき抗原または抗体について
は、対応する抗体または抗原と免疫反応を引き起こし、
免疫複合物を生成するものである限り特に限定されず、
例えば、ＨＩＶ抗原、ＡＦＰ（α−フェトプロテイ
ン）、β−２−ミクログロブリン、ＣＥＡ（癌胎児性抗
原）、フェリチン、ＣＡ１９−９（糖質抗原１９−
９）、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＰＳＡ
（前立腺特異性抗原）、ＣＲＰ（Ｃ−反応性蛋白質）、
Ｍｂ（ミオグロビン）、ＲＦ（リウマチ因子）、ＡＳＯ
（抗ストレプトリジン−Ｏ）、ＦＤＰ（フィブリン分解
生成物）、抗トロンビンＩＩＩ、プラスミノーゲン、α
−２−プラスミンインヒビター、Ｄ−ダイマー（フィブ
リン分解生成物Ｄ−フラグメント二量体）、ＩｇＧ（免
疫グロブリンＧ）、ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）、Ｉｇ
Ｍ（免疫グロブリンＭ）、ＩｇＥ（免疫グロブリン
Ｅ）、Ｃ３（補体第３成分）、Ｃ４（補体第４成分）、
尿アルブミン、ｈＣＧ（ヒト繊毛性性腺刺激ホルモ
ン）、ｈＰＬ（ヒト胎盤性ラクトゲン）、インシュリ
ン、ＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎表面抗原）、ＨＢｓ抗体（抗
Ｂ型肝炎表面抗原抗体）、ＨＢｃ抗体（抗Ｂ型肝炎コア
抗原抗体）、ＨＣＶ抗体（抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体）、
トレポネーマ（抗梅毒トレポネーマ抗体）、ＴＳＨ（甲
状腺刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳ
Ｈ（卵胞刺激ホルモン）などを例示することができる。

【００３１】光学的特性の変化量の測定方法についても
特に限定されず、凝集による吸光度変化や散乱光強度の
変化など、任意である。また、このような光学的特性の
変化を測定するための装置についても、吸光度測定装
置、レーザーネフェロメーター、吸光度測定手段を備え
た自動分析装置など任意である。

【００３２】

【発明の効果】本発明に係る免疫測定方法によれば、検
体中の抗原（または抗体）を測定するにあたり、該抗原
（または抗体）に対応した抗体（または抗原）を含有す
る試薬をｎ回に分割して添加し、試薬添加前後の光学的
特性の変化を測定することにより検体中の抗原（または
抗体）と抗体（または抗原）との免疫複合物の凝集に起
因する光学的特性の変化を測定することにより、検体中
の抗原（または抗体）量が定量される。

【００３３】この場合、試薬がｎ回に分割して添加され
るので、検体中の抗原（または抗体）量の如何にかかわ
らず、検体中の抗原（または抗体）と試薬中の抗体（ま
たは抗原）との免疫反応により、確実に凝集が生じ、そ
れによって検体中の抗原（または抗体）量を高精度に定
量することができる。特に、検体中の抗原（または抗
体）量が少ない場合であっても、最初の方に添加される
試薬添加時に、凝集が形成されるので、低濃度の抗原
（または抗体）含有検体中の抗原（または抗体）量を高
精度に定量することができる。

【００３４】本発明において、試薬中の抗体（または抗
原）として、粒子に担持されているものを用いる場合に
は、免疫反応により生成された免疫複合物により光学的
特性の変化を大きくすることができ、それによってより
高精度に検体中の抗原（または抗体）量を測定すること
ができる。

【００３５】本発明において、ｉ回目に添加される試薬
中の抗体（または抗原）量を、（ｉ−１）回目に添加さ
れる試薬中の抗体（または抗原）量よりも多くした場合
には、第１回目、第２回目…の順に抗体（または抗原）
添加量が多くされていくので、検体中の抗原（または抗
体）量が微量の場合であっても、抗原過剰（または抗体
過剰）による凝集阻害を抑制することができ、より一層
効果的に検体中の抗原（または抗体）量を正確に定量す
ることができる。

【００３６】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げることにより、
本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施
例により限定されるものではない。

【００３７】（１）試薬の調製 ４８ｍｇ／ｍｌのＣＲＰポリクローナル抗体溶液を５体
積％の割合で含むグリシン緩衝液（ｐＨ＝７．５）に、
粒径約０．３μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
工業社製、品番：Ｎ−３００）を１体積％含むように加
え、３７℃で１時間反応させた。次に、１体積％の濃度
でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むグリシン緩衝液
（ｐＨ＝７．５）を上記反応後の溶液に等量加え、３７
℃で１時間反応させた後、遠心分離し、沈渣を１体積％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）にてラテック
スに所定濃度で分散させ、抗体感作ラテックス試薬を得
た。この場合、上記所定濃度として、７．７重量％感作
ラテックス液、２３．１重量％感作ラテックス液、６
９．２重量％感作ラテックス液及び１００重量％感作ラ
テックス液を用意した。

【００３８】（実施例）検体として、ＣＲＰ抗原含有濃
度が、０、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、
３０ｍｇ／ｄｌである７種類の検体サンプルを用意し
た。なお、各検体サンプルの量は３μｌとした。

【００３９】上記各検体サンプル３μｌに、検体希釈液
として１体積％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．
５）１５０μｌを混合して、自動分析装置（日立製作所
製、品番：７１７０）にセットし、２２分測定モード及
び測定ポイント７３ｐ−５ｐにて８００ｎｍにおける吸
光度を以下のようにして測定した。なお、反応温度は３
７℃とした。

【００４０】上記のようにしてセットされた希釈検体サ
ンプルに、７．７％感作ラテックス液（第１回目の試
薬）５０μｌを５ポイントと６ポイントとの間で添加し
（反応時間３．２分）、２３．１％感作ラテックス液
（第２回目の試薬）５０μｌを１６ポイントと１７ポイ
ントとの間で添加し（反応時間５．０分）、６９．２％
感作ラテックス液（第３回目の試薬）５０μｌを３３ポ
イントと３４ポイントとの間で添加し（反応時間１２．
１分）、７３ポイントで最後の測光を行った。各検体サ
ンプルについて上記のようにして、８００ｎｍにおける
吸光度変化量（７３ポイントと５ポイントにおける吸光
度の差）を測定した。

【００４１】（比較例）実施例と同様にして、各検体サ
ンプル３μｌを検体希釈液１５０μｌで希釈した後、自
動分析装置を用いて２２分測定モード及び測定ポイント
７３ｐ−５ｐにて８００ｎｍにおける吸光度を測定し
た。もっとも、希釈された各検体サンプルに、５ポイン
トと６ポイントとの間で１００％感作ラテックス液５０
μｌを添加し、実施例と緩衝液の総量が変わらないよう
に、１６ポイントと１７ポイントとの間で０％感作ラテ
ックス液５０μｌを添加し、３３ポイントと３４ポイン
トとの間で０％感作ラテックス液５０μｌを添加した。
このようにして、試薬が一括投入された各検体サンプル
について、実施例と同様に８００ｎｍにおける吸光度変
化量を求めた。

【００４２】（結果）下記の表１及び表２に、実施例及
び比較例において各検体サンプルについて測定された吸
光度、並びに吸光度変化量を示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【表２】

【００４５】また、図１に、実施例及び比較例における
検体サンプル中のＣＲＰ抗原濃度と、吸光度変化量との
関係を示す。表２及び図１から明らかなように、比較例
に対して、実施例によれば、ＣＲＰ抗原濃度が低い場合
であっても、ＣＲＰ抗原濃度に応じて吸光度変化量が直
線的に変化することがわかる。従って、実施例の方法に
よれば、ＣＲＰ抗原濃度が低い場合であっても、検体中
のＣＲＰ抗原をより高精度に測定し得ることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る実施例及び比較例において測定さ
れたＣＲＰ抗原濃度と、吸光度変化量との関係を示す
図。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原（または抗体）を含有する検体に、
   該抗原（または抗体）に対する抗体（または抗原）を含
   有した試薬を添加し、試薬添加前後の光学的特性の変化
   量を測定することにより検体中の抗原（または抗体）量
   を測定する免疫測定方法であって、 上記抗体（または抗原）を含有した試薬を、ｎ回（ｎは
   ２以上の整数）に分割して添加することを特徴とする免
   疫測定方法。
2. 【請求項２】 前記抗体（または抗原）が粒子に担持さ
   れていることを特徴とする請求項１に記載の免疫測定方
   法。
3. 【請求項３】 前記試薬をｎ回に分割して添加するにあ
   たり、ｉ回目（ｉは２〜ｎの整数）の試薬に含まれる抗
   体（または抗原）添加量を、（ｉ−１）回目の試薬に含
   まれる抗体（または抗原）添加量よりも多くすることを
   特徴とする請求項１または２に記載の免疫測定方法。