CN102869991A - 抗梅毒螺旋体抗体测定试剂 - Google Patents

抗梅毒螺旋体抗体测定试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供高灵敏度且高特异性地测定抗梅毒螺旋体抗体的使用了多肽抗原的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂以及利用该抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的测定方法。一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其特征在于，在利用了抗原抗体反应的、用于测定抗梅毒螺旋体抗体的试剂中，将至少包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D而不包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域A1的重组多肽用作抗原。

Description

抗梅毒螺旋体抗体测定试剂
技术领域
本发明涉及灵敏度和特异性高的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂以及使用该抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的测定方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体菌（梅毒螺旋体，Treponema Pallidum）的感染引起的疾病。由于开发出了青霉素等有效的治疗药，梅毒的患病率在1940年以后减少，但近年来再次显示增加的趋势。作为近年来的梅毒新患病患者的特征，可举出大多并发HIV感染病这一点。作为高并发率的原因，认为梅毒、HIV均为性感染病，并且梅毒提高HIV感染风险。在这样的状况下，为了防止扩大梅毒和HIV的感染，要求早期发现并治疗梅毒患者。
是否患有梅毒是通过在免疫学上检查血液中是否存在抗梅毒螺旋体抗体来进行诊断的。在梅毒螺旋体菌体的菌体表面存在大量的表面抗原，通过利用该表面抗原与样品中的抗梅毒螺旋体抗体的抗原抗体反应而进行免疫测定。作为在梅毒螺旋体菌体的菌体表面存在的表面抗原中的主要抗原，已知有分子量为47kDa、42kDa、37kDa、17kDa和15kDa的抗原。
现在，作为用于梅毒诊断的梅毒螺旋体菌体的表面抗原，利用如下得到的抗原：在家兔睾丸中培养梅毒螺旋体菌，用表面活性剂等进行增溶溶解、提取，进而用各种方法进行不溶物除去、必要成分的纯化。这样制备的来自梅毒螺旋体菌的抗原由于与抗梅毒螺旋体抗体的特异性高，能够早期发现梅毒患者。但是，在如上所述的使用了家兔的抗原制造方法中，由于将家兔睾丸作为宿主，所以产量受到限制，而且梅毒螺旋体菌的增殖状态存在家兔个体差异，难以确保大量稳定的产量。应予说明，目前，直接人工培养梅毒螺旋体菌未获得成功。
近年来，提出了利用了基因重组技术的梅毒螺旋体菌的菌体表面抗原的制造方法。对于梅毒47kDa抗原，克隆了编码的基因，确定了由415个氨基酸构成的氨基酸序列（例如，非专利文献1、非专利文献3）。另外，关于其晶体结构、生物学作用也进行了报告，已知A、B、C和D这4个结构域结构（例如，非专利文献2、非专利文献3）。
根据非专利文献3，从氨基酸序列的N末端开始数，结构域A由第1～34个（A1结构域）和第157～207个（A2结构域）构成，结构域B由第35～156个构成，结构域C由第208～335个构成，结构域D由第336～415个构成（参照非专利文献3、图1）。
进而，关于上述47kDa抗原的抗体识别部位，还报告了显示抗原活性的氨基酸序列（例如，非专利文献4）。
作为使用了上述抗原的抗梅毒螺旋体抗体测定方法，公开了利用基因重组技术制作梅毒47kDa抗原并利用该梅毒47kDa抗原在免疫学上测定抗梅毒螺旋体抗体的方法（参照专利文献1）。另外，还公开了使用在15kDa和17kDa的抗原的N末端融合有谷胱甘肽-S-转移酶的蛋白质的方法（参照专利文献2）。
另一方面，除了利用基因重组技术的抗原制作以外，关于47kDa抗原，还公开了通过合成具有抗原活性的肽并将其用作抗原而测定抗梅毒螺旋体抗体的方法（参照专利文献3）。
专利文献
专利文献1：国际公开WO1988/02403号小册子
专利文献2：日本特开平7-287017号公报
专利文献3：日本特开2001-264334号公报
非专利文献
非专利文献1：Infection and Immunity，Vol.60（4），p.1568-1576，（1992）
非专利文献2：The Journal of Biological Chemistry，Vol.277（44），p.41857-41864，（2002）
非专利文献3：NCBI（National Center for BiotechnologyInformation），MMDB ID：21051
非专利文献4：Journal of immunology，Vol.157，p.720-731，（1996）
发明内容
虽然用由这样的方法制备的梅毒螺旋体的重组抗原以及合成肽抗原也能够进行抗梅毒螺旋体抗体的测定，但是利用基因重组技术制作的梅毒螺旋体的重组抗原存在灵敏度、特异性低的问题。另外，关于合成肽抗原，除了同样的问题以外，还存在如下问题：要精度良好地测定抗梅毒螺旋体抗体，就需要组合多种肽，在操作上繁杂。
作为产生这些问题的因素，虽然详细情况还不明确，但可以考虑以下原因。即，认为利用基因重组技术制作的梅毒螺旋体的重组抗原与来自梅毒螺旋体菌的天然抗原相比，其立体结构以及脂质的修饰等存在不同。一般地，蛋白质在进行翻译后受到各种修饰。糖或者脂质的修饰等是它们中的代表性修饰，蛋白质通过受到这样的修饰而使其立体结构发生变化。另一方面，在基因重组技术中主要使用的利用大肠杆菌的表达体系中，不进行蛋白质的翻译后的修饰。蛋白质的立体结构在显示其抗原性上是重要的因素，但是利用基因重组技术制作的重组蛋白质由于不受到翻译后的修饰，所以与天然抗原相比，在立体结构上产生不同，考虑这对灵敏度、特异性带来影响的可能性。
本发明鉴于上述内容，目的在于提供高灵敏度且高特异性地测定抗梅毒螺旋体抗体的使用了多肽抗原的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂以及使用该抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的测定方法。
因此，本发明的发明人着眼于属于梅毒螺旋体菌体表面抗原的分子量47kDa抗原，利用基因重组技术制作该47kDa抗原及其一部分的多肽，并研究了使用其的抗梅毒螺旋体抗体试剂系中的灵敏度和特异性，结果发现尽管由结构域C构成的重组多肽、以及由结构域D构成的重组多肽的各自单独几乎不反应，但对于由结构域C和D构成的重组多肽，由结构域A2、C和D构成的重组多肽，由结构域B、A2、C和D构成的重组多肽而言，与重组47kDa抗原相比，灵敏度显著提高，其灵敏度能够匹敌天然抗原，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
（1）一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其特征在于，在利用了抗原抗体反应的、用于测定抗梅毒螺旋体抗体的试剂中，将至少包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D而不包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域A1的重组多肽用作抗原。
（2）根据（1）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原为由梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D，结构域A2、C和D，或者结构域B、A2、C和D构成的重组多肽。
（3）根据（1）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原被固定于不溶性载体。
（4）根据（2）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原被固定于不溶性载体。
（5）一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，（3）所述的不溶性载体为由高分子聚合物构成的乳胶。
（6）一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，（4）所述的不溶性载体为由高分子聚合物构成的乳胶。
（7）一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用（1）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（8）一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用（2）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（9）一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用（3）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（10）一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用（4）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（11）一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用（5）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（12）一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用（6）所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
根据本发明，使用能够大量稳定地获得品质均一的抗原的重组梅毒螺旋体抗原多肽，能够高灵敏度且特异性地测定抗梅毒螺旋体抗体，能够进行更正确的梅毒诊断。
附图说明
图1表示递归PCR图像图。
图2表示表达载体构建的图像图。
图3是表示使用了各抗原时的38T.U.下的吸光度变化量的图。
图4是表示使用了各抗原时的119T.U.下的吸光度变化量的图。
图5是表示使用了各抗原时的240T.U.下的吸光度变化量的图。
具体实施方式
本发明的利用了抗原抗体反应的抗梅毒螺旋体抗体的测定试剂的特征是将至少包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D而不包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域A1的重组多肽用作抗原。
作为用于本发明的重组多肽抗原的具体例，是由属于梅毒螺旋体菌体表面抗原的47kDa抗原的一部分的结构域C和D，结构域A2、C和D，或者结构域B、A2、C和D构成的重组多肽，优选分子量小且与用来自梅毒螺旋体菌的抗原制作的试剂（Mediace（注册商标）TPLA，积水医疗公司制）相关性良好的由结构域C和D构成的重组多肽，由结构域A2、C和D构成的重组多肽，进一步优选由结构域C和D构成的重组多肽。
作为上述各多肽，含有氨基酸序列中同源性为90%以上的多肽，更优选同源性为95%以上的多肽，进一步优选同源性为98%以上的多肽。
作为获得使作为上述47kDa抗原的一部分的多肽表达的DNA片段的方法，有i）由梅毒菌体通过基因的克隆、或者通过基因合成而得到47kDa抗原基因全长，用适当的限制性内切酶等将编码不需要的多肽部分的DNA片段删除后导入表达载体的方法；ii）制作梅毒菌体的cDNA库，使用适当的DNA引物，利用PCR法等扩增编码各多肽的DNA片段后，导入表达载体的方法；iii）将编码各多肽的DNA片段直接合成或者利用PCR法等而合成后导入表达载体的方法等，但不特别限定。
关于上述表达载体，也没有特别限定。例如，可举出质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
作为表达被纳入到表达载体的各多肽抗原的宿主，可以是培养细胞、大肠杆菌等微生物，蚕等，没有特别限定，但大肠杆菌、培养细胞等是代表性宿主。
为了有效率地表达上述各多肽、或者使其表达后的纯化容易，也可以使其以与其它蛋白质（以下称为标记蛋白质）的融合蛋白质的形式表达。作为标记蛋白质，有β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽S转移酶、6×组氨酸、作为来自苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis菌）的杀虫蛋白质的Cry蛋白质（WO2010/013789中记载）等，但没有特别限定。另外，使其以融合蛋白质的形式表达后，在纯化过程中不需要一定除去标记蛋白质，可以直接使用。
本发明的免疫学测定试剂没有用特别限定，例如，能够使用免疫凝集、酶免疫测定（EIA）、荧光免疫测定（FIA）、免疫层析等，优选用于使上述抗原担载于不溶性载体的免疫凝集的方法。
上述不溶性载体没有特别限定，例如，可举出有机高分子粉末、微生物、血球、细胞膜片等。其中，优选有机高分子粉末。作为上述有机高分子粉末，例如，可举出天然高分子粉末、合成高分子粉末等。作为上述天然高分子粉末，例如，可举出不溶性琼脂糖、纤维素、不溶性葡聚糖等。作为上述合成高分子粉末，例如，可举出聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸（盐）共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物等。
另外，上述不溶性载体可以使用在表面导入有磺酸基、羧基、氨基等的不溶性载体。
作为上述不溶性载体，特别优选使合成高分子粉末均匀地悬浮的乳胶粒子。此外，还可以使用塑料制微量滴定板；动物的红血球、细菌细胞等生物学粒子；膨润土、火棉胶、胆固醇结晶、二氧化硅、高岭土、碳粉等非生物学粒子等。
上述乳胶粒子的粒径没有特别限定，但在用电子显微镜的测定中，优选的下限为0.05μm、优选的上限为1.5μm。若上述乳胶粒子的粒径小于0.05μm，则有时由凝集所致的光学变化量小，得不到测定所必需的高灵敏度。若上述乳胶粒子的粒径超过1.5μm，则有时由乳胶粒子的凝集所致的光学变化量超过可测定区域，测定范围变小。上述乳胶粒子的粒径的优选的下限为0.1μm、更优选的上限为0.8μm。
作为使上述梅毒螺旋体重组抗原固定于上述不溶性载体的方法，没有特别限定，可以使用通过物理或化学结合而使之担载的现有公知的方法。作为物理性吸附的方法，例如，可以通过在一定条件下混合重组抗原与不溶性载体而使之担载。进而，在上述固定工序后，也可以用白蛋白、酪蛋白、表面活性剂等免疫学非活性物质来被覆不溶性载体，优选使用白蛋白。
上述白蛋白没有特别限定，可使用存在于动物血液中的白蛋白。作为动物种类，可举出牛、马、兔子、山羊和人等。在上述被覆工序中，白蛋白的浓度没有特别限定，优选的下限为0.01重量%，优选的上限为10重量%。若上述白蛋白的浓度小于0.01重量%，则不溶性载体表面未被充分被覆，因此发生非特异性凝集，若多于10重量%，则校正曲线灵敏度反而降低，因此更优选0.1～5重量%。
作为用非活性物质被覆上述不溶性载体的方法，例如，可通过使重组抗原担载于不溶性载体后，在一定条件下混合非活性物质而进行被覆。另外，反应时的pH没有特别限定，优选的下限为2，优选的上限为12。若上述pH小于2、或者高于12，则产生重组抗原发生变性等问题，因此更优选pH4～10。反应时的温度没有特别限定，优选的下限为2℃，优选的上限为50℃。就上述温度而言，若小于2℃，则不能充分反应，或者反应体系冷冻，难以得到具有必要灵敏度的载体，若高于50℃，则产生重组抗原发生变性等问题，因此更优选2～10℃。
这样得到的担载有重组抗原的载体没有特别限定，但使之悬浮于含有免疫学非活性的物质的缓冲液中。作为免疫学非活性的物质，没有特别限定，可以使用白蛋白、酪蛋白、表面活性剂（合成高分子化合物）、合成磷脂质、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等，优选白蛋白、合成磷脂质。
在担载于上述不溶性载体的工序、进一步利用非活性物质进行被覆的工序、以及使担载有抗原的载体悬浮的工序中，所使用的溶剂没有特别限定，例如，可举出磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good缓冲液等。
对这样得到的担载有抗原的乳胶粒子悬浮液添加样品，使之反应一定时间。反应后，以光学测定或目视来确定利用担载于乳胶粒子的重组抗原与样品中的抗梅毒螺旋体抗体的抗原抗体反应而产生的凝集的程度，从而能够测定样品中的抗梅毒螺旋体抗体量。
作为光学测定上述凝集程度的方法，没有特别限定，可使用公知的方法，例如，可举出以浊度增加的方式捕获凝集形成的比浊法、以粒度分布或者平均粒径变化的方式捕获凝集形成的方法、用积分球测定由凝集形成所致的前方散射光的变化并比较与透射光强度之比的积分球光度浊度法等。另外，还可以并用这些方法。
在上述测定法中，可以利用在不同时刻至少得到2个测定值并基于这些时刻间的测定值的增加速度求出凝集程度的速度试验（速度分析），或者在某一时刻（通常为被认为是反应终点的时刻）得到1个测定值并基于该测定值求出凝集程度的终点试验（终点分析）。从测定的简便性、迅速性方面考虑，优选进行利用比浊法的速度试验。
进行上述测定时的光波长优选250～1000nm，更优选540～800nm。
用于上述光学测定方法的装置可举出能够检测散射光强度、透射光强度、吸光度等的光学装置，只要是通常使用的生物化学自动分析装置，就可以使用任意装置。
以目视观察上述凝集程度的方法通常可以使用在判定板上混合含有样品和乳胶粒子悬浮液的溶液，摇动混合液后，判定有无凝集的方法等。应予说明，对于凝集程度的观察，除了利用目视的方法以外，还可以使用用摄像机等拍摄凝集状态并实施图像处理的方法。
作为上述样品，只要是有存在抗螺旋体抗体的可能性的样品，就没有特别限定，例如，可举出人或者动物的血液、血浆、血清等。
作为进行上述抗原抗体反应时的反应体系的反应液，只要是满足能够引起抗原抗体反应的生理条件的水溶液，就没有特别限定，例如，可举出磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、Good缓冲液等。反应液的pH优选4～10，更优选6～8。
在上述反应液中可以进一步根据需要添加牛血清白蛋白、蔗糖等稳定剂，叠氮化钠等防腐剂，氯化钠等盐浓度调节剂等。
反应温度只要是能够引起上述免疫反应的温度就没有特别限定，优选以恒温在10～50℃的范围内进行，更优选30～40℃。反应时间可适当决定。
实施例
用比较例和实施例说明本发明，但本发明不限于此。
（用于制备TpN47基因的引物）
将为了制备TpN47基因而使用的引物（用DNA合成装置合成）示于表1。应予说明，在表1所示的碱基序列中，下划线部表示向载体进行亚克隆所必需的限制性内切酶位点。
[表1]
在TpN47基因的制作中使用的引物
Figure BDA00002206952100101
（TpN47基因的人工制备）
TpN47基因是以数据库上的碱基序列为参考（GenBnak AE000520）利用递归（recursive）PCR而合成的。即，使用在一端具有相互互补的序列的引物对TpN47＿1f和TpN47＿2r，利用PCR制作DNA片段，使用该DNA片段和在互补的序列的末端具有的一系列引物对TpN47＿3f、TpN47＿4r、TpN47＿5f，TpN47＿6r、TpN47＿7f，TpN47＿8r、TpN47_9f，TpN47_10r、TpN47_11f、TpN47_12r、TpN47_13f、TpN47＿14r、TpN47＿15f、TpN47＿16r、TpN47＿17f、TpN47＿18r、TpN47＿19f、TpN47＿20r、TpN47＿21f、TpN47＿22r、TpN47＿23f和TpN47＿24r，制作编码TpN47基因的整体的DNA。将递归（recursive）PCR的图像图示于图1。
（TpN47抗原表达用载体的构建）
将制备的TpN47基因连接于pBluscript II SK（＋）（Stratagene公司制）的SmaI位点，利用钙法将其向大肠杆菌DH5α（Takara Bio公司制）转化。利用钙法的转化方法如下。将大肠杆菌DH5α的一晚培养液0.1mL接种到5mL的LB培养基（表2记载）中，于37℃振荡培养至浊度达到0.5。将1mL利用离心分离进行集菌，使之悬浮于0.5mL冰冷的50mM CaCl2，在冰上静置30分钟。量取0.2mL悬浮液，添加连接后的质粒DNA，在冰上放置30分钟后，在42℃施加30秒热激，添加（总量1mL）SOB培养基（表2记载）0.8mL。于37℃培养1小时后，在含有异丙基-β-吡喃半乳糖苷（以下称为IPTG）（NACALAITESQUE公司制）、5-氯-4-溴-3-D-半乳糖（以下称为X-gal）（NACALAITESQUE公司制）和100μg/mL氨苄青霉素（和光纯药公司制）的LB琼脂培养基（表2记载）中展开，于37℃培养一夜。利用蓝白筛选选择单一菌落，接种于含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基（表2记载）2mL并培养一晚。将培养的大肠杆菌利用FavorPrep质粒DNA提取试剂盒（FavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit，FAVORGEN BIOTECH CORP公司制）提取质粒DNA。将提取的质粒利用限制性内切酶处理和序列分析进行碱基序列的确认。
确认为正确的碱基序列后，将TpN47基因导入从作为市售载体的pGEX-4T-3（GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司制）利用一日诱变（One day mutagenesis）法删除GST基因而得到的pΔGST的BamHI和XhoI位点，构建pΔGST-TpN47。构建向该pΔGST-TpN47的BamHI位点导入有作为WO2010/013789记载的来自苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）的Cry蛋白质的氨基酸序列的一部分的4AaCter（696-851）（序列号42：以下称为Tag）的pΔGST-Tag-TpN47。具体而言，最初利用递归（recursive）PCR制作编码Tag的基因。编码Tag的基因以在5’末端附加BamHI位点、以及在3’末端附加编码连接序列的碱基序列和BamHI位点的方式制作。将制作的编码Tag的基因插入pBluscript II SK（＋）的SmaI位点，进行克隆，利用序列解析确认为正确的碱基序列。接着由pBluscript II SK（＋）利用BamHI切出编码Tag的基因，插入pΔGST-TpN47的BamHI位点，构建pΔGST-Tag-TpN47。将表达载体构建的图像图示于图2。将构建的pΔGST-Tag-TpN47导入大肠杆菌BL21（Takara Bio公司制）而进行转化。转化方法如上所述。
[表2]
*1)LB培养基组成(1L)
定容(mess up)后高压灭菌
*2)LB琼脂培养基组成(1L)
Figure BDA00002206952100122
定容后高压灭菌
*3)SOB培养基组成(1L)
定容后高压灭菌，溶液冷却后，加入5mL的2M氯化镁
(KISHIDA CHEMICAL公司制)
*4)TB培养基组成(1L)
·A液
·B液
Figure BDA00002206952100125
将A液、B液分别高压灭菌，溶液冷却后，混合
（TpN47的表达）
将导入了pΔGST-Tag-TpN47表达载体的大肠杆菌BL21用加入了终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基5mL预培养一晚。将该一晚培养液的0.5mL加入到50mL的添加有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中。培养是利用振荡培养机（SANYO公司制，MIR-S100），在240rpm、37℃下培养至OD600达到0.6～0.8。向培养液以最终浓度达到0.5mM的方式加入IPTG。进一步培养3小时（240rpm，37℃），诱导表达。
（TpN47的纯化）
回收表达诱导的菌体后，使之在10mL的10mM磷酸缓冲食盐水（10mM磷酸缓冲液（pH7.4），NaCl 0.9重量%）中进行悬浮，超声波破碎，以9000rpm离心10分钟，得到不溶性组分。将含有目标蛋白质的不溶性组分以适当量的超纯水离心清洗，将沉淀利用尿素溶液（8MUrea，20mM Tris-HCl，pH8.0）进行增溶溶解，将其作为目标蛋白质溶液（浓度：4mM）。
（用于制备多肽1-8基因的引物）
将用于制备与序列号34～41记载的多肽1-8对应的基因的引物（用DNA合成装置合成）示于表3。
[表3]
TpN47缺失变异体的制作中使用的引物
  名称   序列(5′→3’)   长度
  PP-Bam_3’   GGATCCCGGACCCTGGAAC(序列号25)   19
  r47_2F   GGTAATGCCGAAGCCGATCGC(序列号26)   21
  r47_3R   CTTCATACCGTGAACTTTTAC(序列号27)   21
  r47_3．5F   TTTGTCCGAGTTGCGGTTCC(序列号28)   20
  r47_4R   TTGCATCGAGCTTACTTTACG(序列号29)   21
  r47_5F   AGCCCGCACGACCTTGT(序列号30)   17
  r47_6R   GTATTTCGGCAGGAAGCGCAC(序列号31)   21
  r47_7F   GAAGGGAACATCGATATTGG(序列号32)   20
  pGEX_TAA-Xho 5’   TAACTCGAGCGGCCGCATC(序列号33)   19
（多肽1-8基因的人工制备）
多肽1-8的基因利用将pΔGST-Tag-TpN47作为模板的一日诱变法。即以夹持需要从pΔGST-Tag-TpN47删除的部分的形式设计引物，朝向各个载体的外侧地利用PCR反应来扩增DNA，制成编码各多肽的DNA。制作各多肽时的引物对按照表4。多肽1～8的碱基序列分别如序列号34～41所示。
[表4]
Figure BDA00002206952100141
（多肽1-8表达用载体的构建）
在上述PCR产物中加入T4DNA连接酶（Takara Bio公司制）和10X连接缓冲液（Takara Bio公司制）进行自身连接。在该连接溶液中加入限制性内切酶DpnI（东洋纺公司制），于37℃孵育1小时。插入到大肠杆菌以后，与TpN47的载体构建同样地进行。
（多肽1-8的表达）
除了使用各多肽的表达载体以外，按照TpN47的表达进行。
（多肽1-8的纯化）
除了使用使多肽1-8表达诱导的菌体以外，按照TpN47的纯化进行。
（乳胶粒子的制作）
在具备搅拌器、回流用冷凝器、温度检测器、氮导入管和护套的玻璃制反应容器（容量2L）中加入蒸馏水1100g、苯乙烯200g、苯乙烯磺酸钠0.2g、和在蒸馏水50g中溶解过硫酸钾1.5g而得到的水溶液，将容器内用氮气置换后，一边于70℃搅拌，一边进行48小时聚合。
聚合结束后，将上述溶液用滤纸进行过滤处理，取出乳胶粒子。得到的乳胶粒子的粒径是通过用透射型电子显微镜装置（日本电子公司制，“JEM-1010型”）以10000倍的倍率拍摄乳胶粒子并对于最低100个以上的粒子进行图像解析而测定平均粒径的。得到的平均粒径为0.4μm。
（抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的制备）
（实施例1）
在平均粒径为0.4μm的乳胶溶液（固体成分10%（w／v））100μL中添加100μL（0.4μmol）的溶解于20mM的Tris缓冲液（以下称为Tris-HCl，pH8.0）中的多肽1（4mM），于4℃搅拌1小时。接着，添加含有1%（W／V）牛血清白蛋白（以下称为BSA，Fraction V，试剂级，Miles Corp.公司制）的Tris盐酸缓冲食盐水（20mM Tris-HCl，食盐浓度0.9重量%，pH8.0）1mL，搅拌1小时。将得到的液体于10℃以15000rpm离心分离15分钟，在得到的沉淀物中添加含有1（w／v）%BSA的100mM磷酸缓冲液（pH7.5）溶液20mL，使乳胶悬浮，从而制备抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（实施例2）
将多肽2溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（实施例3）
将多肽3溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（比较例1）
将纯化的TpN47溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（比较例2）
将多肽4溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（比较例3）
将多肽5溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（比较例4）
将多肽6溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（比较例5）
将多肽7溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（比较例6）
将多肽8溶液用作抗原液，除此以外，与实施例1同样进行而制备了抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
（测定）
使用在实施例1～3、比较例1～6中制备的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，利用下述方法进行测定。
（1）抗梅毒螺旋体抗体标准液的测定
作为抗梅毒螺旋体抗体标准液，采集梅毒阳性标准血清（积水医疗公司制，5个浓度，单位：T.U.＊）15μL，向其中混合样品稀释液（在含有1%的BSA的100mM磷酸缓冲液（pH7.4）中添加Lipidure（日油公司制：Lipidure-BL）0.8（w／v）%而成的）100μL，于37℃适时保持。向其中添加抗梅毒螺旋体抗体测定试剂100μL并进行搅拌后，测定在约80秒至300秒之间的波长700nm下的吸光度的变化量，作为吸光度变化量（ΔAbs）。应予说明，测定使用自动分析装置7170型。
将结果示于表5和图3～图5。如表5、图3～图5所示，可知在实施例中制备的试剂的反应性高。
＊T.U.是利用Mediace（注册商标）TPLA（积水医疗公司制）测定的抗螺旋体抗体效价的单位TITER UNITS的简称，测定国际标准品时，1T.U.为2mIU。
[表5]
各结构域的灵敏度比较
Figure BDA00002206952100171
△Abs
（2）阳性样品测定
将被判定为梅毒阳性的血清样品（10T.U，以上）作为样品，除此以外，与（1）同样进行而求出吸光度变化量（ΔAbs），由基于（1）的标准品测定结果而制成的校正曲线算出抗体效价。求出在实施例和比较例中制备的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂中的抗体效价与市售品试剂（积水医疗公司制，Mediace（注册商标）TPLA）的抗体效价的相关性。将结果示于表6（x：市售品试剂，y：实施例1～3和比较例1中制备的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂）。可知，在实施例中制备的试剂与现有的试剂的相关性良好。
[表6]
相关性试验
  实施例1   实施例2   实施例3   比较例1
  肽   多肽1   多肽2   多肽3   TpN47
  结构域   CD   A2CD   BA2CD   A1BA2CD
  回归式   y=0．95x+2.71   y=0．90x+1.85   y=0．92x+14．0   y=0．93x+24．8
  相关系数   0．965   0．958   0．886   0．798
x：Mediace TPA，y：实施例和比较例制备试剂
（3）阴性样品测定
将判定为梅毒阴性的血清样品（0T.U.）作为样品，除此以外，与（1）同样进行而求出吸光度变化量（ΔAbs），由基于（1）的标准品测定结果制成的校正曲线算出抗体效价。
将结果示于表7。在该测定方法中，将10T.U.以上判定为阳性。在比较例1中，发现非特异反应大多为假阳性，与此相对，在实施例1～3中，几乎没有非特异反应，没有发现假阳性。
[表7]
阴性样品测定
Figure BDA00002206952100181
T.U.
产业上的可利用性
若使用本发明的重组抗原，则可以提供灵敏度、特异性高的能够测定抗梅毒螺旋体抗体的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
Figure IDA00002206952700011
Figure IDA00002206952700021
Figure IDA00002206952700041
Figure IDA00002206952700061
Figure IDA00002206952700081
Figure IDA00002206952700091

Claims (12)

1.一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其特征在于，在利用了抗原抗体反应的、用于测定抗梅毒螺旋体抗体的试剂中，将至少包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D而不包含梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域A1的重组多肽用作抗原。
2.根据权利要求1所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原为由梅毒螺旋体47kDa抗原中的结构域C和D，结构域A2、C和D，或者结构域B、A2、C和D构成的重组多肽。
3.根据权利要求1所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原被固定于不溶性载体。
4.根据权利要求2所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，抗原被固定于不溶性载体。
5.一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，权利要求3所述的不溶性载体为由高分子聚合物构成的乳胶。
6.一种抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，权利要求4所述的不溶性载体为由高分子聚合物构成的乳胶。
7.一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用权利要求1所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
8.一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用权利要求2所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
9.一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用权利要求3所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
10.一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用权利要求4所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
11.一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用权利要求5所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
12.一种抗梅毒螺旋体抗体测定方法，其特征在于，使用权利要求6所述的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。
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