CN1298863C - 采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法，其特点是以表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与待测样品培育，当样品中含有结核杆菌时，纳米颗粒表面固定的结核杆菌抗体与结核杆菌细胞壁表面抗原发生高特异性的免疫反应而形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物，通过离心作用将荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物与游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒分开，将荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物涂片后即可在荧光显微镜下观察到复合物的荧光，实现对结核杆菌的快速、准确检测。该方法结合了免疫反应高特异性、快速的特点和荧光纳米颗粒的信号放大作用，简化了检测步骤、缩短了检测时间、提高了方法的敏感度及减小了假阳性率。
Description
技术领域：
本发明涉及一种结核病的实验室诊断方法，具体涉及一种对结核杆菌进行快速、准确检测的方法。
背景技术：
结核病是全球传染病的首要杀手，近年来发病率有上升的趋势；而结核分枝杆菌则是引起人类结核病的主要病原体，结核杆菌的检测不仅是诊断结核病的主要依据，还是考核疗效、随访病情的重要指标。目前，结核病的实验室诊断方法主要有三类：细菌学方法、分子生物学方法、免疫学方法。细菌学方法包括涂片抗酸染色和结核分枝杆菌培养等方法，是医院检查结核杆菌最常用的方法。涂片抗酸染色法快速简便，但敏感度很低，阳性率低于50％，不但与病人的排菌量有关，而且很大程度上依赖于化验工作者的个人技能和经验；改良罗氏培养基培养法精确可靠、特异性高，但相当费时，通常需4～8周才能报告；近年来一些结核杆菌快速培养兼鉴定系统陆续推出并得以应用，如BACTEC系列，极大地缩短了培养时间，但仍需数日，另外该培养基试剂完全依赖进口，成本高导致检查费用昂贵。分子生物学方法包括聚合酶链反应(PCR)法及核酸探针技术等。PCR法灵敏度很高，但容易发生污染，出现假阳性、假阴性现象；核酸探针技术的灵敏度和特异性尚不十分理想。基于血清学诊断的免疫学方法有酶联免疫吸附分析(ELISA)、乳胶凝集等，当处于结核病高发地区，阳性结果并不代表一定患结核病，仅说明过去曾受过结核杆菌的感染。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是利用荧光纳米颗粒快速、准确地检测结核杆菌，以改进现有结核病实验室诊断方法或需时太长或准确性低或操作步骤繁琐的问题。
本发明解决上述技术问题采用下述技术方案。一种采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法，其特征在于：以表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与待测样品培育，当样品中含有结核杆菌时，纳米颗粒表面固定的结核杆菌抗体与结核杆菌细胞壁表面抗原发生高特异性的免疫反应而形成“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”，通过离心作用将“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”与游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒分开，将“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”涂片后即可在荧光显微镜下观察到复合物的荧光，从而实现对结核杆菌的快速、准确检测，整个检测过程可在1小时之内完成。
作为本发明的进一步改进，其特征在于具体检测步骤为：
(1)荧光纳米颗粒对结核杆菌的识别：利用以结核杆菌细胞壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与待测样品的磷酸盐缓冲液PBS悬浮液在37℃培育0.5-2h，当样品中含有结核杆菌时，结核杆菌细胞壁就会结合上大量荧光纳米颗粒，形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物；
(2)荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物与游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒的分离：利用荧光纳米颗粒与荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物之间大小和重量的差异，通过离心使荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物沉淀，而游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒处于上清中，弃去上清；
(3)荧光显微镜下观察荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物：在荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物沉淀中加入无菌水，将沉淀物分散后，涂片，置于荧光显微镜下观察，以蓝光激发，被荧光纳米颗粒识别的结核杆菌发橙红色的荧光。
本发明的方法结合了免疫反应高特异性、快速的特点和荧光纳米颗粒的信号放大作用(即高敏感性)，简化了检测步骤、缩短了检测时间、提高了方法的敏感度以及减小了假阳性率；与抗酸染色法相比，本法结合了荧光纳米颗粒的高敏感性和结核杆菌抗体的高特异性，可以提高检测方法的敏感性以及减小假阳性现象；本法不需要对细菌进行培养，与各种培养法相比，极大地缩短了检测的时间；与聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附分析(ELISA)等方法相比，操作更简单、步骤更少、耗时更省，检测快速、准确。
附图说明：
图1为结核杆菌与大肠杆菌分别与表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒培育后在激光共聚焦显微镜下的成像图。
图中A-结核杆菌的光学成像图
B-被修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒识别的结核杆菌的荧光成像图
C-大肠杆菌的光学成像图
D-大肠杆菌与修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒培育后的荧光成像图
图2为修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒对混和细菌样品中结核杆菌识别的成像图。
大肠杆菌用异硫氰酸荧光素(FITC)染色后与未染色的结核杆菌混合，再与修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒共培育，离心弃去游离的纳米颗粒，涂片后在激光共聚焦显微镜下观察。
图中A-激光共聚焦显微镜绿色通道所采集到的荧光，是大肠杆菌细胞壁上所结合的异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光
B-激光共聚焦显微镜红色通道所采集到的荧光，是结合在结核杆菌细胞壁上的荧光纳米颗粒所发出的荧光
C-激光共聚焦显微镜绿色通道与红色通道的叠加
D-激光共聚焦显微镜透射光成像图
图3为修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒对混和细菌样品中结核杆菌识别的成像图。
大肠杆菌用异硫氰酸荧光素(FITC)染色后与未染色的结核杆菌混合，再与修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒共培育，离心弃去游离的纳米颗粒，涂片后在荧光显微镜下观察。
图中A-蓝光激发下的荧光成像图，其中打圆圈的为大肠杆菌，由于细胞壁上结合了异硫氰酸荧光素(FITC)而发绿色荧光，未打圆圈的为结核杆菌，由于细胞壁上结合了荧光纳米颗粒而发橙红色荧光
B-混和细菌的光学成像图
如图1所示：结核杆菌与表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒培育后形成“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”而发荧光，但大肠杆菌与表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒培育后无荧光，说明修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒对结核杆菌的识别是特异性的，对大肠杆菌的非特异性小，这有利于减小假阳性率。
如图2和图3所示：表明利用修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒能将混和细菌样品中的结核杆菌特异性地检测出来。
具体实施方式
实施例一，采用荧光纳米颗粒快速、准确检测结核杆菌：
(1)荧光纳米颗粒对结核杆菌的识别：利用以结核杆菌细胞壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与结核杆菌的磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4，0.01M)悬浮液在37℃培育0.5-2h，结核杆菌细胞壁上就会结合上大量荧光纳米颗粒，形成“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”。
(2)“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”与游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒的分离：利用荧光纳米颗粒与“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”之间大小和重量的差异，通过离心使“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”沉淀而游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒处于上清中，弃去上清；如在4000rpm下离心5min，将上清弃去后，重新分散在无菌水中，如此重复三次。
(3)荧光显微镜下观察“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”：在荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物沉淀中加入无菌水，将沉淀物分散后，涂片，置于荧光显微镜下观察，以蓝光激发，被荧光纳米颗粒识别的结核杆菌发橙红色的荧光，若在激光共聚焦显微镜下成像，可在红色通道检测到结核杆菌细胞壁上结合的纳米颗粒的荧光(参见图1的A和B激光共聚焦显微镜成像图)。
实施例二，采用荧光纳米颗粒快速、准确检测混和细菌体系(同时含有大肠杆菌和结核杆菌)中的结核杆菌：
(1)混和细菌样品的制备：由于从形态上无法区分大肠杆菌与结核杆菌，因此用异硫氰酸荧光素(FITC)标记大肠杆菌以区别于结核杆菌。在0.1mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中，大肠杆菌与0.5mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)在37℃培育2h，用0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次后，与未经任何染色的结核杆菌混和悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中形成混合细菌样品。
(2)荧光纳米颗粒与混合细菌样品共培育：将表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与混合细菌样品在37℃培育0.5-2h，纳米颗粒表面固定的结核杆菌抗体高特异性地与结核杆菌细胞壁表面抗原结合而使结核杆菌细胞壁结合上大量荧光纳米颗粒，形成“荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物”。
(3)游离荧光纳米颗粒与各细菌及“荧光纳米颗粒-细菌复合物”的分离：利用荧光纳米颗粒与细菌及“荧光纳米颗粒-细菌菌复合物”之间大小和重量的差异，通过离心使各细菌及“荧光纳米颗粒-细菌复合物”沉淀而游离荧光纳米颗粒处于上清中，弃去上清；如在4000rpm下离心5min，将上清弃去后，重新分散在无菌水中，如此重复三次。
(4)荧光显微镜下观察各细菌的荧光：在通过离心除去游离纳米颗粒的细菌及“荧光纳米颗粒-细菌复合物”沉淀中加入无菌水，将沉淀物分散后，涂片，置于荧光显微镜下观察，以蓝光激发，被荧光纳米颗粒识别的结核杆菌发橙红色的荧光而大肠杆菌发绿色荧光(参见图3)，若在激光共聚焦显微镜下成像，大肠杆菌只发异硫氰酸荧光素(FITC)的绿色荧光而没有荧光纳米颗粒的红色荧光，说明表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒对结核杆菌的识别是高特异的，对大肠杆菌的非特异性吸附小(参见图2)。
上述实施例中，所述荧光纳米颗粒用如下方法制得：将环己烷(7.5ml)、表面活性剂曲拉通Triton X-100(1.8ml)和正己醇(1.8ml)(体积比为4.2∶1∶1)，混合均匀，加入H2O(400μl)作为分散相，搅拌5分钟后形成反相微乳液，加入0.1mol/L联吡啶钌配合物的水溶液(50μl)，搅拌均匀后加入正硅酸乙酯(200μl)和氨水(200μl)，反应24h后加入丙酮破乳，离心收集纳米颗粒，依次用丙酮、乙醇、水洗涤反应后的纳米颗粒，由此可制得以荧光物质联吡啶钌配合物Ru(BPY)3为内核的二氧化硅荧光纳米颗粒。
所述的表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒用以下方法制得：将荧光纳米颗粒经高压灭菌后悬浮于经0.22μm滤膜除菌的2ml 2mol/L Na2CO3中，超声10-15min，在剧烈的磁搅拌下将2ml CNBr/乙腈液(0.2g CNBr/每毫升乙腈)逐滴滴至纳米颗粒悬浮液中，反应10min，加入30ml无菌冰水终止反应，分别用无菌冰水和无菌冷磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4，0.01M)各洗三次，最后悬浮在1ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入结核杆菌抗体，4℃轻微振荡过夜，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次后，加入pH8.0，1mol/L无菌乙醇胺，4℃轻微振荡16h以封闭反应，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次，制得修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒，贮存于4℃备用。
Claims (4)
1、一种采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法，其特征在于：以表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与待测样品培育，当样品中含有结核杆菌时，纳米颗粒表面固定的结核杆菌抗体与结核杆菌细胞壁表面抗原发生高特异性的免疫反应而形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物，通过离心作用将荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物与游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒分开，将荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物涂片后即可在荧光显微镜下观察到复合物的荧光，实现对结核杆菌的快速、准确检测。
2、根据权利要求1所述的采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法，其特征在于其具体检测步骤为：
(1)荧光纳米颗粒对结核杆菌的识别：利用以结核杆菌细胞壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒与待测样品的磷酸盐缓冲液PBS悬浮液在37℃培育0.5-2h，当样品中含有结核杆菌时，结核杆菌细胞壁就会结合上大量荧光纳米颗粒，形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物；
(2)荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物与游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒的分离：利用荧光纳米颗粒与荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物之间大小和重量的差异，通过离心使荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物沉淀，而游离的未与结核杆菌结合的荧光纳米颗粒处于上清中，弃去上清；
(3)荧光显微镜下观察荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物：在荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物沉淀中加入无菌水，将沉淀物分散后，涂片，置于荧光显微镜下观察，以蓝光激发，被荧光纳米颗粒识别的结核杆菌发橙红色的荧光。
3、根据权利要求1或2所述的采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法，其特征在于所述荧光纳米颗粒用如下方法制得：按4.2∶1∶1的体积比，将环己烷7.5ml、表面活性剂曲拉通Triton X-100 1.8ml和正己醇1.8ml混合均匀，加入400μl H2O作为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液，加入50μl 0.1mol/L联吡啶钌配合物的水溶液，搅拌均匀后加入200μl正硅酸乙酯和200μl氨水，反应24h后加入丙酮破乳，离心收集纳米颗粒，依次用丙酮、乙醇、水洗涤反应后的纳米颗粒，由此可制得以荧光物质联吡啶钌配合物Ru(BPY)3为内核的二氧化硅荧光纳米颗粒。
4、根据权利要求1或2所述的采用荧光纳米颗粒检测结核杆菌的方法，其特征在于所述的表面修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒用以下方法制得：将荧光纳米颗粒经高压灭菌后悬浮于经0.22μm滤膜过滤除菌的2ml 2mol/L碳酸钠Na2CO3中，超声10-15min，在剧烈的磁搅拌下将2ml 0.2g/ml溴化氰CNBr/乙腈液反应逐滴滴至纳米颗粒悬浮液中，反应10min，加入30ml无菌冰水终止反应，分别用无菌冰水和pH7.4，0.01mol/L无菌冷磷酸盐缓冲液PBS各洗三次，最后悬浮在1ml无菌磷酸盐缓冲液PBS中，加入结核杆菌抗体，4℃轻微振荡过夜，用无菌磷酸盐缓冲液PBS洗两次后，加入pH8.0，1mol/L无菌乙醇胺，4℃轻微振荡16h以封闭反应，用无菌磷酸盐缓冲液PBS洗三次，制得修饰了结核杆菌抗体的荧光纳米颗粒，贮存于4℃备用。
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