JPWO2009123060A1 - 精製血清アルブミン及び免疫学的測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、近年、血液中の癌マーカー、ウイルス等の抗原、細菌やウイルスに対する抗体等の極微量成分を測定するニーズが高まってきており、免疫学的測定方法の更なる高感度化が強く求められるようになってきた。
一方、特許文献2、3に記載された方法では、非特異的な反応を防止するためのブロッキング剤として血清由来のアルブミンを用いることが一般的である。しかしながら、血清アルブミンは、ロット差により反応性が大きく異なったり、充分に効果が得られなかったりすることがあるという問題があった。
本発明2は、免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmol以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンである。
以下に本発明を詳述する。
血清アルブミンのこのような画分は、ビリルビン(黄色色素成分、吸収波長438nm(BSA結合型ビリルビンの吸収波長は463nm))等の吸着が極めて少ない画分であり、このような画分を主成分とする本発明の精製血清アルブミンをブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液に用いた場合には、ロット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
なお、主成分とするとは、上記画分のみからなることが好ましいものの、本発明の目的効果を阻害しない範囲においては、他の画分が混入してもかまわないことを意味する。
例えば、1%水溶液としたときに光路長が1.0cmの石英セルを用い463nmの波長にて測定した吸光度が9.0mAbsを超えて13.5mAbs以下である画分の場合には、全体の45重量%程度まで混入可能である。
例えば、1%水溶液としたときに光路長が1.0cmの石英セルを用い463nmの波長にて測定した吸光度が9.0mAbsを超えて20.0mAbs以下である画分の場合には、全体の15重量%程度まで混入可能である。
例えば、1%水溶液としたときに光路長が1.0cmの石英セルを用い463nmの波長にて測定した吸光度が9.0mAbsを超えて26.0mAbs以下である画分の場合には、全体の5重量%程度まで混入可能である。
なお、主成分とするとは、上記画分のみからなることが好ましいものの、本発明の目的効果を阻害しない範囲においては、他の画分が混入してもかまわないことを意味する。
例えば、1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmolを超えて1.5mmol以下である画分の場合には、全体の45重量%程度まで混入可能である。
例えば、1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmolを超えて2.0mmol以下である画分の場合には、全体の15重量%程度まで混入可能である。
例えば、1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmolを超えて2.7mmol以下である画分の場合には、全体の5重量%程度まで混入可能である。
また、上記血清アルブミンは、陰イオン交換クロマトグラフィー精製を行う前に、コーン変法やヒートショック法等で粗精製されていることが好ましい。
上記緩衝液の濃度は、通常5〜150mMの範囲で用いられる。
上記緩衝液のpHは4〜9が好ましく、5〜8がより好ましい。
上記塩は特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)等が挙げられる。
上記溶出液のpHは4〜9が好ましく、5〜8がより好ましい。
ただし、通常は、結合液と同じ緩衝液に塩が加えられたものが用いられる。
まず、血清アルブミンを結合液(例えば、50mMTris−HCl緩衝液(pH7.5))に添加した溶液を調製する。
次いで、該溶液を結合液で平衡化した陰イオン交換カラムに添加し、結合液を流しながら血清アルブミンを陰イオン交換カラムに吸着させる。
次いで、塩濃度が150mM以下である溶出液を流して血清アルブミンを溶出させ、精製血清アルブミンを得る。
本発明の精製血清アルブミンを免疫学的測定方法におけるブロッキング剤又は不溶性担体の懸濁液として用いれば、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
本発明の精製血清アルブミンを用いてなる免疫学的測定試薬もまた、本発明の1つである。
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液として、本発明の精製血清アルブミンを用いる免疫学的測定方法もまた、本発明の1つである。
本発明の精製血清アルブミンを主成分とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬もまた、本発明の1つである。
本発明の精製血清アルブミンをゲルろ過によって精製した単量体は、更に免疫学的測定試薬の反応性を向上するために用いられる。
本発明の免疫学的測定法の対象とする被測定物質は、例えば、生体試料中の抗原又は抗体が挙げられる。具体的には例えば、肝炎(B型、C型)由来抗原又は抗体、HIV抗原又は抗体、梅毒由来抗体、α−フェトプロテイン等の癌マーカー、インシュリン等のホルモン、オータコイド等が挙げられる。
上記抗トレポネーマ・パリダム抗体測定系に用いる抗原は、菌体破砕物であってもよく、精製物であってもよい。また、遺伝子組み換え技術により人工的に合成されたものを1種又はそれ以上組み合わせたものでもよい。
上記不溶性担体は特に限定されず、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片等が挙げられる。なかでも有機高分子粉末が好適である。
上記有機高分子粉末は特に限定されず、例えば、天然高分子粉末、合成高分子粉末等が挙げられる。
上記天然高分子粉末は特に限定されず、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が挙げられる。
上記合成高分子粉末は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸(塩)共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。
また、上記不溶性担体は、表面にスルホン酸基やカルボキシル基等を導入したものも用いることができる。
上記ラテックス粒子の粒径は特に限定されないが、好ましい下限は0.05μm、好ましい上限は1.5μmである。上記ラテックス粒子の粒径が0.05μm未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがある。上記ラテックス粒子の粒径が1.5μmを超えると、ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。上記ラテックス粒子の粒径のより好ましい下限は0.1μm、より好ましい上限は0.8μmである。
上記測定を行う際の光の波長は、300〜900nmが好ましい。
(1)精製血清アルブミンの調製
市販の牛血清アルブミン(セロロジカル社製、「Cohn Fraction V」、以下、「未精製BSA」ともいう、Lot83)を結合液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5))に添加し、15%未精製BSA溶液を調整した。
得られた15%未精製BSA溶液5mLを、結合液で平衡化した市販の陰イオン交換カラム(GE Healthcare社製、「DEAE SepharoseFF」480mL/「XK50」)に添加し、結合液を4mL/minで流しながらBSAをカラムに吸着させた。次いで、塩化ナトリウム濃度が80mMになるように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和した溶出液を、流速10mL/minで流し、80mMの塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分を得た。また、これとは別に、1分間に塩化ナトリウム濃度が2mMずつ増加するように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速10mL/minで流し、混和開始後73.3〜74.5分(塩濃度69.6〜72.0mM分画)に溶出されたアルブミン画分を得た。なお、得られたアルブミン画分の塩濃度は、カラム容量を考慮し、カラムから溶出されたアルブミン溶液中の塩化ナトリウム濃度を示した。
また、得られた精製血清アルブミンについて、ビリルビン測定試薬(積水メディカル社製、「オートセラBIL−2」、「オートセラD−BIL−2」)を用いたアゾビリルビン法により、BSA1molあたりのビリルビン結合量を測定したところ、0.1mmol、0.5mmolであった。
以下、それぞれを「精製BSA(1.3mAbs/0.1mmol)」、「精製BSA(5.1mAbs/0.5mmol)」ともいう。
100mMリン酸緩衝液(pH7.4)に150μg/mLの蛋白濃度で溶解した抗トレポネーマ・パリダム抗原液400μLを平均粒径0.4μmのポリスチレンラテックス(固形分10(w/v)%、積水化学工業社製)100μLに添加し、4℃にて1時間攪拌した。
次いで、精製BSA(5.1mAbs/0.5mmol)溶液2mLを添加し、1時間攪拌した。得られた液体を10℃にて10分間、13,000rpmで遠心分離し、得られた沈殿物を、精製BSA溶液(1.3mAbs/0.1mmol)4mLに添加し、ラテックスを懸濁させることにより抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
1分間に塩化ナトリウム濃度が2mMずつ増加するように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速10mL/minで流し、混和開始後87.7〜88.9分(塩濃度98.4〜100.8mM分画)に溶出される精製BSA(0.9mAbs/0.1mmol)溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
1分間に塩化ナトリウム濃度が2mMずつ増加するように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速10mL/minで流し、混和開始後102.1〜103.3分(塩濃度127.2〜129.6mM分画)に溶出される精製BSA(3.3mAbs/0.3mmol)溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
BSA溶液を陰イオン交換クロマト精製せずに(以下、未精製BSAという)用いたこと以外は、実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
また、未精製BSAの1%溶液について、実施例1と同様にして測定した波長463nmでの吸光度は9.8mAbs、BSA1molあたりのビリルビン結合量は、1.0mmolであった。
1分間に塩化ナトリウム濃度が2mMずつ増加するように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速10mL/minで流し、混和開始後116.5〜117.7分(塩濃度156.0〜158.4mM分画)に溶出される精製BSA(9.8mAbs/1.0mmol)溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
1分間に塩化ナトリウム濃度が2mMずつ増加するように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速10mL/minで流し、混和開始後130.9〜132.1分(塩濃度184.8〜187.2mM分画)に溶出される精製BSA(17.9mAbs/1.9mmol)溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
1分間に塩化ナトリウム濃度が2mMずつ増加するように2Mの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速10mL/minで流し、混和開始後145.3〜146.5分(塩濃度213.6〜216.0mM分画)に溶出される精製BSA(24.9mAbs/2.6mmol)溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
実施例1〜3、比較例1〜4にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清(積水メディカル社製、5濃度)15μLを採取し、これに検体希釈液(BSAを1%含有する100mMリン酸緩衝液(pH7.4)にLipidure(日油社製)を0.2(w/v)%添加したもの)150μLを混和し、37℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液50μLを添加、撹拌した後、約80秒から300秒までの間の波長700nmでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量(ΔAbs)とした。
なお、測定は自動分析装置日立7170形を使用した。
結果を表1に示した。
生理食塩水及び陰性検体1〜10を検体とした以外は(1)と同様にして吸光度変化量(ΔAbs)を求め、(1)の標準品測定結果に基づいて作成した検量線から抗体価を算出した。結果を表2に示した。
市販の牛血清アルブミンとして3種のロットのもの(Lot83、Lot91、Lot77)を準備した。これらの3種のロットの牛血清アルブミンの各々について実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
市販の牛血清アルブミンとして3種のロットのもの(Lot83、Lot91、Lot77)を未精製のまま用いたこと以外は、比較例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
実施例4、比較例5にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
なお、測定は自動分析装置日立7170形を使用した。
結果を表3に示した。
実施例1で得られた精製BSA溶液(1.3mAbs/0.1mmol)を濃縮し、市販のゲルろ過カラムSephacryl S−200HR(GE Healthcare社製)に添加し、溶離液として100mMのリン酸緩衝液(pH7.4)を用いてゲルろ過精製し、その単量体画分のみからなるBSAを用いたこと以外は実施例1と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
実施例1で得られた精製BSA溶液(1.3mAbs/0.1mmol)をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるBSAをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には実施例1で得られた精製BSA(1.3mAbs/0.1mmol)溶液を用いたこと以外は実施例5と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
実施例1で得られた精製BSA溶液(1.3mAbs/0.1mmol)をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるBSAをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には未精製BSA溶液を用いた以外は実施例5と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
実施例5〜7にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
なお、測定は自動分析装置日立7170形を使用した。
結果を表4に示した。
ブロッキング剤として表5に記載した比率で混合したBSA溶液を用いた以外は実施例1と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
参考例1〜10にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
なお、測定は自動分析装置日立7170形を使用した。
結果を表5に示した。
また、横軸を混入BSA比率、縦軸を吸光度変化量として表5の結果をプロットしたグラフを図1に示した。
Claims (8)
- 免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、1%水溶液としたときに光路長が1.0cmの石英セルを用い463nmの波長にて測定した吸光度が9.0mAbs以下である画分を主成分とすることを特徴とする精製血清アルブミン。
- 1%水溶液としたときに光路長が1.0cmの石英セルを用い463nmの波長にて測定した吸光度が9.0mAbs以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いてなることを特徴とする免疫学的測定試薬。
- 抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液に、1%水溶液としたときに光路長が1.0cmの石英セルを用い463nmの波長にて測定した吸光度が9.0mAbs以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いることを特徴とする免疫学的測定方法。
- 請求項1記載の精製血清アルブミンを主成分とすることを特徴とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬。
- 免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmol以下である画分を主成分とすることを特徴とする精製血清アルブミン。
- 1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmol以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いてなることを特徴とする免疫学的測定試薬。
- 抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び/又は不溶性担体の懸濁液に、1molあたりのビリルビン結合量が0.9mmol以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いることを特徴とする免疫学的測定方法。
- 請求項5記載の精製血清アルブミンを主成分とすることを特徴とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬。
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